中国生物化学与分子生物学报

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孔晓牧, 杨吉春, 管又飞

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 197-204.

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主要尿蛋白（MUPs）属于脂质运载蛋白家族，具有保守的中心疏水β链桶状特征性结构域，具有调节种属内与种属间个体间化学信息交流的功能.MUPs主要在肝合成并分泌入血，作为载体与信息素等亲脂性小分子结合，延长其半衰期，一并从肾过滤排泄入尿液，延缓尿迹中信息素的挥发，从而延长信息素的作用时间.啮齿类动物的MUPs本身具有高度多态性，能够发挥类似信息素的作用直接编码个体信息，调节种属内的生物活动.此外，MUPs还能够发挥利它素的功能引起其它种属的畏惧反应.新近研究发现，MUPs受到机体营养状态的调节，与代谢性疾病及糖脂代谢密切相关，但机制尚不清楚.MUPs的功能和机制探索对于化学信息交流与糖脂代谢研究具有重要意义.本文旨在对MUPs的最新研究结果展开简要综述及讨论.

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多种功能的poly(C)-结合蛋白

霍丽蓉, 王晓民

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 205-211.

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细胞内的RNA一般不会单独存在，而是与各种各样的RNA结合蛋白（RBPs）绑定在一起,形成核糖核蛋白复合体（RNP complexes）影响着RNA的加工与转归. Poly(C)结合蛋白是一类重要的RNA结合蛋白，可分为两组：hnRNP K 和PCBP14. 它们以序列特异的方式与核酸嘧啶富含区相结合. 这类蛋白具有共同的结构模体（motif），即hnRNP K 同源（KH）域. KH域是与mRNA结合的结构基础，也是机体内调控系统的组成部分，可使得Poly(C)结合蛋白参与蛋白/核酸、蛋白/蛋白之间的相互作用，范围涉及复制、转录、mRNA稳定和翻译控制过程等. 对Poly(C)结合蛋白功能的深刻认识可使我们洞察多种疾病的病理生理过程.

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脂肪细胞因子对脂肪细胞增殖分化的反馈调节作用

周艳兰, 迟毓婧, 管又飞, 杨吉春

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 212-217.

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肥胖已被证实是胰岛素抵抗、2 型糖尿病、高血压、高脂血症及冠状动脉粥样硬化性心脏病等代谢性疾病发生的重要诱因.肥胖的发生主要是由于体内脂肪细胞的异常分化和增殖，最终导致脂肪细胞异常增多及细胞内脂质过度沉积产生的.脂肪细胞的增殖分化受到多种因素的调控，其中脂肪细胞因子作为脂肪组织分泌的肽类激素，也在脂肪细胞的发育分化过程中起重要的反馈调节作用.大多数肥胖患者体内存在脂肪细胞因子分泌异常及其相应的功能紊乱.本文将对几种主要的脂肪细胞因子在脂肪细胞发育分化中的作用及最新研究进展进行简要综述及讨论.

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PKSI-AT结构域及在组合生物合成研究中的应用

焦豫良, 王梁华, 焦炳华

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 218-223.

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I型聚酮合酶（PKSI）的模块型分子结构组织方式非常适合于组合生物合成研究.结构域和模块通过二级组织方式构成了PKSI的催化单元，其它结构多肽则作为“支架”.在“支架”上对结构域和模块两个水平进行突变、替换、插入、缺失等基因操作形成重组PKS，可以理性设计并获得复杂多样的新活性或高活性的聚酮化合物.利用PKSI进行组合生物合成以期获得新聚酮化合物的研究迄今已有约25年，但是目前仍不能够对PKS进行完美的理性设计，快速合成目标活性的新聚酮化合物.PKS中的酰基转移酶结构域的研究在PKS的组合生物合成研究中一直发挥着重要作用.本文结合本课题组的研究基础，对AT结构域的结构、功能及在组合生物合成研究中的最新研究成果作以分析总结.

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PAK5在凋亡级联反应中的调节作用

谢宇, 孙新, 关新刚, 陈建光

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 224-227.

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PAK5为PAKs家族中新近发现的成员. PAKs是一类通过与Rac和Cdc42结合而激活的高度保守的蛋白酶.PAKs在细胞骨架、神经生长、激素信号传导、基因转录等生理活动中起着重要的调控作用. PAK5在大脑组织中高度表达,在细胞中定位于线粒体. PAK5 与神经生长、增强微管的稳定性以及阻止细胞凋亡等活动密切相关.本文就PAK5的结构、表达部位和功能以及其在调控凋亡级联反应中的作用等方面做了简要综述.

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JNK激酶介导mGluR1对细胞凋亡的不同效应

祝佳玮, 朱萍, 张松, 杨荟敏, 张晨光, 张红

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 228-236.

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代谢型谷氨酸受体1（mGluR1）可以通过激活多条信号通路促进或抑制细胞凋亡.然而,导致这种生理功能差异的机制尚不明确.本研究选用两种细胞系,即大鼠神经胶质瘤细胞系（C6）和人胚胎肾细胞（HEK293）分别研究内源性和外源转染的mGluR1的激活对细胞凋亡的影响及其调节机制. 结果显示，内源性mGluR1的活化能够激活PI3K/ERK/JNK通路，抑制凋亡试剂STS诱导的细胞凋亡；而外源转染的mGluR1的活化能够分别激活PI3K/ERK和JNK通路，同时促进STS诱导的应激损伤. HEK293细胞中，应用JNK通路抑制剂SP600125，能够部分抑制由mGluR1激活介导的caspase3的剪切和细胞凋亡；而在C6细胞中阻断JNK通路，则加剧了由mGluR1活化而引起的细胞凋亡. 本文结果提示：mGluR1通过不同信号通路影响细胞凋亡，其中JNK通路可能是调控细胞凋亡的关键途径.本文为受体激活对细胞凋亡能够产生不同的调控作用提供了相应的证据.

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靶向FBXL20基因的siRNA片段的筛选及其验证

朱剑军, 蒋琴, 袁粒星, 陈尧

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 237-243.

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在人结肠腺癌SW480细胞株及口腔鳞癌HSC3细胞株中，筛选有效干扰fbxl 20的siRNA片段.设计合成3对靶向fbxl 20 mRNA的小干扰RNA片段，通过阳离子脂质体介导转染SW480细胞和HSC3细胞. 结果发现siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3均能抑制SW480细胞和HSC3细胞fbxl20 mRNA的表达，siRNA-2抑制作用最明显，抑制率分别为86.8％和100%. MTT试验显示：siRNA-2转染SW480细胞和HSC3细胞后，细胞增殖能力明显降低，细胞增殖抑制率分别为29.5%和43.4%. Transwell小室迁移实验表明，HSC3细胞在转染24 h后，细胞迁移能力明显减弱，迁移抑制率高达72.4%. 流式细胞术检测细胞凋亡结果显示：转染36 h后，SW480细胞实验组细胞凋亡率为21.9%;转染24 h后，HSC3细胞实验组细胞凋亡率为44.7%. 本实验成功的筛选出了特异性的抑制fbxl 20基因的siRNA片段，并初步鉴定了fbxl 20基因的功能.

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酵母细胞中Pil1的磷酸化与细胞压力抵抗的关系

刘莹, 王国丽, 毕强, 徐鸿翾, 刘楠启

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 244-247.

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在外界因素处理下，细胞将启动一系列保护措施以适应各种环境改变，磷酸化调节是蛋白功能调节的主要方式. 为了探讨酵母细胞中Pil1的磷酸化与细胞压力抵抗的关系，实验应用Pil1突变细胞检测在过氧化氢或热处理后细胞的生长情况，用免疫印记法检测热处理后Pil1的表达. 结果表明,相比野生细胞，Pil1突变细胞对抗过氧化氢和热的能力强，热处理后 Pil1的磷酸化水平增高， Pil1的丝氨酸273对于其磷酸化发生至关重要.

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核小体定位模式及其与DNA甲基化位点分布的关系

刘宏德, 孙啸

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 248-253.

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核小体定位是指DNA双螺旋相对于组蛋白八联体的位置.核小体定位通过限制蛋白结合位点参与基因转录调控.本文利用实验检测的人类CD4+ T细胞核小体定位数据，研究了核小体定位在转录因子结合位点(TFBS)和转录起始位点(TSS)附近的分布模式，并分析了在TFBS和TSS周围，核小体定位与DNA甲基化之间的关系.结果表明,在休眠和激活的人类CD4+ T细胞中，部分TFBS和TSS周围的核小体定位在动态改变，即在定位和缺失两种状态之间切换.在TFBS周围，核小体定位和DNA甲基化存在一种互补模式，核小体定位与DNA低甲基化相联系；而在TSS周围，两者呈现同步模式，DNA高甲基化伴随高核小体水平.而且，在TFBS和TSS周围，DNA甲基化位点的分布呈周期模式.CD4+ T细胞被激活时，较少的转录因子启动了较多的基因.

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PTEN通过抑制PI3K-AKT信号通路上调Rad51基因的表达

陈忠民, 胡迎春, 莫琳, 霍艳英, 徐勤枝, 周平坤, 吴德昌

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 254-259.

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前期研究发现pten缺陷细胞的自发DNA双链断裂损伤水平显著增加.本研究探讨了抑癌基因pten对参与DNA同源重组修复的rad51基因表达的影响和机制．用实时定量PCR技术检测了PTEN野生型和缺陷型细胞rad51的表达水平.结果发现,PTEN缺失会导致rad51的表达降低．PI3K激酶为PTEN的下游负调节靶分子，使用PI3K激酶抑制剂LY294002处理缺陷型细胞后，其rad51表达升高．在PTEN野生型细胞中分别转染Flag-Akt WT（野生型）和Flag-Akt AC（组成型激活），或在PTEN缺陷型细胞中分别转染野生型PTEN和Akt-DN（失去激酶活性的Akt）. 利用RT-PCR技术检测上述细胞rad51的表达水平，同时利用Western印迹检测上述细胞RAD51蛋白的表达水平.结果发现,转染Flag-Akt WT和Flag-Akt AC后，均能促使PTEN野生型细胞中rad51在mRNA和蛋白水平降低；在PTEN缺陷型细胞中转染野生型PTEN或Akt-DN后，rad51在mRNA和蛋白水平均升高．在PTEN缺陷型细胞中使用siRNA沉默akt后，同样导致RAD51表达升高．结果提示,PTEN可以正向调节RAD51基因表达，PI3K/Akt是其信号通路机制之一．

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NDPK-A C4/109/145 S突变体降低磷酸转移酶活性但增加DNase活性

高雪, 张志红, 吕芬, 钱垂文, 王一飞, 熊盛

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 260-265.

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核苷二磷酸激酶A( nucleoside diphosphate kinase A, NDPK-A）有广泛的生物学活性,在肿瘤转移和调控中起重要作用.单独抑制NDPK-A中任何1个Cys所形成的二硫键,不会降低NDPK-A的磷酸转移酶活性和DNase活性.本实验通过构建C4/109/145S突变体并研究其生物学效应,为NDPKA结构与功能的研究提供参考.用定点突变法将NDPK-A 的4位、109位和145位Cys突变为Ser,构建pBV220-NDPK-A C4/109/145S和pEGFP-NDPK-A C4/109/145S两种重组质粒.在大肠杆菌中高效表达NDPK-A C4/109/145S突变体,纯化后可获得均一的重组NDPK-A C4/109/145S突变体蛋白.HPLC法和DNA消化法测定发现,C4/109/145S突变体磷酸转移酶活性低于野生型NDPK-A,而DNase活性高于野生型NDPK-A.以A549细胞作为模式细胞的流式细胞仪周期检测表明,C4/109/145S突变体与野生型NDPK-A一致,均可将细胞周期延滞在S期和G2/M期.这些结果证实,NDPKA结构异构与其磷酸转移酶活性密切相关,其酶活性至少需要1个Cys残基存在,NDPK-A结构中的二硫键也可能是其DNase活性的负调控机制之一,胞内NDPK-A的氧化还原异构可能对细胞周期无显著影响.

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敲减MC4R表达对牛胎儿成纤维细胞CMS系统关键因子的影响

黄萌, 许尚忠, 李俊雅, 高雪, 陈金宝

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 267-272.

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为获得敲减黑素皮质素4受体（melanocortin4 receptor，MC4R）基因的牛胎儿成纤维细胞，并探讨其在能量平衡神经调节系统中的作用，将构建成功并已鉴定为有效序列的短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)真核表达载体pGSH1GFPMC4R，利用阳离子脂质体转染牛胎儿成纤维细胞并使用G418筛选稳定转染细胞株.利用实时荧光定量和Western印迹检测MC4R及中枢黑素皮质素系统(central melanocortin system, CMS)关键因子的表达水平变化.结果表明，在稳定转染的牛胎儿成纤维细胞系中， MC4R表达显著抑制，瘦蛋白(leptin)和阿黑色素原(POMC)表达下调，黑素皮质素拮抗物agouti相关蛋白(AGRP)和MC3R表达上调，而神经肽Y (NPY)表达无明显改变.综上所述，本研究成功获得了敲减MC4R基因表达的牛胎儿成纤维细胞.相关基因表达水平检测结果提示, MC4R的表达水平对CMS系统中的各关键基因的表达有不同的抑制或促进影响.

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大鲵皮肤cDNA文库构建及Arpc5l基因cDNA序列和组织表达分析

王立新, 郑尧, 艾闽, 杨辉, 杨朝霞

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 273-281.

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以健康大鲵背部皮肤为材料，采用Smart技术构建大鲵皮肤cDNA文库，经检测文库容量为150×106 cfu，文库重组率为98%，插入片段平均长度约为1 kb. 通过对大鲵皮肤cDNA文库的随机筛选，分离获得了大鲵肌动蛋白相关2/3复合物亚基5样蛋白(Arp2/3 complex subunit 5-like, Arpc5l)基因cDNA序列.生物信息学分析表明,大鲵Arpc5l基因全长cDNA为 699 bp, 包含459 bp的开放阅读框，分子量为17 154.36，等电点(pI)为5.43；该基因编码的Arpc5l蛋白分别在7-29 AA处和44-66 AA处具有跨膜结构域及多种二级结构，且三级结构与Arp2/3 complex家族成员相似. 实时定量PCR结果表明，该基因在大鲵皮肤、肌肉、肠、肝、脾、肺、胃以及肾等组织中广泛表达，且在肾、肠、肌肉中的表达量极显著高于其它组织(P<0.01). 进化分析结果表明, 大鲵Arpc5l氨基酸序列和小鼠(77％)等陆生动物同源性最高，和爪蟾同源性为73％，大鲵处于水生到陆生之间的过渡类型，且与陆生动物的亲缘关系更近.

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一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

李春雷, 邓小昭, 董莉莉, 韦娟, 余晓杰

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 282-286.

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在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase，XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase，XDH)基因的重组酿酒酵母中，木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH，木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶 NAD+，两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡，是造成木糖醇积累，影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1，与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109，以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株，在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选，获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养，HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示，与对照菌株AH-XR-XDH相比，AH-M-XDH的木糖利用率明显提高，乙醇得率增加了16%，木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶，可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇，其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题，提高木糖利用率和乙醇产率.

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鹰嘴豆种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与鉴定

赵欣, 付煊赫, 张宗申, 刘同祥, 王继峰

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(3): 287-292.

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为了寻找具有药物作用的天然胰蛋白酶抑制物，采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析(DEAE-纤维素52)及Sephadex G-100凝胶层析等方法, 从鹰嘴豆种子中分离出一种鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂（CPTI）. 研究表明：CPTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率达80%,而对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱,抑制率为32%, 对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用; 用SDS-PAGE测得CPTI近似分子质量为25.7 kD; CPTI具有较高的热稳定性,在100 ℃下加热60 min,对胰蛋白酶活性仍保持78%抑制率; Lineveaer-Burk作图得知该抑制剂属竞争性抑制类型. 动力学测定显示，来自鹰嘴豆中的CPTI对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为3.99×10^-7 mol/L.

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