肽适体是一种从随机氨基酸的肽文库中筛选出来，可以高亲合力地与靶物质特异性结
合的短肽序列．它的主要结构包括恒定的展示支架蛋白及通过两端限制性插入的高变肽环．
酵母双杂交技术常用于筛选针对细胞内特异性靶蛋白的肽适体过程，筛选出的肽适体通过特
异性结合识别靶标发挥类似“干扰基因”的作用从而影响蛋白的生物学活性．
多功能淀粉酶是α淀粉酶家族（α-amylase family）的新一类成员，包括新普鲁兰酶
、麦芽糖淀粉酶和环麦芽糊精酶，它们在结构上具有α淀粉酶家族共有的4个高度保守的区
域，但在功能上又兼有糖苷水解酶和糖基转移酶的催化活性，而不同的多功能淀粉酶虽然在结 构与功能上具有一定的相似性，但不同来源的酶在底物特异性和水解、转移糖苷键的特异性
等方面存在着差异.多功能淀粉酶大多存在单体与二聚体或多聚体之间的平衡，其多聚化与N
结构域和环境中的离子强度调控有关.实验证明,通过突变可以改变多功能淀粉酶的催化特
性，甚至仅1个氨基酸的替换就能实现功能改变.多功能淀粉酶的结构保守性和催化多样性具
有重要的研究价值及应用前景.
Wnt信号通路与细胞的生长发育和分化等密切相关，是细胞中重要的信号转导途径，在
多种癌症中，都有该通路的异常改变.Wnt信号通路主要是通过一系列蛋白将Wnt信号传导至
β连环蛋白（β-catenin，β-cat），使后者入核并与转录因子T细胞因子/淋巴细胞增
强因子（T cell factor / lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）结合，从而促进下游基因的转录，进而调控细胞的多种生理过程.在该通路中，涉及轴蛋白（Axin）、结肠腺瘤样息
肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、糖原合酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)、β连环蛋白和酪蛋白激酶I (casein kinase I，CKI)等众多调节因子，这些因子能发生多种化学修饰，如磷酸化、泛素化（ubiquitylation）、苏素化 (small ubiquitin relatedmoditier，SUMO)和乙酰化等，从而影响β连环蛋白、T细胞因子的稳定性、细胞定位以及活性，最终起到调节Wnt信号通路的作用.
古DNA研究至今已经历20多年时间，近年来,在生物系统进化和谱系发生等方面有着越
来越广泛的应用．我国古DNA研究起步较晚，主要集中于我国近几千年来古人类DNA提取和个体及群体遗传关系的研究，其他动植物古DNA研究相对较少．国际上古DNA研究不仅涉及内容广泛，而且在实验体系的规范和结果论证等方面有着严格的标准．本文系统介绍了规范古DNA实验体系的具体建立方法，强调空白提取对照、PCR水对照等各类对照的设立及可重复性实验在古DNA序列可靠性验证中的重要作用；并对近年来古DNA研究的新方法、新技术，如多重PCR、第二代高通量测序技术等进行了详细介绍．
昆虫细胞色素P450是一类在生物代谢中起重要作用的基因家族，承担着许多重要的生
理功能，包括对植物次生物质代谢和杀虫剂解毒等.本研究以玉米螟5龄幼虫中肠的总RNA为
模板，根据不同昆虫P450基因家族保守氨基酸序列，设计并合成简并引物，利用RT-PCR扩
增出了玉米螟细胞色素P450基因cDNA片段，将其克隆到pMD19T载体进行序列测定.测序获得了编码213个氨基酸残基的641 bp的DNA片段，命名为OfP450(GenBank登录号：EU807990) ；与已公布的棉铃虫、家蚕、欧洲防风草结网毛虫、小菜蛾和黑腹果蝇等的细胞色素P450氨基酸序列进行比较，其一致性分别为55％、50％、49％、44％和31％.将植物次生物质棉酚、丁布添加入人工饲料中，对玉米螟进行了饲喂实验，采用优化半定量RT-PCR，以18S rRNA为内标，RT-PCR检测进食棉酚、丁布植物化合物的玉米螟中肠P450基因的转录. 结果表明，其转录水平能被棉酚、丁布显著诱导. 提示本实验克隆的玉米螟细胞色素P450对植物次生物质的代谢作用与P450表达量呈正相关.该研究为下一步将植物介导的RNA干扰技术应用于害虫生物防治提供坚实的基础.
为探讨过表达外源巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)对细胞增殖的影响，将重组载体
pCMV/cyto/myc-M-CSF转染MCF7细胞、G418筛选，RT-PCR、Western 印迹和免疫荧光鉴定M-CSF的mRNA表达、蛋白表达及定位，通过计算细胞倍增时间、MTT法及反义寡核苷酸抑制实验分析M-CSF对细胞增殖的影响. 结果表明，转染M-CSF的MCF7细胞过表达M-CSF-mRNA及蛋白，并且定位表达于细胞质；与转染空载体及未转染M-CSF组细胞比较，转染M-CSF的MCF7细胞倍增时间明显缩短、增殖能力显著增强，M-CSF的特异性反义寡核苷酸能抑制转染M-CSF的MCF7细胞的增殖，且抑制率随着反义寡核苷酸浓度的增高而增强；以上结果提示，胞质过表达M-CSF可促进MCF7细胞的增殖.
电压依赖性钙离子通道(voltagedependent calcium channels, VDCC)是细胞膜上
控制Ca2+进入胞内的特殊蛋白质，VDCC β亚基具有调节其通道活性的作用．使用
RT-PCR 和 RACE-PCR技术，从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到电压依赖性钙离子通道β亚基(SjCaβ)基因，所得序列提交GenBank，登录号EU853658．该基因全长1 867 bp，包含1个1 614 bp的开放阅读框(ORF)，编码537个氨基酸．将SjCaβ与多种无脊椎动物钙离子通道β亚基进行分析比较，发现它们有较高的同源性，并具有钙离子通道β亚基基因内保守的2个功能区域，即SH3功能区（src-homology 3 domain）和GK功能区(guanylate kinase domain)．在功能区域附近还具有电压依赖性钙离子通道β亚基特有的BID区(β interaction domain)，氨基酸保守序列为PYDVVP-RP---VGPSLKGYEVTDMMQKALFDF，进一步确定了得到的cDNA序列为海刺参电压依赖性钙离子通道β亚基．对SjCaβ的二级结构进行了预测，构建了系统进化发育树，并运用同源建模法构建了SjCaβ的三维结构模型．研究结果对深入研究海刺参离子通道的结构以及在信号传导过程中的作用有着重要意义，并为研究海刺参自溶等问题提供一定的理论基础．
为鉴定微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1在肝脏组织的功能，采用GST pull-down结合质
谱技术，检测该蛋白在肝脏中的结合蛋白，结果提示，肌球蛋白Ⅵ与HSPC300/hHBRK1共沉降，Western 印迹杂交证实了质谱的结果．构建HSPC300/hHBRK1原核表达载体，诱导并获得了His-hHBRK1融合蛋白．利用免疫共沉淀证实hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ存在相互作用，激光共聚焦检测显示hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ在肺癌95D细胞的胞浆共定位，提示其相互作用可能是直接结合．肌球蛋白Ⅵ参与细胞迁移、高尔基分泌泡的运输和维持高尔基体稳定性等作用．hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用，为微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1参与细胞迁移和胞内物质运输提供了进一步佐证．
通过宫腔内脂质体转染改变小鼠子宫内Meis1基因的表达水平，研究其对子宫内膜容
受性的影响，从而推测Meis1基因在胚胎着床中的作用.选择8～12周龄昆明小鼠,于妊娠
第2 ｄ,通过向小鼠宫腔内注入Meis1基因表达质粒和siRNA表达质粒及其各自的对照质粒
，在妊娠第5ｄ, 提取小鼠子宫mRNA 和蛋白质行半定量RT-PCR 和免疫组化分析，观察各组小鼠子宫内膜Meis1和整合素β3的表达变化.在妊娠第9 ｄ,观察Meis1基因上调组及其对
照组、Meis1基因下调及其对照组妊娠率和胚胎着床数的差异.结果显示,Meis1基因下调组胚胎着床率明显低于对照组（P<0.05）,Meis1基因上调组胚胎着床率略高于对照组,但无统计学意义（P>0.05）；Meis1基因上调组其整合素β3的表达高于其对照组，Meis1基因下调组 整合素β3的表达低于其对照组，差异均有显著性（P<0.05）.以上观察结果表明,Meis1基因表达下降可明显减少胚胎着床率，影响整合素β3的表达.Meis1基因表达提高则可促进整合素β3的表达. 因此，Meis1可能作为1种子宫内膜容受分子，在胚胎着床中发挥重要作用.
真菌病原体Cryptococcus neoformansAD血清型剪接体蛋白PRP8蛋白质内含子是目前
发现的第2个存在于真核生物体核基因组中的蛋白质内含子.它的宿主基因prp8编码的PRP
8蛋白作为剪接体的1个组分，是1个高度保守的mRNA剪接蛋白.将组氨酸标签插入克隆自真菌病原体Cryptococcus neoformans AD血清型的PRP8蛋白质内含子中，并将该蛋白质内含子进行人工断裂，获得断裂蛋白质内含子，在大肠杆菌中鉴定其剪接活性.研究结果表明：所获得的改造型蛋白质内含子均表现出高效的剪接活性.利用此Cryptococcus neoformansAD血清型PRP8 断裂蛋白质内含子，成功构建了蛋白质反式剪接系统.这一反式剪接系统可用于其他蛋白质的连接与合成，有望成为蛋白质工程中的一种有用工具.
应用Tet-On基因表达系统，调控CYP2E1基因在NIH 3T3细胞中的表达水平，探讨CYP2E1在化学致癌物二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)代谢中的作用．先后将
Tet-on基因表达系统的调控质粒pRevTet-on和反应质粒pRevTRE-2E1转染NIH 3T3细胞，分别用G418和潮霉素筛选，并通过RT-PCR和Western印迹检测，成功获得了3个具有良好诱导性Tet调控的CYP2E1基因表达细胞系（Tet/3T3-2E1）．应用不同浓度强力霉素(doxycycline, Dox)处理Tet/3T3-2E1细胞诱导CYP2E1表达，HPLC分析细胞对CYP2E1特异性药物探针氯唑沙腙的原位代谢能力及MTT法分析CYP2E1介导的NDMA细胞毒性作用．结果显示，Tet/3T3-2E1细胞CYP2E1的表达及其代谢能力有明显的Dox浓度依赖性，而且NDMA对Dox诱导组细胞有明显浓度依赖性细胞毒性作用，其IC50值为12.06 μmol/L，无Dox诱导组未见明显的NDMA细胞毒性作用．该细胞模型的成功建立对于开展与CYP2E1相关的毒物、致癌物代谢研究，筛选抗毒物、抗癌物等具有重要价值．
探讨过表达特异AT序列结合蛋白-1 ( special AT-rich sequence binding protein
,SATB1)核基质结合区（MAR）结合蛋白对胰岛素样生长因子结合蛋白-2（IGFBP2）基因表 达的影响，并对其影响机制进行初步探索．首先用脂质体将SATB1的真核表达载体pcDNA3.1-SATB1转染至K562细胞，通过6周G418的筛选获得阳性克隆，RT-PCR、实时PCR及Western 印迹验证过表达情况，对阳性克隆细胞中IGFBP2的表达用RT-PCR、实时PCR及Western 印迹方法进行检测；然后用RNAi的方法干扰阳性细胞中SATB1 的表达后，同样用上述3种方法再次检测IGFBP2的表达状况；用生物信息学方法对IGFBP2基因进行MAR序列与SATB1结合位点搜索分析，寻找SATB1影响IGFBP2基因表达的机制．结果显示，在稳定转染的情况下，实验组K562-SATB1细胞与转染空载体pcDNA3.1的K562-3.1细胞和未转染细胞K562相比，IGFBP2 mRNA水平上调了近7倍，而蛋白水平变化不明显．RNA干扰后，IGFBP2的表达在mRNA水平也相应下调，蛋白水平的变化同样不明显．通过生物信息学分析发现，IGFBP2第1个内含子中可能存在2. 5 kb MAR样序列，且MAR样序列上存在多个SATB1的潜在结合位点．综上所述，过表达SATB1可以使K562细胞中IGFBP2 mRNA表达水平提高，而且其调控机制可能与SATB1直接和IGFBP2基因中的MAR样序列结合有关．
在端粒酶阳性的肿瘤细胞中引入带突变模板的人端粒酶RNA亚基（MT-hTR）是一种新颖的抑 制肿瘤细胞生长的方法.本研究通过构建MT-hTR真核表达重组体，初步观察其对人宫颈癌He
La细胞生长的影响.通过分子克隆技术及PCR介导的定点突变技术构建野生型及突变型hTR表
达重组体，将空载体及重组体分别与质粒pEGFP-C1通过脂质体共转染HeLa细胞，经药物G418的筛选得到稳定表达外源基因的细胞.RT-PCR检测目的基因的表达，TRAP分析细胞的端粒酶活性，并通过MTT法绘制各组细胞的生长曲线.结果发现，重组体在细胞内能成功表达目的基因，并且在Mutant1转染细胞中检测到相应的突变型端粒酶活性.构建的4个MT-hTR重组体中，有3个能使HeLa细胞生长速度减缓.以上结果提示，在HeLa细胞内表达MT-hTR能抑制细胞的生长速度，并且突变模板的设计可能会影响到抑制效应的发挥.
先前的研究表明，基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (rBTI) 具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理，从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件，本研究用不同浓度的 rBTI 体外作用于人肝癌细胞 HepG2 后，采用 MTT 比色法检测抑制剂对epG2 细胞的抑制率，用 DNA 凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测 HepG2 细胞的凋亡.结果表明，rBTI 在体外能够明显抑制 HepG2 细胞的增长，并诱导细胞凋亡.另外，细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA 水平有关.通过 RT-PCR 检测发现，细胞经过rBTI处理后，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 水平下调，促凋亡基因 Bax mRNA 有所上调，而对照 GAPDH 无变化.对 HepG2细胞中 Fas/Fas 配体及半胱氨酸天冬酶（caspase）的研究证明，细胞经过 rBTI 处理后，对死亡受体 Fas mRNA没有影响; rBTI 可明显激活caspase-3 和 caspase-9 酶活性， 对caspase-8 活性几乎无影响.上述结果表明，rBTI 对HepG2 细胞具有明显的诱导凋亡作用，其诱导细胞凋亡的机制与 caspase-3 依赖性凋亡调节信号通路有关，未涉及 Fas/Fas 配体途径.
建立一种基于纳米金生物条形码技术的二噁英快速筛检方法.利用二噁英诱
导激活的芳香烃受体复合物，特异识别以纳米金为报告基团的二噁英反应探针，该
探针被释放后进行条形码放大，通过纳米金银染技术增强识别信号，并记录其吸光度值，从
而可以简单灵敏地快速筛检二噁英类化合物.在一定的反应时间和浓度范围内（10
-14～10-10mol/L），溶液的吸光度值与2，3，7，8四氯二苯并二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）浓度之间呈正相关
，方法检测限为0.01 pmol/L，变异系数为5%～8%.用纳米金生物条形码（NanoBarcod
e，nanoparticlebased biobarcode）方法和现有的生物分析方法（CALUX，chemical
activated luciferase gene expression）分别测定TCDD标准品，并绘制剂量效应曲线.结
果表明，本方法灵敏度高，线性范围宽，重复性好.本研究纳米金生物条形码方法的检测灵
敏度高于CALUX将近5倍(EC50分别为 4×10-12 mol/L 和 2×10-
11 mol
/L)，检测限较CALUX降低了10倍（检测限分别为1×10-14 mol/L 和1×10
-13 mol/L），变异系数分别为5%～8%和15%～30%.
采用酶解和离子交换色谱的方法，从兔、鸡、猪和羊肝组织中提取和纯化得到了糖胺聚糖（GAGs）.通过比较透明质酸（HA）、硫酸软骨素A（CS-A）、硫酸软骨素C（CS-C）、硫酸皮肤素（DS）、肝素（HP）、硫酸乙酰肝素（HS）等标准品在醋酸钡、醋酸锌、吡啶-甲酸等几种不同缓冲体系下的醋酸纤维素薄膜电泳行为，结合灰度积分建立了适合于微量GAGs定性和定量分析的电泳方法.将从不同动物肝脏组织中提取的GAGs运用该方法进行分析，发现 不同动物肝脏组织中，GAG含量和组成均有较大差异：羊肝中GAGs含量最高（0.52 mg/g
组织干粉），种类也最丰富，含有HA、HS、DS和CS，其中HA所占比例最高；鸡肝中GAGs含量最少（0.18 mg/g组织干粉），主要含有HA和DS；兔肝GAGs种类与猪肝相似，均含有HA、HS和DS，但HS是猪肝GAGs的主要成分，DS是兔肝GAGs的主要成分.
