中国生物化学与分子生物学报

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田华，戴爱国

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 1-6.

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低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)是参与调节机体氧平衡的重要转录因子，在细胞低氧应答反应中起核心作用，能调节100多种涉及低氧应激下细胞适应和存活的靶基因．HIF-1由氧敏感的α亚基和在细胞内稳定表达的β亚基组成．其中α亚基可受到多种翻译后化学修饰作用，如在常氧下，HIF-1α通过泛素化蛋白酶修饰并导致其快速降解．最近几年发现的泛素样蛋白家族成员小泛素蛋白样修饰蛋白（SUMO）也能与HIF-1α共价结合．SUMO是一种分子量约为12 kD的小蛋白，从拟南芥到人类普遍存在．SUMO可共价结合许多靶底物蛋白，并对其进行翻译后修饰，该过程称为SUMO化．与泛素化蛋白酶体途径不同的是，SUMO化修饰能在常氧和相对低氧的条件下调节HIF-1α蛋白的稳定性，从而改变其转录活性．SUMO化是一个可逆的动态过程，可被特异性蛋白酶ULP/SENP将其从底物上去除．本文主要就HIF-1α的可逆性SUMO化修饰作一综述．

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P-糖蛋白结构及作用机制

涂春华,杨冬梓

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 7-7~11.

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ABC (ATP-binding cassette) 转运蛋白广泛存在于各种生物体细胞中，例如细菌的内层细胞浆膜和真核生物的细胞膜和细胞器膜.其利用与ATP的结合和水解供能进行底物的跨膜转运，其中一部分ABC转运蛋白能转运多种疏水性分子.P-糖蛋白隶属于ABC转运蛋白超家族，是研究最为透彻的一员，主要功能是防止机体对外来有害物质的摄入.P-糖蛋白(P-glycoprotein)由4 个基本结构域组成，2 个跨膜区和2 个位于细胞浆内的核苷酸结合区.核苷酸结合区参与ATP的结合和水解，而各由6 个α 跨膜螺旋组成的2个跨膜区联合构成了底物跨膜转运的通道.P糖蛋白能转运多种不同结构的底物，包括脂类、胆汁酸、多肽和外源性化学物质，这对机体的生存至关重要，但同时也存在不利的一面，包括干扰了药物的运输，从而导致了多药耐药现象的产生.本文就P-糖蛋白的分子结构和作用机制的最新研究进展进行综述.

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过氧化物酶体脂肪酸β氧化

石如玲,，姜玲玲

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 12-12~16.

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除线粒体外，过氧化物酶体也是真核细胞脂肪酸β氧化分解的重要部位．过氧化物酶体β氧化过程包括氧化、加水、脱氢和硫解4步反应，主要参与极长链、支链脂肪酸等的分解．近年关于过氧化物酶体β氧化的研究活跃，在代谢途径及功能等方面有了新的认识，尤其在对相关代谢酶的研究中取得了较大进展．本文就过氧化物酶体β氧化相关进展作一综述．

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X-连锁肾上腺-脑白质营养不良蛋白的结构与功能

谢海花，兰风华

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 17-17~22.

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X-连锁肾上腺脑白质营养不良基因（ALD基因）编码的ALD蛋白（ALDP）是4种人类ABCD转运蛋白之一，为一种半ABC转运蛋白，既有ABC(ATP binding cassette)转运蛋白的共有特征，又有过氧化物酶体膜蛋白的特点. 其功能可能是将胞浆中极长链饱和脂肪酸（VLCFA）或其衍生物转运到过氧化物酶体内，并在其中进行β氧化. 已报道的ALD基因突变有900多个，其后果多种多样，但最终都使VLCFA或其衍生物无法进入过氧化物酶体，从而使VLCFA在体内蓄积. 作者认为，ALDP是研究ABCD转运蛋白，乃至所有ABC转运蛋白的一个极好模型.

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用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶拆分DL-苯丙氨酸

何平，黄卓烈，巫光宏，初志战，史清翠，黄家乐

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 23-23~29.

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为了将手性化合物D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸进行分离，利用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶催化的方法对其拆分．试验结果表明，用DL-苯丙氨酸合成N-乙酰-DL-苯丙氨酸，得率为88.7％．木瓜蛋白酶、海藻酸钠壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(IPSAC)、尼龙布固定化木瓜蛋白酶(IPN)催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺时，对催化合成过程影响最大的因素分别是溶液中的离子强度、溶液中的离子强度、反应温度；溶液中的离子强度与pH对合成的影响较大．本试验得出分别用木瓜蛋白酶、IPSAC、IPN催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺的3个最佳方案；用此3个方案合成时，产率分别为61.2%、54.7%、36.3%．N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺水解生成L-苯丙氨酸，产率59.2%，光学纯度为96.6％．N-乙酰-D-苯丙氨酸水解生成D-苯丙氨酸，产率61.7%，光学纯度为95.7％．

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c-Myc蛋白与DNA-PKcs作用位点的鉴定

尚增甫,徐勤枝,安静，王豫,周平坤

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 30-30~36.

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DNA-PK复合物由Ku蛋白和DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)组成，DNA-PKcs属于PI3K相关激酶家族成员.我们前期工作发现,DNA-Kcs沉默后,c-Myc的稳定性下降，且二者存在相互作用.为进一步确定c-Myc蛋白与DNA-PKcs相互作用位点，本研究利用原核表达系统活动了c-Myc及其截短体蛋白，利用GST pull-down技术结合Western印迹法，发现c-Myc蛋白294～370位氨基酸与DNA-PKcs存在相互作用.在细胞内表达GFP-c-Myc各截短体蛋白，发现294～370位氨基酸是c-Myc蛋白降解必需的.利用免疫荧光技术，发现DNA-PKcs与c-Myc蛋白有相同的细胞亚定位，进一步表明两者在生物学功能上具有相关性.有文献报道294～370位氨基酸是乙酰转移酶p300的底物，此位点的乙酰化导致c-Myc的降解.本实验结果提示,c-Myc蛋白的294～370位氨基酸与DNA-PKcs结合，可能阻止了乙酰转移酶p300的结合，从而达到提高c-Myc蛋白稳定性的作用.

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Dnd1的蛋白亚细胞定位及其对HeLa细胞增殖的抑制作用

张菁,丁小凤,罗畅,张健,彭小宁

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 37-37~43.

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小鼠睾丸生殖细胞瘤易感基因Dnd1编码的蛋白是一个在进化中保守的RNA结合蛋白.为探讨小鼠Dnd1的蛋白亚细胞定位和对细胞增殖的影响及其机制, 利用生物信息学技术, 采用组合的亚细胞定位分析软件对Dnd1进行真核生物亚细胞定位预测; 利用融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)定位的方法, 通过构建pEGFP-Dnd1重组质粒, 将重组质粒pEGFP-Dnd1转染HeLa细胞和GC-1细胞, 在荧光显微镜下观察Dnd1的蛋白亚细胞定位; 用MTT法和流式细胞技术测定Dnd1过表达对HeLa细胞的增殖能力的影响和细胞周期的改变; 在HeLa细胞系中检测Dnd1对AP-1转录活性的影响. 结果表明: ① 生物信息学预测Dnd1主要在细胞核表达, 在细胞质中也有少量表达; 荧光显微镜下观察发现，Dnd1蛋白主要定位在细胞核, 在细胞质中也有少量分布; ② Dnd1基因在HeLa细胞系中的过表达抑制细胞增殖和诱导细胞周期G1期阻滞；③ Dnd1抑制AP-1的转录活性，从而抑制AP-1介导的转录是Dnd1抑制细胞增殖的可能机制.本研究初步明确了Dnd1的蛋白亚细胞定位及其对HeLa细胞的生长抑制作用, 这为进一步研究Dnd1基因的功能建立基础.

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pAkt在衰老细胞中的核转位

赵磊,谢步善,韩秀丽,陈丽婷,何维清,毛泽斌

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 45-45~49.

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磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB，又称为Akt）/叉头转录因子（FOXO）信号通路在从酵母菌到小鼠的寿命以及衰老的调节上都起着非常重要的作用．有研究发现，血清可以激活年轻细胞、衰老细胞胞浆内的Akt，并且年轻细胞核内磷酸化Akt(pAkt)增多，而衰老细胞核内pAkt没有增多．为了研究衰老细胞膜是否发生转位受损，即pAkt能否通过衰老细胞核膜进入核内，通过激光共聚焦显微镜（CLSM）、Western 印迹等实验方法，发现衰老细胞胞浆中pAkt可以进入核内，进入核内的pAkt很快被去磷酸化灭活．

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“二合一"酶：柔性更强

张晨光摘译.杜丽校

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 49-49~49.

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“二合一"酶：柔性更强
德国波鸿-鲁尔大学的科学家近日解决了一种柔性很强酶的结构问题，明确了其空间构象，该酶通常存在于一种感染海洋细菌的病毒体内．这种感染海洋蓝藻纲原绿球藻的病毒与其宿主相比，能更有效地产生一种色素．要产生这种色素，原绿球藻需要两种酶，而病毒仅需要一种酶——一种“二合一”的酶．Thorben Dammeyer 是Nicole Frenkenberg-Dinkel教授 (微生物生理学)和Eeckhard Hofmann副教授(蛋白X-射线衍射分析)共同领导的研究小组的成员，作为他研究论文的一部分，解决了这种酶的三维结构问题，发现这种酶的柔性很强，蛋白的某些部分所处的空间位置可以发生变化，这在酶与其底物同时存在的情况下是一种很罕见的现象．他们的研究结果发表于近期的Journal of Biological Chemistry上，并被评为“Paper of the Week”．这种含有“二合一”酶的病毒叫做P-MMS2，通常感染蓝藻纲原绿球藻，在世界海洋中大量存在．与蓝细菌不同，这种病毒不利用红蓝色素进行光合作用，而是像高等植物那样利用叶绿素．原绿球藻本身也能生产各种色素，但需要两步反应，两种酶催化．Nicole Frenkenberg-Dinkel说“我们在病毒中发现了一种酶的基因信息，这种酶使得病毒比其宿主能更有效的产生红色素（只需要一步反应）．这让我们相信，尽管光捕获时并不需要，但红色素对原绿球藻很重要．同时，我们更想知道什么原因使得这种酶能整合两种酶的功能．”科学家利用X射线衍射从原子水平分析了这种酶在自然状态以及与天然底物共同存在时的三维结构．他们发现，酶的天然底物胆绿素IXa存在于酶的“结合口袋”部位，在这里变成红色素．Frenkenberg-Dinkel教授解释，科学家们可以清楚地看到酶的“结合口袋”周围的部分所处的位置可以发生变化而形成不同的构象，这对于处于液相中的蛋白可能很常见，但处于晶体状态的蛋白则是极为罕见的．这种结构转变让科学家们第一次认识到了处于催化过程中的酶的运动变化情况．更进一步的研究包括利用靶向或随机改变这种高柔性酶的基因结构，观察这种特殊的酶的体外进化情况．
（张晨光摘译自Science Daily, October 6，2008, 杜丽校）

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FOXO1在胰岛β细胞中的表达及对增殖凋亡功能的影响

卢忠燕，甘立霞，缪洪明，王喆，邹全明

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 50-50~56.

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胰岛功能受损的分子机制研究是揭示2型糖尿病(T2DM)发病机制的核心问题．FOXO1是胰岛素信号下游的重要靶转录因子，参与胰岛的发育，但在分化成熟的胰岛β细胞中的功能尚未阐明．本研究采用免疫组化方法结合激光共聚焦技术观察FOXO1在胰岛的表达及细胞定位；通过基因介导的转移技术和siRNA干预技术,在培养的大鼠胰腺癌β细胞系（INS-1E）中特异高表达组成性活性的FOXO1(FOXO1-AAA)或抑制其表达水平，观察FOXO1表达水平的改变对β细胞增殖、凋亡的影响．免疫组化结果显示，FOXO1在正常胰腺组织中仅特异地表达在胰岛内．采用胰岛素与FOXO1的免疫荧光双标结合共聚焦观察进一步揭示，FOXO1主要表达在胰岛的β细胞中．Western印迹显示，腺病毒介导的基因转移技术在体外培养的INS-1E细胞中过表达FOXO1-AAA或其特异的siRNA均能有效地上调或抑制其表达水平3H-TdR掺入实验结果显示，降低FOXO1的表达显著促进细胞增殖；反之，高表达FOXO1显著抑制细胞增殖．与之相应，MTT检测结果显示，降低FOXO1的表达对细胞存活有显著促进作用，高表达FOXO1对细胞存活有显著抑制作用．进一步采用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示降低FOXO1的表达使β细胞凋亡率降低，反之高表达FOXO1使β细胞凋亡率增加．研究结果证实，胰岛β细胞中的FOXO1参与β细胞的存活、增殖、凋亡的调节．病理性高表达FOXO1可能通过阻止β细胞增殖、促进β细胞凋亡从而减少β细胞的数量，在T2DM发生中可能起重要作用．

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中国野生笃斯越橘花青素的初步分离和分析

刘翠,，陈素华，陈少云，董先智

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 57-64.

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采用反相高效液相色谱法和电喷雾质谱法对我国野生笃斯越橘中花青素组分进行了分离和分析．制备野生越橘花青素的粗提物，经大孔树脂柱层析得到花青素样品，其得率为0.72%．用香草醛法测得其总黄烷醇含量为95%．采用Alltima C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以2 %甲酸水溶液(A)和2 %甲酸/甲醇溶液(B)作为流动相，分2个梯度对花青素组分进行洗脱，将其主要洗脱峰在电喷雾正离子模式下进行分析，根据质谱的准分子离子［M+H］(m/z)检测其聚合度．结果表明,我国野生越橘花青素的提取物被展开成8个主要的洗脱峰，以峰面积计算，主要洗脱峰总含量达85%．经质谱分析，判断为2个单体，3个二聚体，1个三聚体，2个四聚体．结果表明,我国野生笃斯越橘中含有较丰富的花青素，低聚体是其中的主要成分．本文首次报道了我国大兴安岭野生笃斯越橘花青素的组成情况，对于开展其后续的结构、功能、质量检测以及生产开发研究都具有一定的参考价值．

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心里美萝卜营养生长期肉质根过氧化物酶同工酶谱及组化分析

王丽，王林嵩，孙向东，李芳军，杜晶晶，王一帆

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 65-71.

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过氧化物酶［peroxidase，POD，EC 1. 11. 1. 7 (X)］为一类多基因家族的同工酶，其聚合形式对其功能具有重要影响．心里美萝卜(Raphanus sativus var.L) 肉质根富含花青素和POD等．本文采用不同的电泳技术、组化定位和活性测定研究了心里美萝卜营养生长期肉质根中POD在不同时期和不同组织中的表达、分布特点及同工酶的组成和性质．结果显示，心里美萝卜营养生长期肉质根的皮和肉中POD活性均先升高后降低，分别在播种后第40 d和60 d出现峰值，30 d时皮中POD活性高于肉，之后则相反，酶活性最高时同工酶数目也最多，不同时期，皮和肉中同工酶种类不同；皮中POD同工酶由5个单体和4个二聚体组成，而肉中由5个二聚体或2个单体、2个二聚体和1个四聚体组成，均以酸性同工酶为主；组化定位显示POD主要分布在肉质根的周皮、形成层、木射线、木质部导管和肉的初生木质部等的细胞壁附近．从上述结果得出结论：酸性POD同工酶在植物体中以多种形式存在．

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红海榄根部盐胁迫反应的比较蛋白质组学分析

范吉星１，，邓用川１，，黄惜１，,，林栖凤１，，罗越华１，

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 72-72~77.

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红海榄(Rhizophora stylosa)是一种典型的红树林盐生植物.本研究利用蛋白组学技术对淡栽(R0)和3% NaCl盐栽(R3)处理后的红海榄根部总蛋白进行了比较研究.双向电泳图谱的结果表明，R0和R3分别有981和972个蛋白点，蛋白点主要集中在分子量28～70 kD，等电点4.0～8.5之间. R0和R3之间差异明显的有15个蛋白点.其中,8个蛋白的表达量在R0中表达增高（10倍），而在R3中相对下降.另外,7个蛋白的表达量在R0中较低，而在R3中表达量显著增高.对这15个蛋白点进行肽质量指纹图谱分析，10个蛋白点找到匹配蛋白.功能预测分析发现,在盐水栽培上调的蛋白质一般与逆境胁迫有关，淡水栽培上调的蛋白质一般与基本代谢有关.这些研究结果为进一步研究红海榄的耐盐机理提供了有意义的线索.

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RNA干扰抑制癌胚抗原表达对结肠癌细胞增殖的影响

崔欲晓，刘民，李欣，汤华

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 78-78~82.

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癌胚抗原（CEA）作为肿瘤标志物，在多种恶性肿瘤中高表达.为探索CEA在肿瘤发生发展过程中的生物学作用，本研究以结肠癌细胞株8307为研究对象，应用RNAi技术抑制CEA在8307细胞中的表达，观察其对8307细胞生长的影响.依据siRNA设计原则，设计合成靶向CEA的shRNA并克隆到pSilencer2.1-U6 neo载体中，成功构建了CEA shRNA表达载体，通过脂质体介导转染8307细胞，经G418筛选出抑制CEA表达的稳定细胞.RT-PCR、Western印迹分别检测CEA mRNA及蛋白表达水平，MTT及集落形成实验检测细胞增殖活性.实验结果显示，构建的CEA shRNA表达载体明显抑制CEA mRNA及蛋白水平的表达.MTT实验中，CEA表达下调的8307细胞生长活性降低，与对照组相比，抑制率达39%（P<0.05），细胞集落形成能力也显著降低（P<0.05）.上述结果初步证明，构建的CEA shRNA表达载体能明显降低CEA的表达，并抑制结肠癌细胞增殖活性.

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斜带石斑鱼2种胰脂肪酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

李观贵，梁旭方，郁颖，黎家成，张海发，王云新

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 85-85~89.

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利用RT-PCR和RACE方法克隆得到斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝胰脏中胆盐活化的胰脂肪酶(bile salt-activated lipase，BSAL)和依赖于辅酶的胰脂肪酶(colipase-dependent pancreatic lipase，PL)基因的全长cDNA序列.BSAL基因全长cDNA序列1 796 bp，编码558个氨基酸，该蛋白序列含有BSAL的全部特征结构区，与其他脊椎动物BSAL的氨基酸序列同源性为49.9%～57.3%.PL基因的全长cDNA序列1 503bp，编码465个氨基酸，该蛋白序列含有PL全部的特征结构区，与其它脊椎动物PL的氨基酸同源性为49.1%～73.9%.系统树分析表明，斜带石斑鱼BSAL和PL与其它物种BSAL、PL和胰脂肪酶相关蛋白(PL-RP)聚于进化树的两个不同分支，属于2种不同的胰脂肪酶.结果证实，在同一鱼类体内也存在BSAL和PL两种胰脂肪酶基因.

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灭活铜绿假单胞菌适体的筛选

曾燕丽，兰小鹏，江丽，刘丰伟，李卫滨

中国生物化学与分子生物学报. 2009, 25(01): 90-90~97.

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利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术，以灭活的铜绿假单胞菌为靶标，从体外合成的96 nt随机ssDNA文库中筛选与铜绿假单胞菌特异结合的适体.在第12轮和第14轮与其它假单胞菌属进行反筛策略，并进行了适体的结合亲和力的测定，再分别利用ClustalX、Mega2和Mfold sever软件分析适体的一级和二级结构.研究结果表明，经过15轮筛选，随机ssDNA文库与铜绿假单胞菌结合的A值从0.022上升到0.448.反筛与未反筛的结合A比值最高比为53倍.经过第15轮反筛后的24个阳性克隆子测序，根据软件分析，其可分成10个家族.每个家族都有其共同的保守序列（除第10个家族），其中有2条序列几乎完全一致(F23和F47)，同源性达到97%，A值分别高达1.598和1.508，Kd为14.55和77.46 nmol/L，间接说明适体与铜绿假单胞菌的结合力明显增高.

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