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• 2021年, 37卷, 第8期
  刊出日期：2021-08-20

    

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  综述
  研究论文
  教育与教学
  
  

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综述
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  不同体液来源外泌体分离鉴定方法评估

  杨建, 廖立, 田卫东

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 989-997. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.03.1508

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  外泌体是细胞分泌的磷脂双分子层胞外囊泡,作为载体在细胞间发挥着物质传递和信息交流的功能。外泌体存在于多种不同体液中,在疾病诊断和药物载体方面具有良好的应用前景。由于外泌体纳米级别的大小和异质性,以及体液复杂的组成,使得体液来源外泌体的分离尤为困难。目前,体液来源外泌体分离有6种常用方法:超速离心法、沉淀法、分子筛色谱层析法、密度梯度离心法、膜超滤法和膜特异性吸附法。每种方法都有其独特的优点与不足,单独使用均难以分离获得高质量的外泌体。不同体液来源外泌体分离方法的选择也存在差异。随着近年来微流控技术等一些新型方法的涌现与经典方法的不断改进,促使外泌体分离技术得到完善,有利于外泌体在临床与科研的相关应用研究。本篇综述对不同体液来源外泌体的提取鉴定方法作出比较及评估,总结了不同体液来源外泌体提取方法的选择和差异,为后续体液外泌体相关研究提供参考。
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  血栓调节蛋白在疾病中的作用

  牛小芸, 谢喜秀

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 998-1004. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.01.1376

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  血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)是一种单链的跨膜糖蛋白质,主要存在于血管内皮细胞中,也可以在造血祖细胞、单核细胞和巨噬细胞中表达。血栓调节蛋白主要由5个结构域组成:发挥抗炎作用的N-端凝集素样结构域、发挥凝血和纤溶作用的6个表皮生长因子样重复序列、富含丝氨酸苏氨酸的区域、跨膜结构域和胞质结构域。血栓调节蛋白可与凝血酶结合激活蛋白C,从而发挥抗炎和抗凝血作用,血栓调节蛋白与凝血酶形成的复合物,也可激活纤溶抑制物从而起到抗纤溶的作用。研究发现,血栓调节蛋白可通过抑制上皮间充质细胞转化、抑制丝裂原活化蛋白激酶或激活蛋白C和纤溶抑制物等3个方面,阻止肿瘤的发生与发展。在动脉粥样硬化中,血栓调节蛋白可阻断凝血酶介导的PAR-1的激活、抑制内皮细胞自噬和凋亡,进而阻止动脉粥样硬化的发生发展。血栓调节蛋白凝集素样结构域还能与凝血酶结合抑制其活性,进而抑制血栓形成、肺纤维化及炎症反应。不仅如此,在糖尿病肾病、子痫前期和缺血再灌注损伤中,血栓调节蛋白均与其发病机制相关。目前,血栓调节蛋白在临床上仅用于治疗败血症和血管内弥散性凝血。血栓调节蛋白在心脑血管疾病、癌症和神经退行性疾病等方面的作用及治疗潜力值得进一步的探究。
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  肿瘤相关成纤维细胞的形成及其在肿瘤发生与发展中的作用

  赵琦, 莫日根, 范丽菲

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1005-1009. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.12.1501

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  肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境的重要细胞组分。CAFs有多种细胞来源,包括常驻成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和上皮细胞等。它们在肿瘤发展的各个阶段都发挥关键作用,能够促进肿瘤的增殖和迁移、促进肿瘤血管生成、调节肿瘤免疫和提高肿瘤耐药性等。因此,是肿瘤靶向治疗中较有前景的发展方向。CAFs通过细胞间接触来调节肿瘤细胞和其他基质细胞的生物学特性,释放出许多调节因子,并合成和重塑细胞外基质,通过这些方式影响癌症的发生和发展。然而,在尝试通过针对CAF进行肿瘤治疗的道路上仍存在许多尚未解决的问题。例如,对CAFs起源和功能异质性的研究仍需要深入探索。本文主要针对CAFs的细胞来源、在肿瘤发展过程中的作用及其靶向治疗进行阐述,这有助于加深人们对CAFs在癌症发展和未来癌症治疗中作用的认识。
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  蛋白质隐态构象

  成细瑶, 李刚, 苏正定

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1010-1016. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.04.1511

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  生物活性蛋白质的结构具有动态特性,存在构象系综,包含常规结构生物学可测定的稳态和常规结构生物学无法测定的隐态构象。隐态构象与稳态构象之间存在着多态平衡,在蛋白质生物学功能上具有重要作用。蛋白质隐态定义起源于蛋白质折叠机制及蛋白质分子动态学研究。在蛋白质构象系综中,蛋白质隐态的含量较少、寿命短及较稳态构象能量高等性质使得隐态难以被捕捉与解析。随着核磁共振波普技术的迅速发展,在实验方法上探索蛋白质动态构象特性逐渐引人瞩目。研究蛋白质隐态构象及蛋白质不同构象之间的相互转变机制,有助于阐明蛋白质分子识别机制,为指导靶向药物设计提供新的理论依据。本文对蛋白质隐态定义进行了溯源,简述了蛋白质隐态的基本性质,探讨了蛋白质隐态对经典分子识别机制“锁匙假说”和“诱导契合假说”发展为“构象选择假说”的贡献。本文进一步简要分析与比较当前结构生物学方法对蛋白质隐态构象分析的优点和缺点,最后对蛋白质隐态研究进行了展望。
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  活性氧对树突状细胞的调控作用

  韦秋羽, 李特特, 陈京涛

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1017-1023. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.01.1513

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  树突状细胞是专职的抗原提呈细胞。未成熟树突状细胞能通过识别抗原而活化为成熟树突状细胞,并将抗原加工后呈递给T淋巴细胞,在启动免疫应答、调节免疫反应和维持免疫耐受中发挥着至关重要的作用。因而,对树突状细胞的免疫功能调控可用于治疗自身免疫性疾病和肿瘤等疾病。随着对树突状细胞的调控作用研究的日益深入,人们逐渐认识到树突状细胞中活性氧的存在有着不容忽视的意义。活性氧是一类具有强氧化性的物质,其产生和清除的动态平衡是维持细胞氧化还原稳态的关键。生理水平的活性氧是参与多种信号通路的重要分子,可调节细胞的生长分化及不同的生理生化反应。活性氧水平的改变会影响细胞的状态与功能。另外,由于胞内产生活性氧的途经较多,不同来源的活性氧对树突状细胞的作用不尽相同;即使是同一来源的活性氧在细胞处于不同状态时发挥的作用也有所不同。本文总结了胞内活性氧的变化及不同来源的活性氧对树突状细胞分化、成熟和功能调控的研究进展,旨在揭示活性氧如何在调控树突状细胞的免疫功能中发挥重要的作用。同时,本文也提出了在活性氧调控树突状细胞功能的深入研究中亟待解决的问题,以期将树突状细胞的免疫调控应用于更广泛的疾病治疗中。
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  水凝胶负载干细胞来源的外泌体用于皮肤伤口修复

  陶苏皖, 朱链, 许娜

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1024-1031. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.02.1492

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  皮肤伤口愈合是临床医学中的难题之一。长期的伤口不愈给患者带来较大的影响,造成巨大的社会经济负担。水凝胶因具有良好的生物相容性、可降解性及可塑性等特点,并具有止血、抗菌和保水的优良性能,被广泛用作皮肤损伤修复敷料。干细胞被认为是组织工程中最具潜力的种子细胞,具有强大的再生修复能力。而干细胞来源的外泌体含有干细胞特有的内含物和膜成分,具有与干细胞相似的修复功能,同时可以避免干细胞治疗可能造成的畸胎瘤、移植物免疫排斥等生物相容性问题,成为无细胞修复的研究热点。然而,外泌体在治疗过程中会面临着清除率高、半衰期较短和规模化制备难度大等问题,限制了外泌体的治疗效果。水凝胶负载干细胞外泌体既可避免外泌体被快速清除,又可同时发挥外泌体和水凝胶促进伤口修复的作用,充分发挥治疗效果,协同促进皮肤修复,在伤口修复研究方面具有潜在的应用价值。本文对外泌体的产生和特点、常用的水凝胶材料、不同来源的干细胞外泌体、外泌体常用提取和鉴定方法、干细胞外泌体在伤口修复的相关作用机制、水凝胶对外泌体的保护和缓释作用,以及水凝胶和外泌体的协同作用进行现阶段研究成果的综述,为今后皮肤修复领域的研究提供参考。
研究论文
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  LPA-LPA₃信号参与调控出生后小鼠的心脏发育

  刘思, 王芳, 裴胜强, 裴建秋, 丛祥凤, 陈曦

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1032-1039. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.06.1270

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  溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是一类结构最简单的生物活性小分子,参与多种细胞的增殖、存活及组织器官的发育。我们前期研究发现,LPA可促进原代大鼠心肌细胞增殖。然而,LPA信号及其受体在心脏发育中的作用仍尚不清晰。为此,首先利用生物信息数据库和实时荧光定量PCR分析了6种LPA受体(LPA₁-LPA₆)的表达情况,发现LPA₃是人和小鼠心脏表达最高的LPA受体,并在小鼠出生后7 d表达到峰值,成年期表达下降。本研究使用LPA₃敲除小鼠探究LPA₃在出生后小鼠心脏发育中的作用。结果发现,LPA₃敲除小鼠出生后1周心肌细胞增殖率显著减少(P＜0.05)。心脏超声和病理结果显示,成年LPA₃敲除小鼠心脏形态和心功能不受影响(P＞0.05),但小鼠心肌细胞代偿性肥大(P＜0.05)。此外,对P7 d小鼠给予心梗损伤发现,LPA₃敲除小鼠心梗后心功能较对照组显著降低(P＜0.05),心肌梗死面积增加(P＜0.05)。综上所述,我们的研究表明,LPA₃调节的LPA信号参与调节出生后早期心脏发育,提示LPA₃可能是治疗心肌损伤的潜在药物靶点。
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  CircHMGCS1激活NF-κB通路并促进宫颈癌细胞增殖和侵袭

  杨彬, 宋鸽, 石立莹, 汤华

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1040-1049. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.05.1066

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  环状RNA(circular RNA,circRNA)在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。本文主要分析在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)诱导下差异表达的circHMGCS1及其在宫颈癌细胞中的作用。RT-qPCR分析发现,TNF-α刺激后circHMGCS1表达明显上调。核糖核酸外切酶处理,半衰期实验确定circHMGCS1的成环性和稳定性后,通过Transwell迁移侵袭实验、MTT、细胞克隆形成检测及蛋白质印迹法发现,circHMGCS1的高表达促进宫颈癌细胞的恶性行为及上皮间充质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)进程。通过Western印迹检测发现,circHMGCS1激活核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号通路。本研究为阐明circHMGCS1在宫颈癌中的作用提供实验依据,并且为宫颈癌的诊断治疗提供潜在生物标志物。
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  CRISPR/Cas9介导的Suds3敲除抑制小鼠胚胎干细胞增殖和中内胚层分化

  董春阳, 王波, 明金, 李陈, 方仕才, 黄依, 刘晶

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1050-1061. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.06.1084

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  胚胎干细胞(ESCs)具有分化为成体各种细胞的能力,其在发育和分化过程中的命运决定受基因表达、表观遗传和胞外信号等多种因素的综合调控。表观遗传调控例如DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化,在ESCs的多能性维持以及分化过程中发挥重要作用。Suds3 (Sin3 histone deacetylase corepressor complex component SDS3)是Sin3组蛋白去乙酰化酶复合物的重要组分之一,在胚胎发育、细胞增殖、染色体分离等生物过程中发挥重要作用,但Suds3在ESCs中的功能例如对ESCs增殖、多能性维持及分化过程中的影响却少有报道。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建了Suds3基因敲除的小鼠胚胎干细胞系,并结合细胞培养、体外拟胚体(embryoid body,EB)形成和体内畸胎瘤形成,CCK-8细胞增殖检测和细胞计数实验对Suds3在ESCs中的功能展开研究。Western印迹结果显示,SUDS3蛋白未表达,成功实现了对Suds3基因的敲除。通过对细胞形态的观察以及实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测多能性基因的表达,发现Suds3的敲除对ESCs多能性的维持无显著影响。拟胚体形成实验发现,拟胚体形成的第4 d和第6 d,Suds3^-/-细胞多能性基因表达并未像野生型细胞一样迅速下调反而提高(^***P<0.001),中胚层和内胚层基因表达量相比野生型显著降低(^***P<0.001),而外胚层基因表达量相比野生型提高(^***P<0.001)。CCK-8增殖检测和细胞计数的结果发现,Suds3的敲除使ESCs的增殖能力受到抑制(^*P<0.05,^***P<0.001)。体内畸胎瘤形成实验和HE染色表明,Suds3敲除抑制了增殖,同时促进外胚层分化,减少了中胚层和内胚层的分化。并且在Suds3^-/-细胞中过表达Suds3可以挽救敲除Suds3引起的ESCs表型变化。本研究成功构建了Suds3敲除的胚胎干细胞系,并表明Suds3的敲除对ESCs多能性的维持无显著影响,抑制ESCs的增殖及促进外胚层分化,限制中胚层和内胚层的分化。上述结果为研究组蛋白乙酰化对ESCs分化及早期胚胎发育的影响提供了新的见解和研究模型,为体外定向分化获取功能性细胞及未来的细胞治疗策略提供了技术参考。
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  窖蛋白-1通过增强氧连接的N-乙酰葡糖胺糖基转移酶表达诱导小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭

  王玲燕, 王语涵, 张程, 陈茜茜, 黄煌, 李文利, 张嘉宁, 刘宇博

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1062-1068. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.05.1024

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  窖蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)是胞膜窖的主要结构和功能蛋白质,参与调控多种细胞信号转导过程。然而,Cav-1调节蛋白质糖基化修饰和肿瘤转移作用机制尚不明确。本研究在小鼠肝癌细胞中证明,Cav-1能够促进蛋白质的氧连接的N-乙酰葡糖胺(O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)糖基化及其O-GlcNAc转移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)的表达,增强了小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭潜能。RT-qPCR 、 Western 印迹和双荧光素酶报告基因结果显示,Cav-1通过下调转录因子RUNX2表达,抑制了miR24的转录(P＜0.05)。随后研究结果表明,miR24能够靶向Ogt mRNA 3′-UTR并抑制其表达(P＜0.05)。这使得Cav-1通过RUNX2/miR24正向调控OGT的表达和O-GlcNAc糖基化,最终导致小鼠肝癌细胞迁移和侵袭潜能增加。这些结果揭示了Cav-1调控糖基转移酶OGT表达和蛋白质O-GlcNAc糖基化的新机制,为肝癌的发生发展机制研究提供了新的理论和实验依据。
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  FGFC1经PI3K/Akt/mTOR途径抑制非小细胞肺癌细胞增殖和迁移

  炎士珂, 冯婧文, 昌娇, 张冰, 段娜敏, 吴文惠, 刘宁

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1069-1077. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.05.1049

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  FGFC1 (Fungi fibrinolytic compound1) 是从海洋长孢葡萄穗霉菌FG216中提取的一类具有良好生物活性的双吲哚化合物。然而,尚未有研究揭示其抗肿瘤活性。本研究探讨了FGFC1对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的作用及其机制。首先,以不同浓度的FGFC1处理人非小细胞肺癌PC9细胞、H1975细胞、结肠癌HCT116细胞、宫颈癌HeLa细胞和正常人肾上皮293T细胞,利用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术,实时PCR和 Western 印迹检测PC9细胞中凋亡相关基因的表达情况;细胞划痕实验和Transwell实验检测PC9细胞的迁移和侵袭能力;通过Western印迹检测信号通路PI3K/Akt/mTOR关键激酶蛋白质的表达情况,观察FGFC1对此信号通路的影响。结果显示,与对照组相比,FGFC1能够选择性抑制 PC9细胞增殖活力,上调促凋亡蛋白质切割胱天蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)与cleaved-PARP的表达,诱导细胞凋亡,且具有剂量依赖性(P<0.05);此外,FGFC1能剂量依赖地降低PC9细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);进一步研究证实,FGFC1同时抑制了PC9细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路关键磷酸激酶蛋白质PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平。研究结果表明,FGFC1可以抑制非小细胞肺癌细胞PC9和H1975的增殖活性;并促进PC9细胞凋亡,抑制其迁移和侵袭。其机制是通过抑制 PI3K/Akt/mTOR信号通路实现的,这将为其应用于非小细胞肺癌的临床治疗提供理论参考。
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  靶向p21蛋白激活激酶2逆转非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药

  黄渊锋, 李盼, 杨明强, 刘浩, 陈丹扬

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1078-1084. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.06.1215

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  靶向突变的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)治疗中显示出越来越重要的作用。然而,不可避免的耐药性的出现极大限制了TKI的临床治疗效果。p21蛋白激活激酶2(p21-activated protein kinase 2,PAK2)是丝/苏氨酸激酶家族的重要成员,在肿瘤发生与发展中发挥重要的作用。本研究拟探讨靶向抑制PAK2逆转非小细胞肺癌吉非替尼耐药的作用及可能机制。首先Western 印迹检测发现,相比非小细胞肺癌吉非替尼敏感细胞HCC827,耐药细胞HCC827/GR中PAK2的蛋白质磷酸化水平显著上调(P < 0.01),而PAK2总蛋白质水平未见明显变化。采用PAK2抑制剂FRAX597和G5555诱导HCC827/GR细胞,MTS及克隆形成结果显示,抑制剂FRAX597和G5555均能显著增加HCC827/GR细胞对吉非替尼的敏感性(P < 0.01)。流式细胞术分析发现,抑制剂FRAX597处理诱导HCC827/GR细胞发生G₂/M期阻滞,并增加吉非替尼诱导的HCC827/GR细胞的凋亡以及切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase 3)表达(P < 0.01)。最后,Western印迹结果显示,抑制剂FRAX597处理能够抑制HCC827/GR细胞BCL-2和CDK4蛋白质表达(P < 0.05),上调BAX、p21和p27蛋白质表达(P < 0.05)。综上所述,PAK2活化与非小细胞肺癌吉非替尼耐药性密切相关;靶向抑制PAK2活化能够诱导细胞周期阻滞及凋亡,从而提高非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。
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  TMED2受miR-5583-5p调控在舌鳞状细胞癌细胞中发挥癌基因作用

  唐清华, 孙学辉, 李洪利, 胡温庭, 胡凯莉, 范欣

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1085-1092. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.05.1018

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  舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)是口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)中最常见类型,其发病率和死亡率都较高。大量研究表明,microRNA(miRNA)是一类小非编码RNA,可调节靶基因的转录后处理,导致靶mRNA的降解及翻译抑制。然而,关于跨膜p24转运蛋白2(transmembrane p24 trafficking protein 2, TMED2)受miR-5583-5p调控对TSCC细胞Cal-27迁移、侵袭、增殖及上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)能力影响尚不明确。本研究利用数据库,分析TMED2高表达头颈部肿瘤(head and neck cancer, HNC)病人愈后不良,在HNSCC组织中的表达升高(P<0.001)。Western 印迹结果表明,在6例TSCC组织及TSCC细胞系SCC-9、SCC-25和Cal-27中,TMED2蛋白质表达量较癌旁组织及口腔正常上皮细胞中上调,转染TMED2干扰质粒(SiTMED2)的Cal-27细胞中TMED2蛋白质表达量降低,E-钙黏着蛋白(E-cadherin)表达上调,而N-钙黏着蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达下调。迁移与侵袭结果发现,转染SiTMED2的Cal-27细胞穿过小室基底膜细胞数量均低于对照组(P<0.05)。EdU结果显示,转染SiTMED2的Cal-27细胞增殖能力降低(P<0.05)。双荧光素酶结果显示,TMED2存在与miR-5583-5p的结合靶点。荧光定量RT-PCR结果显示,miR-5583-5p在Cal-27细胞中表达量较Hoec细胞中下降,转染过表达miR-5583-5p质粒的Cal-27细胞其表达量升高(P<0.05),过表达miR-5583-5p(miR-5583-5p mimics)后TMED2蛋白表达水平降低(P<0.05)。综上所述,TMED2受miR-5583-5p调控促进舌鳞状细胞癌细胞Cal-27迁移、侵袭、增殖及上皮间充质转化的发生。
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  miR-20a通过靶向NR4A3促进前列腺癌细胞增殖

  杨伟玉, 刘驰, 谢辉, 林平, 于晓光

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1093-1099. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.06.1629

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  前列腺癌是男性患者中常见的恶性肿瘤,探讨前列腺癌的发病机制和寻找合适的治疗靶标具有重要的临床意义。来源于类固醇核激素受体超家族NR4A3在多种肿瘤的恶性进展中发挥重要作用,但其在前列腺癌中的作用尚未阐明。本课题拟以前列腺癌细胞为研究对象,揭示NR4A3在前列腺癌中的作用;在此基础上,寻找靶向NR4A3的miRNA,为前列腺癌的诊断和治疗提供新靶点。GEPIA网站预测显示,NR4A3在前列腺癌组织中呈低表达。qRT-PCR检测证实,NR4A3在前列腺癌细胞中也呈低表达(P＜0.01);CCK8和克隆形成的结果显示,过表达NR4A3可使前列腺癌细胞活力显著下降(P＜0.01),集落数量和大小显著减少。生物信息学网站预测,NR4A3可能是miR-20a靶基因。通过qRT-PCR检测发现,miR-20a在前列腺癌细胞中呈高表达(P＜0.01),双荧光素酶报告基因结果证实,miR-20a能够与NR4A3的3’-UTR的2个位点靶向结合(P＜0.05,P＜0.001),且Western印迹结果显示,miR-20a可抑制NR4A3的表达;进一步CCK8检测发现,随着时间的延长miR-20a inhibitor能够使前列腺癌细胞活力显著下降(P＜0.05),miR-20a mimic则得到与之相反的结果(P＜0.05,P＜0.01);而当共转染miR-20a mimic和pcDNA3.1-NR4A3重组质粒时,通过CCK8和克隆形成实验发现,上调NR4A3的表达可部分抵消miR-20a mimic对PC3细胞活力(P＜0.05),集落数量和大小的促进作用。综上所述,miR-20a通过靶向NR4A3促进前列腺癌细胞增殖。
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  体外合成的ABC转运蛋白2 mRNA在小鼠体内表达促进尿酸排泄

  孙忠兴, 葛科立, 张志霞, 贾少平, 张金玉, 葛银林

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1100-1109. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.05.10663

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  高尿酸血症是指嘌呤代谢紊乱尿酸在体内堆积所导致的慢性代谢疾病,近年来其发病率增高且发病年龄呈现年轻化趋势,寻找有效的治疗靶点以及治疗方法是当前研究的热点。尿酸盐转运蛋白ABC转运蛋白2(ATP-binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)主要表达于肾,促进尿酸排泄。本研究通过体外合成ABCG2 mRNA,将其转染至高尿酸血症模型小鼠体内,观察对小鼠尿酸的影响及其相关作用。化学合成ABCG2 mRNA的DNA模板,体外转录mRNA修饰后转染到小鼠肾小管上皮细胞TCMK-1,Western 印迹检测细胞中的蛋白质表达。结果显示,TCMK-1细胞中的蛋白质表达量与mRNA转染量呈正相关(P＜0.01),提示转染成功。动物实验,将24只SPF级小鼠随机分为正常组、高尿酸血症模型组、苯溴马隆治疗组[20 mg/(kg·d)]和mRNA治疗组[2 mg/(kg·3d)],共4组(n=6)。边造模边治疗持续28 d,治疗结束后检测其血尿酸、尿液中尿酸、血肌酐、血尿素氮和肝中黄嘌呤氧化酶指标。结果显示,与模型组小鼠相比,mRNA治疗能显著降低小鼠血尿酸(100.38 ± 10.94)及血尿素氮(6.30 ± 1.10)、肌酐(30.86 ± 5.78)水平(P＜0.05或P＜0.01),升高小鼠尿液尿酸(617.48 ± 50.34)水平(P＜0.05),促进尿酸排泄,对肝中黄嘌呤氧化酶活性(26.19 ± 2.58)无显著影响。HE染色观察小鼠肾病理结构改变。结果显示,与模型组小鼠相比,mRNA治疗组小鼠肾内肾小管细胞水肿、炎细胞浸润等病理损伤得到明显改善。qRT-PCR检测小鼠肾组织mRNA相对表达量,免疫组化、Western 印迹检测小鼠肾ABCG2蛋白质表达水平。结果显示,mRNA组小鼠肾组织中ABCG2 mRNA及其蛋白质相对表达量明显上调(P＜0.01)。综上所述,体外修饰合成的ABCG2 mRNA可以在高尿酸小鼠模型体内成功表达,并促进尿酸及其它有机离子排泄,同时改善小鼠肾损伤。该结果为临床利用ABCG2基因作为治疗高尿酸血症相关疾病的靶点提供了实验依据。
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  低氧暴露经FoxO1介导的蛋白质分解途径降低肌管直径

  付鹏宇, 贾杰, 朱镕鑫, 顾博雅, 龚丽景

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1110-1117. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.05.1689

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  高原/低氧环境诱导骨骼肌萎缩被认为是一个多系统多器官相互作用的结果,但该过程中低氧对肌细胞的直接作用机制并不明确。本研究拟观察低氧暴露对骨骼肌蛋白质分解相关途径蛋白质的影响,并探究低氧影响肌管直径改变的可能机制。将骨骼肌细胞(L6细胞)分化成肌管后,在1%氧浓度下暴露0 h、6 h、12 h和24 h,使用免疫荧光(IF)观察肌球蛋白重链(myosin)水平,计算肌管直径的改变;Western印迹检测肌球蛋白、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、叉头框蛋白O1(FoxO1)、泛素蛋白酶途径(MuRF1和Atrogin1)和自噬溶酶体途径相关蛋白质(p62、Beclin1、LC3)的水平;IF检测LC3并计算积分光密度值(IOD)。结果发现,低氧干预后,6 h和12 h肌管直径显著减小,同时6 h肌球蛋白的水平显著降低(P＜0.05);6 h HIF-1α和FoxO1蛋白质水平显著增加(P＜0.05);与0 h相比,低氧干预各时长MuRF1含量都显著增加(P＜0.05),Atrogin1水平无显著性变化;与0 h相比,低氧干预各时长p62水平均显著降低,6 h Beclin1水平和LC3 IOD值显著升高,LC3Ⅱ/Ⅰ比值在6 h显著增加,在12 h和24 h显著降低(P＜0.05)。本研究提示,低氧暴露(1%氧浓度)诱导L6骨骼肌细胞肌管直径减小,可能机制是HIF-1α调控FoxO1介导的泛素蛋白酶途径和自噬溶酶体途径相关蛋白质造成。
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  使用CRISPR/Cas9技术构建DNMT3A R882H细胞系用于质控急性髓系白血病分子检测

  王宁, 魏亚丽, 安旭, 曹沁梅, 周睿

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1118-1123. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.07.1228

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  对于不同基因位点的突变,急性髓系白血病的发病机制和治疗策略各不相同,因此精准的分子检测在急性髓系白血病的诊断中发挥至关重要的作用。但是目前临床实验室进行分子检测时,缺乏高度模拟病人样本的室内质控品,同时也无完善的外部质量评估系统来评估临床实验室检测结果的正确性。为了提高临床实验室分子检测的正确性和可信度,我们使用CRISPR/ Cas9技术构建DNMT3A(R882H,2645G> A)HEK293T细胞系,以用于急性髓系白血病分子检测的质量控制。同时将单链供体模板中cas9 蛋白识别位点AGG 更换为AGA,以阻止同源重组的细胞系再次被cas9蛋白切割,从而提高同源重组细胞系制作的成功几率。经验证构建成功的DNMT3A(R882H,2645G > A)细胞系能够稳定遗传,同时使用该细胞系DNA提取产物制作的室间质评样本中目的基因的突变频率,在2种Sanger测序仪器和3种高通量测序仪器上得到较好的验证。以上结果表明,制备的DNMT3A(R882H,2645G > A)HEK293T细胞系的DNA提取产物不仅可用作室内质量控制,同时也能作为监控不同厂家、多种平台的室间质评样本,从而提高临床实验室分子检测的准确性和可信度。
教育与教学
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  围绕“科研实例”的知识重构在本科教学中的应用—以生物化学课程为例

  史金铭, 薛哲勇, 王晶英, 许志茹, 李晓岩, 滕春波

  中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(8): 1124-1130. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.05.1021

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  生物化学是生物学相关专业最基础、最重要的专业必修课之一,也是联系基础理化知识和生物学专业知识的重要纽带。掌握扎实的生物化学知识,不仅对于学生进一步学习细胞、遗传和分子生物学等课程打下必要的基础,而且对学生开展科研实践活动提供理论支撑。为更好地使学生掌握这门知识,同时使这门课程能有效支撑学生创新能力和科研素质的培养,教学团队在教学改革中利用学科特色的科研成果服务于本科教学。由于生物化学知识覆盖面非常广泛,学科的科研活动都离不开相关知识的支撑,因此可以在生物化学教学中引入学科特色科研实例,充分发挥案例式教学方法的优势,围绕科研实例总结归纳生物化学知识点。在按章节结构学习的基础上,指导学生围绕科研事件进行生物化学知识网络的重新建构,进而引导学生建立科研思维,使学生了解其所学知识在科研实践中的应用,促进学以致用。此外,充分发挥网络教学的作用,扩充在线资源,促进学生自主学习,培养学生主动获取知识的能力。同时,辅助以翻转课堂的教学手段,培养学生团队协作和沟通表达的能力。通过改革,使生物化学课程成为学科科研成果面向本科基础教学的有效平台。同时,案例引入也赋予课程更多的内涵和实践意义。