吉非替尼是第一代表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI),通过靶向突变型EGFR,在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗中表现出显著疗效。然而,耐药性的出现限制了其长期临床获益。细胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20, CDC20)是调控细胞周期的关键蛋白质,在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用,但其在NSCLC耐药性获得中的调控机制尚未见报道。本研究旨在揭示CDC20驱动非小细胞肺癌吉非替尼耐药的分子机制。通过吉非替尼诱导构建耐药细胞株HCC827/GR(IC₅₀ 0.05 ± 0.01 μmol/L vs 36.24 ± 6.21 μmol/L)和PC9/GR(IC₅₀ 0.02 ± 0.01 μmol/L vs 25.36 ± 5.57 μmol/L)。通过生物信息学技术分析证实,CDC20的转录水平在肺癌样本中呈现表达水平显著上调现象,其异常表达特征与患者总生存期缩短存在明显关联。Western 印迹检测证实,耐药细胞HCC827/GR和PC9/GR中CDC20蛋白水平明显高于亲本细胞(HCC827和PC9)。为深入探究CDC20在非小细胞肺癌吉非替尼耐药中的作用机制,我们首先通过CRISPR/Cas9技术敲除CDC20,发现该干预可显著恢复耐药细胞对吉非替尼的敏感性(IC₅₀ 37.08 ± 6.15 μmol/L vs 10.49 ± 1.83 μmol/L,7.23 ± 1.55 μmol/L),并同时促进细胞凋亡和诱导G₂/M期阻滞。与之相反,过表达CDC20不仅降低敏感细胞的药物敏感性,还能显著抑制吉非替尼诱导的细胞周期阻滞和凋亡。进一步机制研究表明,CDC20敲除可抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化,同时显著上调促凋亡蛋白质截断胱天蛋白酶3和Bax的表达,下调抗凋亡蛋白质Bcl-2的表达。这些结果证实,CDC20通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控非小细胞肺癌吉非替尼耐药,为克服靶向治疗耐药提供了新靶点。

本研究通过整合生物信息学分析与实验验证,系统探讨中胚层发育关键基因在黑色素瘤发生发展中的分子机制。基于基因集变异分析(gene set variation analysis,GSVA)算法对406例皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma,SKCM)患者的7 752项生物功能进行富集分析,发现中胚层发育在黑色素瘤的发生发展中具有重要作用。通过LASSO-COX算法筛选出SMAD4、NODAL、BMPR1A和ZFP36L1共4个核心调控基因,并构建预后相关风险评分体系。基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析显示,这些基因主要富集于mRNA代谢过程和TGF-β信号通路相关通路。通过定量聚合酶链式反应、蛋白质印迹及免疫组化证实:SMAD4和BMPR1A在肿瘤组织中的表达下调与不良预后显著相关(P<0.05);NODAL通过调控上皮-间质转化(EMT)过程促进肿瘤侵袭转移;ZFP36L1高表达组则表现出更好的化疗敏感性。进一步分析发现,核心基因表达水平与肿瘤免疫浸润特征及免疫检查点分子存在显著相关性。本研究通过多组学分析结合实验验证,揭示了中胚层发育相关基因在黑色素瘤进展中的关键作用,阐明了SMAD4/NODAL/BMPR1A/ZFP36L1通过免疫微环境调控和EMT过程影响肿瘤生物学行为的分子机制,为黑色素瘤的分子分型和靶向治疗提供了新的理论依据。

程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)和程序性死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)是一对经典免疫检查点,其相互作用在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。但由于PD-1和PD-L1存在复杂的糖基化修饰,且真核细胞中的PD-1和PD-L1在蛋白质水平的表达量低,限制了靶向二者相互作用的药物筛选及抑制剂的开发。本研究针对二者相互作用的关键结构域,利用金门桥组装(golden gate assembly)无缝克隆技术构建了表达功能性截短体蛋白质PD-1^33-150和PD-L1^19-239的真核载体,并利用HEK-293T细胞系验证了其高效表达。经亲和层析纯化,每升细胞培养基可获得蛋白质纯度＞95% 的PD-1^33-150和PD-L1^19-239蛋白分别为5 mg和3mg。利用生物膜干涉技术(biolayer interferometry,BLI)和流式细胞术(flow cytometry,FCM),我们检测了纯化后PD-1^33-150和PD-L1^19-239的结合动力学参数、平衡常数以及其细胞结合活性。与昆虫细胞和大肠杆菌在蛋白质水平表达的PD-1胞外域相比,哺乳细胞表达的PD-1^33-150对PD-L1的亲和力提高了近24和50倍,同时使结合的解离速率降低至原来的1/400以下,这可能是由于不同的糖基化修饰对PD-1和PD-L1蛋白的相互作用具有重要影响。综上,本研究建立了人源PD-1^33-150/PD-L1^19-239功能性截短体在蛋白质水平的高效表达与纯化平台,为PD-1/PD-L1抗体药物筛选及小分子免疫检查点抑制剂的开发提供了高质量的分子工具。

异黄酮主要分布于豆科植物中,具有丰富的保健功效。异黄酮合成酶(IFS)是一种膜结合细胞色素P450酶(P450),催化独特的芳环迁移和羟基化。到目前为止,研究得到的植物P450酶晶体结构数量有限。通过培养硒代蛋氨酸取代晶体,利用MAD方法测定了蒺藜苜蓿IFS分辨率为1.9 的晶体结构,并进行了分子对接和突变研究。结合咪唑的IFS结构具有Iα螺旋-环-Iβ螺旋基序,与其他P450酶的螺旋I相对应。与常见的P450结构相比,IFS/咪唑复合物结构包含1个额外的结构域,即γ-结构域。IFS/咪唑复合物结构是一种同源二聚体,其中一个分子的γ-结构域与另一个分子的β-结构域发生作用。血红素基团平面与Iα螺旋-环-Iβ螺旋基序形成约40°的夹角。分子对接和突变研究表明,Trp-128和Asp-300可能在底物结合和识别中发挥重要作用。来自Iα螺旋-环-Iβ螺旋基序的Phe-301、Ser-303和Gly-305可能在芳环迁移中发挥重要作用。这些新颖的结构特征揭示了IFS独特的反应机制,为在豆科作物中进行IFS育种工程奠定了基础。

木糖醇脱氢酶(XDH)是能够分解戊糖的酵母和真菌中参与木糖利用的关键酶。除了可以生产木酮糖以外,XDH还可以用于木糖醇浓度检测的生物传感器的开发,具有重要的研究意义。在本研究中,构建了来源于嗜热真菌埃默森篮状菌Talaromyces emersonii的木糖醇脱氢酶(TeXDH)的大肠杆菌表达质粒pF58-TeXDH。TeXDH在16 ℃下以可溶性形式在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。通过使用Ni-NTA亲和柱进行纯化,获得了纯度较高的重组TeXDH。分子排阻层析和SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的重组TeXDH以天然三聚体的形式存在,分子量约为116 kD,由3个相同的亚基组成,每个亚基的分子量约39 kD。TeXDH严格依赖NAD⁺作为辅酶,而不依赖NADP⁺。TeXDH的最适温度和pH值分别为40 ℃和10.0。经过EDTA处理,TeXDH的酶活性降低到起始酶活的43.26%。二价金属离子Mg²⁺或Ca²⁺能够恢复TeXDH的酶活性,分别达到起始酶活的103.32%和110.69%,是TeXDH酶的最佳二价金属离子辅因子。而二价金属离子Mn²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺和Cd²⁺能够显著抑制TeXDH的活性。ICP-MS和分子对接分析表明,1 mol/L的TeXDH结合了2 mol/L的Zn²⁺离子和1 mol/L的Mg²⁺离子。另外,TeXDH对木糖醇具有较好的底物特异性,为未来木糖醇生物传感器的发展奠定了基础。

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)作为儿童最常见的颅外实体肿瘤,其高度恶性特征和不良预后亟待深入研究。近年来,微小RNA(miRNA)作为重要的转录后调控分子,在肿瘤发生发展中发挥关键作用。基于上述背景,本研究将重点关注miR-3910,探讨其在NB细胞系SH-SY5Y中的生物学功能以及其分子调控机制。通过生物信息学分析和转录物组测序技术,我们发现了miR-3910的潜在关键靶分子,从而为NB的精准诊断和有效治疗提供基因靶点。在本研究中,运用qRT-PCR检测转染mimic nc与miR-3910 mimic后的SH-SY5Y细胞中miR-3910表达水平,与nc组相比,mimic组的SH-SY5Y细胞中miR-3910表达显著上调(P < 0.01);采用CCK-8法和细胞划痕试验定量分析miR-3910对细胞增殖与迁移能力的影响,细胞增殖能力在48 h显著提高(P < 0.05),迁移能力在48 h明显增强(P < 0.01);借助流式细胞术测定miR-3910对细胞周期进程的作用,细胞周期进展加速,G₀/G₁期细胞百分数减少(P < 0.01),S期细胞显著增加(P < 0.05)。综合生物信息学分析及高通量转录物组测序技术预测miR-3910过表达后SH-SY5Y细胞中的关键分子变化。经转录物组测序及生物信息学分析,筛选出EIF3CL(EIF3C)、RNF103-CHMP3(VPS24)、SULT1A4(SULT1A4)、CORO7-PAM16(CORO7)、H4C12(Histone H4)、TBC1D3(TBC1D3A/B/C)等6个(别名来自GeneCards数据库)与NB相关基因,且qRT-PCR和Western印迹验证结果与测序结果一致(P < 0.01)。综上所述,miR-3910过表达显著促进SH-SY5Y细胞的增殖、迁移及周期进展,并揭示了一系列潜在的靶向关键分子,为深入理解NB发病机制提供了新视角,为NB的分子靶向治疗提供理论依据和潜在干预靶点。

肾病在我国的发病率一直居高不下,目前,临床主要通过对症治疗来延缓疾病的进展,缺乏经济有效的治疗手段。微RNA在疾病的发生发展中发挥着重要的调控作用,本文旨在探究微RNA-142a-3p(miR-142a-3p)在阿霉素(adriamycin,ADR)诱导肾小管上皮细胞(TCMK-1)损伤过程中的作用、调控机制及其能否成为治疗ADR肾病的潜在靶点。首先,用CCK-8试剂盒检测细胞活性并构建 ADR诱导的小鼠肾小管上皮细胞模型,利用RT-qPCR检测细胞miR-142a-3p及其靶基因ATG16L1的表达情况;蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)检测自噬标志蛋白质和焦亡标志蛋白质表达水平;使用单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)染色并通过流式细胞术检测细胞自噬情况。结果显示,TCMK-1细胞经ADR诱导后miR-142a-3p相对表达量升高,其靶基因ATG16L1相对表达量降低(P<0.0001);WB显示,p62蛋白表达增加(P<0.001),自噬相关蛋白质表达减少(P<0.05),焦亡相关蛋白质表达增加(P<0.001);流式结果显示,ADR组与自噬体抑制剂组(3-MA组)间自噬体平均荧光强度无差别(P>0.05),表明ADR诱导后细胞自噬被抑制和焦亡增强。当转染miR-142a-3p inhibitor抑制miR-142a-3p表达时,靶基因ATG16L1相对表达量恢复(P<0.001);WB显示,p62蛋白减少(P<0.01),自噬相关蛋白至表达恢复(P<0.001),焦亡相关蛋白质表达降低(P<0.01);流式结果显示,细胞自噬得到恢复(P<0.0001)。综上所述,ADR通过miR-142a-3p靶向ATG16L1降低TCMK-1自噬水平,同时激活GSDMD介导的细胞焦亡。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells , MSCs)通过分泌核因子受体激活因子-κB配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(marcrophage CSF,M-CSF)等关键细胞因子来诱导多个单核巨噬细胞融合,形成多核巨噬细胞,从而支持破骨细胞生成。SUMO特异性蛋白酶3(SUMO-specific protease 3,SENP3)通过去SUMO化修饰蛋白质,进而影响底物蛋白质的稳定性、定位和活性。在本实验室前期工作基础上,我们发现在MSC中敲除SENP3的小鼠破骨细胞数量增加(P<0.001),进一步探究其机制,利用免疫荧光以及Western印迹检测发现,SENP3敲除激活刺猬因子(Hedgehog , Hh)信号通路提高了转录因子Gli家族锌指2(glioma-associated oncogene homolog 2,Gli2)的表达。CHIP-qPCR结果显示,Gli2通过结合环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)启动子区域-1 235~-1 249和-1 158~-1 172促进COX2转录(P<0.05);同时通过ELISA法检测COX2主要分泌产物前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的水平,发现敲除SENP3的MSC的培养基上清中PGE2的含量增加 (P<0.001)。已知PGE2通过前列腺素 E受体2(E-type prostanoid receptor 2,EP2)和前列腺素E受体4(E-type prostanoid receptor 4,EP4)介导细胞迁移和破骨细胞生成,在研究中发现,EP4受体在分化的破骨细胞中表达升高(P<0.01)。使用EP4受体的抑制剂能够显著降低活化T细胞核因子(nuclear factor-activated T cell 1 , NFATc1)、组织蛋白酶K(cathepsin K , CTSK)和抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate resistant acid phosphatase , TRAP) 基因的表达,减少破骨细胞生成(P<0.001),结果表明,EP4受体在PGE2介导的破骨细胞分化中发挥关键作用。总之,小鼠间充质干细胞SENP3缺失通过激活Hh信号通路促进COX2转录和PGE2分泌,从而促进破骨细胞形成。

为解析机械敏感性离子通道PIEZO2在骨关节炎(osteoarthritis, OA)中的分子机制,本研究通过构建内源性过表达PIEZO2的慢病毒载体,转染永生化人原代软骨细胞后成功建立稳定高表达PIEZO2的细胞株。首先明确人原代软骨细胞PIEZO2基因座的开放阅读框序列,设计特异性sgRNA序列,基于CRISPR/Cas9-SAM(协同激活调控)系统将转录激活元件定点整合至PIEZO2启动子区。利用慢病毒载体介导的基因靶向整合技术实现PIEZO2内源性过表达。mCherry荧光示踪联合流式分选验证显示,过表达细胞株中PIEZO2蛋白呈现膜特异性定位特征(定位效率78.49%)。qPCR检测证实PIEZO2 mRNA表达水平显著上调约17倍,Western印迹分析进一步佐证其膜定位蛋白质表达量增加。与野生型对照组相比,PIEZO2过表达细胞株呈现典型OA代谢表型:Ⅱ型胶原(Collagen type II alpha 1, COL2A1)mRNA表达下调至基准水平的50%,基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13, MMP13)mRNA表达激增至20倍。综合上述结果显示,PIEZO2过表达细胞株与经周期性机械应力加载(10%应变,0.5 Hz,8 h/d,连续2 d)构建OA模型组的基质代谢表型变化趋势一致。因此,本研究成功建立了人源软骨细胞稳定高表达PIEZO2细胞株,该细胞模型为深入解析PIEZO2介导的机械转导信号网络及靶向药物筛选提供了可靠的研究平台。

微生物诱导碳酸盐沉淀(microbially induced carbonate precipitation, MICP)技术的工程应用受限于脲酶在极端pH下的构象动态调控机制。本研究以巴氏芽孢杆菌脲酶α亚基为对象,结合电导率试验和恒pH分子动力学模拟,系统解析pH 3~11范围内活性位点构象动态及其对催化功能的影响。结果表明,中性条件(pH 7~8)下,关键组氨酸残基(HIS139/HIS249)位移最小(＜0.5 Å),氢键寿命最长(＞8 ps),构象稳定性(均方根偏差,root mean square deviation, RMSD: 0.15~0.18 nm)和催化活性最高(电导率变化率0.03 mS/cm·min^-1,碳酸钙沉淀量3.84 g);极端pH(pH 3/11)导致活性位点构象崩塌(位移达1.8 Å),催化功能丧失。分子动力学模拟揭示,中性环境通过维持活性位点空腔体积(约120 ų)和中等构象相干性(相关系数~0.8)形成质子化依赖的协同变构网络。本研究创新性地阐明pH通过调控质子化状态介导脲酶构象动态的分子机制,为MICP技术在酸性尾矿修复和碱性土壤改良中的应用提供理论指导。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)发病率逐年升高,目前治疗方案主要通过调整饮食结合运动来缓解,缺乏针对性药物。miR-29家族成员(miR-29a、miR-29b、miR-29c)在肝细胞内脂质代谢中发挥重要调控作用,但机制不明。本文旨在鉴定其靶基因及相关信号通路,为NAFLD药物开发提供理论依据。首先,以人源肝细胞系HepG2诱导其脂质积累为模型,分别转染miR-29a/b/c-3p mimics,利用油红O、甘油三酯(TG)检测等发现,miR-29家族成员可显著抑制肝细胞脂质积累(P<0.05);然后,利用qRT-PCR和Western印迹检测成脂标志基因(脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd1))和自噬标志基因(自噬街头蛋白(SQSTM1, 又称p62)、自噬相关蛋白5(Atg5))表达水平,结果表明,miR-29家族成员可显著抑制肝细胞内FAS、ACACA、Scd1和p62基因的表达,同时显著提高Atg5基因的水平;再利用信号通路活性分析和双荧光素酶报告分析等技术,确定miR-29家族成员可抑制mTOR信号通路活性,并与TET蛋白2(TET2)基因存在直接相互作用关系。利用共转染等技术研究miR-29-3p家族成员之间是否存在协同作用,结果发现,与单独转染miR-29家族成员相比,共转染miR-29家族成员能更显著抑制HepG2细胞中脂滴的沉积,并且进一步抑制靶基因TET2的表达。综上所述,miR-29家族成员在肝细胞中可能通过靶基因TET2抑制mTOR信号通路活性,从而降低肝细胞的脂质积累,并且miR-29家族成员之间具有正向协同作用。

P53是关键的肿瘤抑制基因,受到多方面的调控。ZNF148和SP5作为锌指结构的转录因子,在肿瘤的抑制和癌症发生中发挥着重要作用,它们与P53基因之间的调控关系未见报道。本文采用P53表达水平差异的Ishikawa与A549细胞系作为研究模型,探讨ZNF148与SP5对P53基因的转录调控。研究发现,转录因子ZNF148和SP5在细胞系中表达量存在差异,ZNF148在Ishikawa中mRNA表达是A549的1.9倍,SP5在A549中mRNA表达是Ishikawa的802.4倍。通过过表达以及敲低实验发现,在Ishikawa细胞中,ZNF148敲低后P53表达量下降(81.8%),过表达SP5后P53表达量上升(2.6倍);在A549细胞中分别转染si-SP5和ZNF148表达质粒,P53的mRNA表达量上升6.6倍和14.6倍。结果表明,转录因子ZNF148激活而SP5抑制P53的表达。通过生物信息学检索发现,在P53基因启动子的区域具有ZNF148与SP5转录因子结合的保守序列。双荧光素酶报告基因技术数据显示,Ishikawa和A549细胞中过表达ZNF148与对照组相比荧光素酶活性提高了2.1倍和4.2倍(P＜0.05) ;转染SP5质粒与对照组相比荧光素酶活性下降了约77.1% 和35.7% (P＜0.05);而突变了P53基因启动子的ZNF148与SP5的结合位点序列,则该效应消失。进一步转染不同比例的ZNF148与SP5表达质粒,发现SP5可以逆转ZNF148对P53的转录激活作用。研究表明,ZNF148与SP5在P53基因启动子的共有序列,以及二者的比例可能影响P53的转录活性。进一步研究了相关的Wnt通路基因的表达以及敲低ZNF148与SP5后细胞的增值情况,观察2转录因子在肿瘤中的作用。综上,ZNF148与SP5共同调控P53基因的转录活性,二者的表达水平有可能是影响P53基因活性的关键因子。

甘草酸(glycyrrhizic acid)是甘草(glycyrrhiza)中重要活性成分之一,具有护肝和抗病毒等功效。鲨烯环氧酶(squalene epoxidase, SQE)是甘草酸合成途径中的重要酶。目前,系统分析甘草中SQE基因家族及其功能的研究较少。本研究通过对甘草SQE基因家族生物信息学、表达特异性及与甘草酸含量相关分析,了解SQE基因家族在甘草酸合成中的作用。结果显示:3种药用甘草共有11个SQE基因,其中光果甘草(Glycyrrhiza glabra)和胀果甘草(Glycyrrhiza inflata)均有4个,乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)有3个,同源性高的SQE基因具有相似的表达特性且染色体上处于相似位点;不同的SQE基因呈现不同的表达特性;GgSQE1、GiSQE1、GuSQE1和GuSQE3主要在根部表达,GgSQE3在甘草全株高表达;在苗期不同种类的甘草受15% PEG6000和150 mmol/L NaCl处理不同时间点下,GgSQE1、GgSQE3、GiSQE1、GiSQE3和GuSQE1表达量变化与甘草酸含量变化具有相似的趋势;进一步分析发现,上述基因的启动子区含有较多的逆境胁迫响应元件,推测SQE1 和SQE3可能在甘草受非生物胁迫后参与甘草酸的合成。本研究的结果为下一步高甘草酸含量的育种研究提供候选基因,为深入了解非生物胁迫提升甘草酸含量的分子机制研究提供研究基础。

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最严重的并发症之一,是终末期肾病的主要原因。DN患者的病理机制与长期血糖控制不佳密切相关,持续高血糖状态通过诱导肾内氧化应激反应,引发足细胞损伤及肾小管间质炎症浸润,进而导致蛋白尿、肾小球硬化和纤维化等不可逆肾损伤。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)因其良好的抗氧化应激作用有望为DN提供新的解决方案。本研究建立了DN小鼠模型,通过尾静脉注射hUC-MSCs (1×10⁶ /只)来达到治疗DN的目的。空腹血糖和腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)数据显示,hUC-MSCs能显著降低DN小鼠的空腹血糖水平(22.5 ± 3.0 vs 14.7 ± 1.1,P < 0.01)并提高其血糖调节能力(P < 0.05)。同时,DN小鼠经hUC-MSCs治疗后肾功能得到改善并且氧化应激产物水平下降,例如尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、尿肌酐(urinary creatinine, Ucr)、尿蛋白(urinary protein, PRO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的水平均显著降低(P < 0.05)。通过苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining, H&E)染色、糖原(periodic acid-schiff stain, PAS)染色和天狼星红染色对肾组织形态学进行分析,经hUC-MSCs治疗后DN小鼠的肾小球间质增生、肾小球肥大和肾小管炎性间质浸润等病理状态均得到减轻。免疫组化、Real-time RT-PCR和免疫印迹等结果显示,hUC-MSCs治疗可降低氧化应激主要相关蛋白酶NADPH 氧化酶 4(NADPH oxidase 4,NOX4)和硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)的表达(P < 0.05),减少活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生。同时,在体外实验中选择人肾皮质近曲小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cells,HK-2 cells)进行验证,使用高糖处理,采用hUC-MSCs 的条件培养基(mesenchymal stem cell-conditioned medium,MSC-CM)进行处理,免疫印迹结果显示,NOX4和TXNIP的表达都得到抑制(P < 0.05),ROS表达降低。综上,hUC-MSCs治疗可以降低DN小鼠的血糖水平,改善肾功能下降以及病理损伤,其作用可能与下调NOX 4的表达从而抑制TXNIP介导的氧化应激有关。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)早期难以发现且现有治疗方法副作用大、易产生耐药性。本文旨在探讨藻蓝蛋白(phycocyanin, PC)对人肝癌细胞系HepG2凋亡的影响及潜在的作用机制。研究利用0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL PC分别处理HepG2细胞12 h,10 μg/mL PC和2.5 μmol/L Wip1抑制剂(Wip1i)GSK 2830371单独以及联合处理HepG2细胞12 h和24 h,以CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒检测细胞增殖水平;采用Annexin V-FITC/Propidium Iodide双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡水平;应用TMT蛋白质定量技术分析蛋白质组学的差异表达情况;Western印迹检测细胞Wip1、p53和磷酸化-p53(Ser15)蛋白质表达水平。CCK-8结果显示,PC在一定浓度范围内能够有效抑制HepG2细胞增殖,且具有浓度依赖性,其半数抑制浓度为19.37 μg/mL。流式细胞术结果显示,PC能够显著诱导细胞凋亡,凋亡率为30.40%。定量蛋白质组学分析显示,PC能够诱导p53通路活化。CCK-8结果显示,Wip1i能够增强PC对HepG2细胞的杀伤作用。利用Western印迹分析发现,PC抑制Wip1表达,诱导p53蛋白磷酸化,促进p53总蛋白质表达。同时,Wip1i能够进一步促进PC活化p53通路,增加p53和pP53(S15)的表达。综上所述,PC可能通过抑制p53负调节因子Wip1的活性,进而通过Wip1/p53通路诱导细胞凋亡。

胶原蛋白是动物体内各种组织维持其功能所必需的基质蛋白质,脊椎动物中有多种类型,每种类型的胶原蛋白在体内的功能与其序列和结构均有着密切联系。在天然胶原中,除了普遍的 Gly-X-Y 氨基酸序列,也存在一种特殊结构 Gly-Gly-Y,为了探究其对胶原的影响,本研究依次在胶原多肽、长链胶原、胶原高聚物层次上构建含有 Gly-Gly-Y 的突变体,通过圆二色谱扫描表征突变前后胶原的热稳定性。同时,采用分子动力学模拟计算胶原多肽的氢键成键概率以及弯曲度,解释胶原稳定性和柔性变化的分子机制。结果显示,含有 Gly-Gly 结构的突变体会降低样品的 Tm 值,但随着胶原三螺旋区域的加长以及蛋白质自组装程度的加强,这种影响会逐渐减弱,降低的 Tm 值分别为 5℃、3℃和1℃。同时,模拟结果显示,含有 Gly-Gly 结构的多肽弯曲度也有一定增加,表明突变位点附近结构有更强的灵活性。这为具有一定柔性的胶原材料的设计提供了新思路。

我国肺癌发病率和致死率均高居各种恶性肿瘤首位,严重威胁我国居民生命和健康。二甲双胍作为糖尿病治疗药物,已有报道其抑制多种类型肿瘤细胞增殖活性,但其分子制尚不清楚。受体相互作用蛋白1(Receptor-interacting protein 1,RIP1)在细胞生存和死亡调控过程中均发挥重要作用,RIP1在多种类型肿瘤中表达异常,并与肿瘤患者不良预后相关。本研究旨在探讨RIP1在二甲双胍抑制肺癌细胞活性中的作用。二甲双胍以浓度梯度依赖方式抑制肺癌细胞增殖活性,并诱导细胞凋亡(A549, 8.81%, 11.49%, 36.0%, 45.0%; H460, 1.47%, 14.45%, 50.1%, 88.6%)。机制研究表明, 二甲双胍显著下调RIP1蛋白质水平表达,但几乎并未影响其转录及泛素化修饰。二甲双胍抑制RIP1上游调控因子热激蛋白70(heat shock protein70,Hsp70)表达,免疫共沉淀结果表明, 内源性Hsp70与RIP1相互作用,免疫荧光染色结果证实,Hsp70与RIP1存在共定位。后续CCK8、流式细胞术和蛋白免疫印迹结果表明,二甲双胍通过AMPK/PKA/GSK-3β信号轴调控Hsp70/RIP1表达。裸鼠移植瘤模型结果同样表明,二甲双胍抑制肺癌细胞体内增殖。本研究探明RIP1在二甲双胍抗肿瘤活性中的作用,为肺癌治疗提供了新思路。

钾钙激活通道亚家族 N 成员 3 ( potassium-calcium activates channel subfamily N member 3, KCNN3/SK3/ KCa2.3)参与调节细胞钙信号,参与肌肉收缩和神经递质释放。KCNN3通道的失调与多种肿瘤的发生有关。本文通过生物信息学分析鉴定KCNN3是否可以作为预后靶点影响胃腺癌(gastric adenocarcinoma,STAD)的发生和发展。通过分析HPA数据库以及TCGA数据库,发现KCNN3的蛋白质和mRNA水平在STAD中显著降低,并通过TCGA数据库验证KCNN3与STAD的预后和临床特征显著相关。此外,本文发现KCNN3在STAD中的高表达显著降低STAD细胞中肿瘤药物的IC₅₀,表明KCNN3的高表达与STAD对肿瘤药物的敏感性显著相关。为了研究潜在的生物学功能,本文发现了一个KCNN3潜在的相互作用因子,肿瘤坏死因子受体超家族成员7 (CD27/TNFRSF7),它在STAD中低水平表达。通过RT-qPCR,Western 印迹结果证实,KCNN3与CD27在蛋白质和mRNA水平上正相关,并且通过co-IP和IF实验验证两者有相互作用,且较好地共定位于细胞质中。此外,本文通过皮下成瘤以及细胞功能实验,在体外和体内水平上证实了KCNN3对人STAD细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。并且通过GO/KEGG富集分析发现,KCNN3在免疫反应调节和钙或金属离子运输的信号通路中富集。通过细胞共培养,RT-qPCR以及CCK8实验验证了,KCNN3高表达可以促进T细胞活化因子的增加,且能促进T细胞对STAD细胞的杀伤作用。因此,我们的研究结果可能阐明KCNN3是影响STAD发生发展的潜在抑制因子。

对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建3个糖基转移酶共同表达的打靶载体,分别是β1,4半乳糖基转移酶(B4GALT1)、α-2,6-唾液酸转移酶 1 (ST6GAL1)和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ(GnTⅢ),并利用重组酶介导的盒式交换技术(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE)将3个糖基转基因酶基因定点整合到CHO Rosa26位点中。PCR证实了3个糖基转移酶成功定点整合Rosa26位点,qRT-PCR证实3个糖基转移酶的mRNA表达水平均在50 000倍以上,蛋白质免疫印迹法证实3个糖基转移酶的蛋白质表达水平均在4倍以上(P<0.001)。成功构建了Rosa26位点定点整合3个糖基转移酶的CHO工程细胞株。

为了探究高盐对需盐枝芽胞杆菌(Virgibacillus salexigens)合成5-HE代谢通路影响及调控机制,在菌株V. salexigens培养基中分别添加1.5和2.5 mol/L NaCl作为对照组和实验组。利用HPLC检测5-HE的合成量差异,采用转录物组学和代谢组学技术分析V. salexigens在不同盐浓度下的差异基因和差异代谢物,并用qRT-PCR验证与5-HE合成密切相关的差异基因。结果显示,当NaCl浓度为2.5 mol/L时,5-HE合成量达到最大,为121.9 mg/L;转录物组测得652个差异基因(涉及348个KEGG通路),其中上调基因210个,下调基因442个,主要富集在嘌呤代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、硫代谢和生物素代谢等通路。qRT-PCR验证结果显示,与5-HE合成相关的13个基因(lysC、asd、ectA、ectB、ectC、ectD、thrB、thrC、ilvA、ilvE、AGXT、YckA和GlnQ)表达量与转录物组测序数据的趋势一致;代谢组学分析共鉴定到1153个代谢物,主要富集在组氨酸代谢、赖氨酸的降解以及精氨酸和脯氨酸的代谢等通路。本研究初步阐明了高盐胁迫对5-HE合成通路的影响,为后续构建5-HE高产菌株提供了参考依据。

紫杉醇(paclitaxel,PTX)是乳腺癌的一线化疗药物,但其引发的耐药问题严重影响临床治疗效果。岩藻糖基化特别是核心岩藻糖基化与肿瘤化疗耐药现象密切相关,导致患者化疗效果不佳以及预后不良。本研究基于核心岩藻糖基化修饰功能,进而探讨岩藻糖基化抑制剂2-F-Fuc对人乳腺癌紫杉醇耐药MCF-7/PTX细胞化疗增敏的作用及其机制。通过MTT法确定MCF-7/PTX细胞的耐药指数(RI)为8.49;Western印迹、Real time-PCR实验、ELISA法和LCA凝集素印记法证明与MCF-7亲本细胞相比,MCF-7/PTX细胞中FUT8、MDR1和核心岩藻糖基化水平均呈高表达;Western印迹结果证明,2-F-Fuc对MCF-7/PTX细胞具有显著生长抑制作用,且2-F-Fuc处理后FUT8和MDR1表达水平显著下调,PTX与2-F-Fuc联合用药组下调更为明显(P＜0.05);与对照组相比,PTX组和2-F-Fuc组MCF-7/PTX细胞PCNA表达下调,凋亡相关蛋白质切割胱天蛋白酶3(Cleaved caspase-3)和Bax/Bcl-2比值升高;p-PI3K和p-AKT表达水平均下调,且2-F-Fuc与PTX合用组变化更为明显(P＜0.05)。以上研究结果表明,MCF-7/PTX细胞的核心岩藻糖基化水平显著增高,2-F-Fuc可通过抑制FUT8表达,降低MCF-7/PTX细胞核心岩藻糖基化水平,而增强耐药细胞对PTX的敏感性,其机制可能与下调PI3K/AKT信号通路蛋白质有关。

该文以黄颡鱼为研究对象,采用双荧光素酶报告实验和凝胶阻滞实验对启动子活性进行分析,同时结合活体养殖实验,探讨去SUMO化修饰关键基因senp8启动子的功能及其与脂质代谢的关系。结果显示,2 045 bp序列的senp8启动子序列上有SP1、TATA-Box、CCAAT-Box、SREBP1、PPARα和PPARγ等关键转录因子结合位点;发现senp8启动子中SREBP1(-901/-910 bp)、PPARα(-1 291/-1 308 bp)和PPARγ(-1 292/-1 306 bp)的结合位点正向调控其活性,且油酸或棕榈酸促进这种结合。同时,高脂饲养促进黄颡鱼肝中senp8基因及其蛋白质表达,油酸或棕榈酸处理显著增强了senp8启动子的活性,且这种增强效应可以通过SREBP1、PPARα和PPARγ这些响应元件的调控作用来实现。此外,高脂饲喂能够影响黄颡鱼肝中去SUMO化修饰相关基因的mRNA和蛋白质表达水平。本研究为理解去SUMO化修饰与脂质代谢调控的关系提供新的见解。

越来越多的研究表明,环状RNA在心肌纤维化中发挥重要调节作用。人环状RNA表达谱芯片检测结果提示,环状RNA circHERC4_041在心衰患者心肌中表达增加,RT-qPCR验证发现,与健康器官捐献者(n=18)心肌组织相比,心衰患者(n=19)中circHERC4_041的表达显著升高。荧光原位杂交(FISH)检测证实,circHERC4_041在人心肌细胞AC16胞质中丰富存在。利用腺病毒介导在小鼠心肌成纤维细胞(mCFs)中过表达circHERC4_041可抑制 mCFs中纤维化相关蛋白质表达。细胞增殖检测实验、细胞划痕和Transwell实验结果显示,过表达circHERC4_041时,mCFs 的增殖和迁移能力被抑制(P<0.001)。序列分析提示,circHERC4_041包含潜在的核糖体进入序列和开放阅读框,蛋白质免疫印迹检测证实,circHERC4_041可翻译516个氨基酸的HERC4-516aa蛋白质,其主要定位于细胞胞质中。细胞功能实验证实,circHERC4_041通过特异翻译HERC4-516aa来抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型(P<0.05)。通过IP-MS筛选和Co-IP鉴定证实,HERC4-516aa与转谷氨酰胺酶2 (TGM2)具有特异的相互结合作用,并通过蛋白酶体途径促进TGM2降解。而利用腺病毒介导在mCFs中过表达TGM2可逆转HERC4-516aa对mCFs纤维化表型的抑制作用。本文证实,circHERC4_041翻译的HERC4-516aa蛋白质通过与TGM2相互作用,有效抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型。

蛋白质-蛋白质相互作用在细胞的生化功能中扮演极为重要的角色,深入解析蛋白质相互作用关系是理解细胞生命活动的关键。本研究以高尔基体蛋白73(golgi protein 73, GP73)为研究对象,利用经典的免疫共沉淀联合质谱技术系统挖掘了GP73的相互作用蛋白质,力求进一步解析GP73的分子功能。选取肝癌细胞系HepG2,利用慢病毒感染技术构建过表达GP73-3Flag的稳定细胞系,免疫共沉淀联合质谱检测鉴定出78个高置信的GP73相互作用蛋白质,生物信息学分析提示,GP73与近40个细胞核蛋白质存在相互作用,并参与RNA运输、剪接和翻译等生物学过程,进一步的免疫荧光和细胞核蛋白质分离实验证实,GP73在多种肿瘤细胞中的细胞核定位,在78个相互作用蛋白质的基础上进一步筛选出与mRNA剪接相关的蛋白质相互作用网络,并通过免疫共沉淀验证了GP73与HNRNPH3、SMN1、RBM14、NCBP1等7种蛋白质存在相互作用。Minigene剪接实验提示,过表达GP73抑制细胞对pre-mRNA的剪接效率。本研究拓展了对GP73蛋白功能的认识和理解,有助于解释其在细胞生物学中的重要角色及其与疾病的潜在关联。

Zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)是一个组蛋白甲基转移酶,与SUZ12和EED等组成多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex 2, PRC2),对组蛋白H3的27位赖氨酸进行三甲基化修饰,介导下游基因表观沉默。其与细胞增殖、心血管发育关系密切,但EZH2在心血管终末分化中的表达变化尚不清楚。本研究通过GEO数据库筛选胚胎及成体心肌细胞中基因的表达差异,发现EZH2在胚胎心肌细胞高表达,在成体心肌中表达极低(P<0.0001);而PRC2成员SUZ12和EED的表达变化不够显著。通过Tabula Muris数据库在线分析显示,成体小鼠心组织各细胞亚群在生理状态下几乎不表达EZH2。对小鼠心组织进行免疫组化染色,发现在小鼠的胚胎期和初生期心肌组织中,EZH2表达水平较高,但在出生后的第1 d表达量开始逐渐下降(P<0.0001),到第3 d几乎消失不表达。蛋白质免疫印迹结果进一步验证,发现EZH2在出生后表达迅速消失(P<0.05),EZH1可弥补EZH2下调,维持H3K27me3修饰水平。本研究进一步采用畸胎瘤干细胞P19细胞心肌诱导分化模型,发现EZH2在心肌前体细胞向自发搏动的心肌细胞分化过程中显著高表达,与心肌转录因子Gata4表达同步(P<0.01)。通过小分子药物MS1943靶向降解EZH2,Edu掺入实验显示,其显著抑制了诱导分化中心肌细胞的增殖(P<0.01),同时RT-qPCR检测显示,增殖抑制因子CDKN1A的表达显著升高(P<0.01)。总体而言,EZH2在胚胎发育中心肌细胞中的高表达,与促进细胞增殖相关。在出生后短时间内,EZH2表达快速丧失,与心肌细胞失去增殖能力相关,是心肌终末分化的标志之一。

AKT,又称为蛋白质激酶B(protein kinase B, PKB),在细胞增殖和代谢过程中发挥关键作用。AKT有3种亚型:AKT1、AKT2和AKT3,这3种亚型对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)多能性和分化的影响尚不明确。本研究旨在探讨AKT亚型缺失对小鼠胚胎干细胞自我更新和分化的影响。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立AKT的3种亚型基因敲除的细胞系,通过蛋白质印迹(Western blot)、流式细胞术、qRT-PCR、CCK-8、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)染色和RNA-seq对其表型和分子变化进行分析。Akt的3种亚型基因敲除的细胞系构建成功,Akt1和Akt2的缺失会抑制小鼠胚胎干细胞的增殖,Akt任意一种亚型的缺失不会影响多能性基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达,但在拟胚体形成过程中,Akt的3种亚型的缺失均会影响3个胚层基因的mRNA水平表达。转录物组分析结果表明,与野生型mESCs相比,Akt1、Akt2和Akt3缺失后分别有995、547和429个差异表达基因(|log2FC|≧1, P<0.05),这3种亚型调控的差异表达基因存在部分重叠。综上,Akt的3种亚型的独立缺失不影响小鼠胚胎干细胞干性的维持,但是他们对于分化至关重要。Akt的3种亚型可以共同调控基因的表达,同时也保留了各自的调控特异性。本研究为理解Akt的3种亚型在干细胞生物学中的独特和重叠作用提供了基础,突显了它们在维持干细胞功能和分化中的重要性。

代谢重编程是癌症的重要特征之一,其中氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)代谢作为细胞获取能量的主要生化过程,对肿瘤发生和发展有着重要影响。本研究旨在探究肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC)的代谢特征对肿瘤恶性特征的作用。通过分析基因表达谱数据库中LUSC、肺腺癌和正常肺组织的单细胞转录物组测序数据,发现OXPHOS信号通路以及ATP合成相关分子在LUSC组织中显著富集。基于OXPHOS信号强度评分,将LUSC分为OXPHOS^high和OXPHOS^low两组。生物信息学分析显示,126个转录因子在LUSC肿瘤组织和OXPHOS^high组中均呈现高表达水平,其中肿瘤干细胞相关信号(例如SOX2、SOX9、 POU2F1、CDX1、ARID3A、EZH2和KLF5等)在OXPHOS^high细胞亚群中的表达水平明显增强(P <0.05)。使用OXPHO拮抗剂处理LUSC细胞后,H520和SKMES-1细胞的球体形成率这一重要的干性特征受到显著抑制(P <0.05)。对于LUSC单细胞转录物组细胞间通讯数据的分析表明,OXPHOS^high发出及接受的信号强于OXPHOS^low细胞亚群,且成纤维细胞对于OXPHOS^high-LUSC细胞之间存在明显的交互作用。将LUSC细胞系H520和SKMES-1与人肺成纤维样细胞系共培养,肿瘤细胞球体形成率显著提高(P <0.05)。同时,共培养的H520和SKMES-1细胞的ATP、NADH活性酶和活性氧(ROS)水平也显著升高(P <0.05)。研究结果证实,OXPHOS通路是参与LUSC代谢的关键信号,与肿瘤干性细胞特性以及成纤维细胞相互作用信号调节相关,有望为肿瘤治疗提供新的策略。

海洋在全球碳循环中发挥着关键作用,基于“双碳”目标的提出,海洋碳汇受到广泛关注。贝类养殖是形成渔业碳汇的重要来源之一,对近海的碳循环过程产生着重要影响;随着全球温度的升高,海洋酸化现象的加剧,海洋吸收CO₂的能力将会发生改变。但是,高温对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)碳代谢相关的生理和转录物组的影响不够清晰。本实验主要研究高温对厚壳贻贝总碳含量、碳代谢、抗氧化相关的酶活性以及转录物组的影响。结果表明,高温显著抑制己糖激酶和丙酮酸激酶的活性,而碳酸酐酶的活性增加(P＜0.05),降低了消化腺ATP含量(P＜0.05),影响了糖酵解和三羧酸循环,导致贻贝固碳能力显著下降。高温导致活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性都显著增加(P＜0.05)。透射电镜的观察结果显示,高温损伤了厚壳贻贝消化腺的亚细胞结构,使核仁缩小,内质网肿胀,线粒体嵴显著减少。比较转录物组学分析结果显示,高温处理下上调的差异表达基因主要富集在内质网的蛋白质加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、抗原的处理和呈递(antigen processing and presentation)以及MAPK信号途径(MAPK signaling pathway)等通路;下调的差异表达基因主要富集于细胞坏死(necroptosis)、DNA复制(DNA replication)和NF-kappa B 信号途径(NF kappa B signaling pathway)等通路。抗氧化相关差异基因中,上调差异基因主要有维生素K环氧化物还原酶、过氧化物酶、热休克105 kD蛋白、热休克70 kD蛋白和超氧化物歧化酶等;下调差异表达基因主要包括NADPH氧化酶、谷胱甘肽还原酶、细胞色素b-245、细胞色素P450和醌氧化还原酶等。富集于碳代谢通路的上调基因主要包括转几丁质酶、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、半乳糖激酶和三磷酸肌醇3-激酶等;下调基因主要包括醛糖-1-差向异构酶、碳酸酐酶、半乳糖变位酶、酰基辅酶A合成酶、乙醇脱氢酶和己糖激酶等。综上,高温对厚壳贻贝的固碳相关的酶活性和碳代谢相关基因的表达具有一定的抑制作用。本研究的结果以期为贻贝养殖的健康发展和碳汇的评估提供科学依据。

组成型光形态建成9信号复合体的5B亚基(subunit 5B of constitutively photomorphogenic 9 signalosome, CSN5B)是植物中L-半乳糖途径合成维生素C的抑制因子。为了获得高维生素C番茄突变体,本文构建双靶点载体pKSE402-SlCSN5B并对番茄育种亲本“1912”进行了遗传转化。通过分子生物学鉴定和DNA序列分析,17株转基因阳性植株中6株发生编辑,编辑效率为35.3%;其中csn5b-6和csn5b-8为纯合突变体,分别缺失了180 bp和3 bp。对这2种缺失纯合体T₁代中无外源T-DNA插入的株系分别进行生物学观测,在植株和果实的表型上无明显差异;在果实红熟期,对其进行生理指标测定,csn5b-6的T₁代株系在GMPase活力、维生素C和过氧化氢含量变化显著,分别比野生型提高43%、37.8%和降低25.9%,而可溶性固形物含量无明显差异;csn5b-8的T₁代株系与野生型一致。采用基因表达分析和蛋白质结构预测发现,csn5b-6-11中SlCSN5B基因表达量正常,但其编码的蛋白质由于较大的肽段丢失引起结构的改变,从而影响其功能,这可能是引起维生素C含量提高的原因。以上结果表明,利用CRISPR/Cas9技术编辑SlCSN5B基因可以提高番茄果实中维生素C的含量,为后续培育优质番茄新品种提供材料。

植物外泌体样纳米囊泡是指从植物中分离的含有脂质、蛋白质、RNA和各种小分子的球状脂质囊泡,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化和药物载体等方面功效,然而黄精衍生的纳米囊泡的功能尚未见报道。本文利用超速离心和密度梯度离心,首次从黄精中获得了外泌体样纳米囊泡(rhizoma polygonati exosome-like nanovesicles, RP-EVs),并对其表征和抗炎功能进行探究。结果:RP-EVs是主要带负电荷,平均粒径为166.5±3.3 nm的球状脂质囊泡。细胞摄取实验显示,RP-EVs可以被巨噬细胞吞噬。qPCR以及ELISA研究表明,RP-EVs可以抑制脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)刺激引起的白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) (^****P<0.0001)的升高。不仅如此,活性氧(reactive oxygen species, ROS)及DPPH清除实验证实,RP-EVs具有一定的抗氧化功能(^*P<0.05)。进一步探究其机制,利用免疫荧光以及Western印迹检测发现,RP-EVs是通过IκBα/NF-κB信号通路抑制细胞核因子p65(nuclear factor kappa-B p65, NF-κB p65)的入核转运(^**P<0.01)及磷酸化(^***P<0.001),进而调控炎症因子表达。经动物实验,将RP-EVs腹腔注射至小鼠体内48 h,主要定位于小鼠的肝和脾。最后,利用腹腔注射LPS构建小鼠急性炎症模型,通过qPCR以及ELISA法检测炎症因子水平,发现RP-EVs可以缓解LPS引起的小鼠血清和脾中的炎症因子的表达(^*P<0.05)。总之,本论文首次分离获得了RP-EVs,并揭示了其抗炎功能和潜在的机制,将为中药来源的纳米囊泡的功能探究提供一定的参考,为炎症性相关疾病的治疗提供新的策略。

苦瓜抗病毒蛋白(momordica antiviral protein,MAP30)是一种大小为30 kD的I型核糖体失活蛋白质(ribosome-inactivating protein,RIP),具有抗菌、抗HIV和抗肿瘤活性,但缺乏对肿瘤细胞的靶向性。为了增加其肿瘤靶向性,将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(arginine-glycine-aspartic peptide,RGD)和表皮生长因子受体干扰肽(epidermal growth factor receptor interference peptide,EGFRi)与MAP30融合,命名为ELRL-MAP30。缺乏雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PgR)和人表皮生长因子受体-2 (human epidermal growth factor receptor-2,HER2)表达的三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC) MDA-MB-231细胞由于缺乏靶向性而在临床治疗中受到限制。本研究主要探讨ELRL-MAP30对 MDA-MB-231细胞的靶向作用及其机制。首先,我们发现ELRL-MAP30能显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭,并诱导MDA-MB-231细胞凋亡。ELRL-MAP30处理后显著降低Bcl-2在蛋白质的表达水平,而BAX蛋白的表达水平增加。同时,ELRL-MAP30通过Fak / EGFR / Erk和Ilk / Akt信号通路诱导细胞凋亡。此外,重组ELRL-MAP30还可以抑制鸡胚血管生成,并且抑制HUVECs细胞的成管能力,表明其对肿瘤血管生成具有潜在的治疗作用。总之,这些结果表明,ELRL-MAP30在针对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中具有显著的肿瘤靶向性,并显示出对血管生成的潜在治疗作用。这些研究表明,ELRL-MAP30在靶向治疗TNBC细胞MDA-MB-231中具有潜在作用。

线粒体是真核细胞的细胞器,是细胞能量代谢、氧化应激、热量生成以及信号转导的重要场所。线粒体移植(mitochondrial transplantation, MT)是目前治疗线粒体功能障碍及抗衰老研究最为前沿的技术手段。本研究将牦牛(Bos grunniens)、普通牛(Bos taurus)和马(Equus caballus)的线粒体移植至小鼠(Mus musculus),旨在探究异种线粒体移植的可行性及作用效果。研究结果显示,通过共聚焦成像、数字PCR及DNA测序检测到牦牛、普通牛和马的线粒体能够移植至小鼠体内,并在小鼠广泛的组织、器官中至少可维持14 d。MT小鼠产生了积极的生物学效应,包括提高ATP含量和线粒体DNA拷贝数(P<0.05), 其效应可维持到14 d,并在第7 d达到最大值。MT小鼠活性氧(ROS)水平表现为初期(注射2 h)显著上升(P<0.05),在第7 d和第14 d逐渐下降至接近对照组水平(P>0.05)。研究结果支持了异种线粒体移植的有效性,并表明其效果可以维持至14 d。本研究为未来的临床应用提供了科学依据。

盐池滩羊是我国宁夏特产,凭借极佳肉质驰名中外,但目前仍不清楚其肌肉发育和肉质形成的详细机制。为初步探究滩羊肌肉发育中独有的分子机制,本研究以6月龄和12月龄雌性滩羊为研究对象,采集其背最长肌(longissimus dorsi muscle, LDM)样品,通过转录物组测序(transcriptome sequencing, RNA-seq)筛选出可能在调控滩羊肌肉发育和肉质形成方面发挥重要作用的基因和长非编码 RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。结果表明,两组LDM间共有504条 mRNA和1 483条 lncRNA差异显著(P<0.05),还预测到了103个差异显著的潜在 lncRNA-mRNA顺式调控关系对(P<0.05)。随后根据差异表达 mRNA功能分析筛选出MSTN、CDKN1A、FHL1等骨骼肌发育相关基因和 LPL、SCD等骨骼肌代谢相关基因,根据差异表达 lncRNA靶基因功能分析筛选出13个可能与肌肉发育相关(ADDIN CNKISM.UserStyleLNC.17926.1、LNC.981.1、LNC.16284.1等)和 8个可能与骨骼肌代谢相关(LNC.15496.1、LNC.18149.1等)的 lncRNA。随机选取2组均表达的5个lncRNA和4个mRNA进行 qPCR验证,结果与 RNA-seq一致,佐证了测序结果的可靠性。本研究为今后探究滩羊肌肉发育、肉质形成机制和开展分子育种打下了坚实基础,为改良国内其他绵羊品种的产肉性能提供了科学依据。

CMTM4蛋白的异常表达与肿瘤的发生、发展及预后紧密相关。尽管CMTM4在肿瘤中的重要作用已逐渐体现,但其在宫颈癌中的具体作用机制仍不明确。本研究旨在探讨CMTM4表达在宫颈癌中与临床病理特征的关系及机制研究。免疫组化和Western印迹检测癌组织和癌旁组织中CMTM4表达水平,结果发现,CMTM4在宫颈癌组织中显著低表达(P<0.001)。卡方检验分析CMTM4表达高低与宫颈癌患者临床特征及病理特征的关系,发现CMTM4表达高低与产次、HPV感染情况、病理类型、FIGO分期和淋巴结转移正相关。Western印迹和RT-qPCR检测宫颈癌细胞系(C-33A、HeLa、U14、HT-3)、人永生化上皮细胞HaCaT中CMTM4蛋白质水平和mRNA水平,发现HaCaT细胞中的CMTM4蛋白质水平和mRNA水平显著高于C-33A细胞、HeLa细胞、U14细胞和HT-3细胞。其中,C-33A细胞中的CMTM4表达变化最为显著,故选择C-33A细胞系进行后续的过表达实验。过表达CMTM4转染C-33A细胞,细胞分为3组,control组、pcDNA-NC组、pcDNA-CMTM4组。CCK-8检测细胞增殖,发现pcDNA-CMTM4组宫颈癌细胞增殖能力显著低于pcDNA-NC组(P<0.001)。流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测Bax、Bcl-2、切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase 3)蛋白质水平,发现CMTM4过表达促进细胞凋亡(P<0.001),显著增加Bax(P<0.001)和切割胱天蛋白酶3(P<0.05)蛋白质水平,显著降低Bcl-2蛋白质水平(P<0.01)。Western印迹检测PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白质水平,发现CMTM4过表达显著降低p-PI3K(P<0.001)和p-AKT(P<0.01)蛋白质水平,不影响PI3K和AKT蛋白质水平(P>0.05)。以上研究结果表明,CMTM4基因在宫颈癌中表达下调,CMTM4过表达通过抑制PI3K/AKT通路抑制宫颈癌细胞增殖并诱导凋亡。因此,CMTM4可作为筛查宫颈癌的一种生物学标志物。

肝门部胆管癌发病隐匿,常因胆汁淤积引起梗阻性黄疸,导致肝功能受损。对肿瘤合并恶性梗阻性黄疸,临床通常在手术前行胆汁引流。目前,胆汁引流方式主要是经皮经肝胆道引流 (percutaneous transhepatic biliary drainage,PTBD) 和内镜下逆行胆管引流 (endoscopic retrograde biliary drainage,ERBD),2种引流方式各有优劣。PTBD引流易引起肿瘤种植转移,但机制不清楚。本文分析肝门部胆管癌PTBD及ERBD引流胆汁,从中分离获得肿瘤细胞,通过体外肿瘤球形成及体内移植瘤模型对PTBD与ERBD胆汁中肿瘤细胞的致瘤性及机制进行研究。以胆结石组作为阴性对照,分为良性结石组(30例),ERBD减黄组(13例),PTBD减黄组(14例),其中良性结石30例的胆汁中无肿瘤细胞,未形成肿瘤球,ERBD减黄13例胆汁中有3例形成肿瘤球 (23%),PTBD减黄14 例胆汁有6 例形成肿瘤球 (42%),PTBD组细胞的肿瘤球形成能力显著高于ERBD组。皮下移植瘤检测表明,PTBD组移植瘤生长能力显著高于ERBD组,PTBD胆汁中的肿瘤细胞具有更强的致瘤能力。在机制研究中,RT- PCR检测表明,PTBD组肿瘤球干细胞转录因子Nanog的mRNA水平显著高于ERBD组。在3例PTBD组细胞中敲低Nanog, 肿瘤球形成,皮下移植瘤生长均被降低,Nanog在PTBD肿瘤细胞强的致瘤能力中发挥重要作用。PTBD细胞中Nanog的mRNA半衰期长于ERBD组,Nanog的 mRNA受转录后修饰潜在调控。本文发现,PTBD肿瘤细胞中Nanog的m⁶A水平高于ERBD组。对RNA修饰的甲基转移酶及去甲基化酶进行检测表明,ALKBH5 (α - ketoglutarate dependent dioxygenase alkb homolog 5)的 mRNA表达水平在PTBD组低于ERBD组,且与Nanog的m⁶A水平显著相关。敲低ALKBH5,Nanog的m⁶A水平升高,而过表达ALKBH5则下调Nanog的m⁶A水平。双荧光素酶活性检测表明,ALKBH5敲低显著增强荧光素酶活性,而ALKBH5过表达则降低荧光素酶活性。进一步研究证实, 敲低ALKBH5,Nanog的mRNA和蛋白质水平均被上调,相反过表达ALKBH5,Nanog的mRNA和蛋白质水平被下调。ALKBH5介导Nanog去甲基化修饰,PTBD组低的ALKBH5水平促进其Nanog的m⁶A修饰上调。过表达ALKBH5降低肿瘤球生长;敲低ALKBH5肿瘤球生长被上调,但同时敲低Nanog,升高的肿瘤球生长被抑制。综上,肝门部胆管癌经PTBD与ERBD减黄胆汁中的肿瘤细胞可形成肿瘤球,具有致瘤性。相比于ERBD组,PTBD胆汁中肿瘤细胞ALKBH5的表达水平低,增强了Nanog的m⁶A修饰,上调Nanog表达水平,具有更强的致瘤性,对揭示PTBD引流易引起肿瘤种植转移具有重要意义。

线粒体转录因子B1(mitochondrial transcription factor B1,TFB1M)主要参与线粒体DNA转录,与肝细胞癌、星状细胞瘤等发生发展有关,然而其在结肠癌中的作用尚不清楚。本研究基于公共数据库和免疫组织化学方法分析TFB1M在结肠癌中的表达水平及预后;筛选TFB1M高低表达组差异表达基因,进行功能富集分析,突变分析、免疫细胞浸润和药物敏感性分析等。采用CCK-8、流式细胞术等方法检测过表达TFB1M对结肠癌细胞活力、凋亡及细胞周期分布的影响。结果发现,TFB1M在结肠癌中表达水平显著升高,其表达水平与N分期和TNM分期有关(P<0.05)。TFB1M高表达结肠癌患者预后较差。功能富集结果显示,TFB1M与白细胞介导的免疫、免疫球蛋白产生等信号通路有关。此外,ZFHX4、RYR2、PIK3CA和FAT4等基因在TFB1M高表达组突变频率显著升高(均P<0.05)。在PIK3CA和FAT4突变组中TFB1M表达水平显著升高(均P<0.05)。TFB1M高表达组中CD4⁺记忆活化T细胞占比升高,Treg细胞占比降低。TFB1M高表达组患者可能对陶扎色替(tozasertib)、阿糖胞苷(cytarabine)、长春新碱(vincristine)等更敏感,而TFB1M低表达组患者可能对Dasatinib、JQ1、ERK_2440等更敏感。细胞实验结果表明,过表达TFB1M时,结肠癌细胞活力升高、细胞凋亡减少,S期和G₂/M期细胞占比增多。以上研究结果表明,TFB1M可能通过调控免疫细胞浸润及功能在结肠癌细胞生长过程中发挥关键作用。

本研究旨在探究抗阻运动能否通过激活骨骼肌Piezo1/AMPK/PGC-1α信号通路,改善线粒体功能和促进肌生成,从而有效缓解废用性骨骼肌萎缩。采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠,通过后肢石膏固定模拟废用性肌肉萎缩,并分为对照组、废用性肌萎缩组、废用性肌萎缩+抗阻运动组和废用性肌萎缩+抗阻运动+Piezo1抑制剂组。抗阻运动组进行为期8周的抗阻训练。通过Western 印迹、免疫荧光染色、线粒体质量和功能检测等方法,评估骨骼肌质量、功能、线粒体状态和肌生成情况。抗阻运动使废用性肌萎缩小鼠的骨骼肌横截面积增加23%(P<0.01),骨骼肌相对质量增加11%(P<0.01)。抗阻运动使小鼠最长跑步距离平均增加206 m(P<0.01),最大承载力平均增加36.7g(P<0.01),平衡木爬行时间平均缩短1.5 s(P<0.01),同时上调了Piezo1、AMPK、PGC-1α的蛋白质表达水平(P<0.01)。此外,抗阻运动还增加了小鼠骨骼肌中MMP、TFAM、COXⅠ、CS、ATPB、ATPase、ATP、p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、Pax7和MyoD的活性或蛋白质表达的水平(P<0.05,P<0.01)。而抑制Piezo1则降低了上述酶活性和蛋白质的表达水平(P<0.05,P<0.01)。抗阻运动通过激活Piezo1/AMPK/PGC-1α通路,提高了骨骼肌线粒体质量和功能,促进了蛋白质合成和肌生成,有效缓解了废用性骨骼肌萎缩。

本研究旨在构建稳定的上皮细胞衰老模型,以期用于衰老细胞清除剂(senolytics)药物的筛选和评价研究。探究了阿霉素(doxorubicin)诱导人非转化乳腺上皮细胞系MCF 10A衰老的最佳条件,包括最佳诱导浓度、最佳干预时长和最佳衰老天数,并多维度验证了MCF 10A作为细胞衰老模型的可行性。阿霉素诱导MCF 10A细胞衰老的最佳条件是:用0.6 μmol/L的阿霉素处理16 h在第8 d MCF 10A细胞达到最佳衰老状态。在最佳诱导条件下,加药组的衰老相关-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)染色阳性率达到97%;同时,检测mRNA、蛋白质和免疫荧光(immunofluorescence, IF)的表达,结果显示:加药组细胞相对于正常细胞的衰老相关分泌表型(senescence-associated aecretory phenotype, SASP)、p16、p21和p53蛋白质的表达量均显著升高,核纤层蛋白B1(lamin B1)显著下降(P＜0.001)。加药组细胞与衰老细胞特有特征一致。本研究用阿霉素成功构建了MCF 10A上皮细胞衰老模型,为基于衰老上皮细胞的衰老细胞清除剂的筛选奠定了研究基础。