工业生产上中国仓鼠卵巢细胞(CHO)药物蛋白质的表达水平受多种因素影响:调控元件对转录翻译的影响、基因组整合位点的影响以及表达系统的影响等。转录作为基因表达第一步,较大程度影响蛋白质的表达,其中启动子在转录起始发挥至关重要的作用。启动子筛选大部分通过瞬时转染或随机整合,但存在拷贝数不明确或整合位点随机等而无法准确评价启动子活性。位点特异性整合在一定程度上降低位置效应对外源基因造成的影响,并有可能提高外源基因的表达水平。本课题组前期在CHO细胞基因组中发现并验证了多个可稳定表达外源蛋白质的位点,本研究选择其中1个位点(2c6)用于启动子活性的评价。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将猿猴病毒早期启动子(SV40)、小鼠延伸因子-1α(mEF-1α)、鸡β-肌动蛋白(cACTB)启动子和人磷酸甘油酸激酶启动子(hPGK)调控的报告基因(EGFP)表达盒定点整合至2c6位点上。通过流式分选仪分析细胞平均荧光强度,qPCR检测EGFP的mRNA水平,综合评价启动子的活性。结果表明,mEF-1α和cACTB启动子的活性优于SV40和hPGK。2次流式分选结果表明,位点特异性整合可以更为精确评价CHO细胞表达系统启动子活性。

他莫昔芬(tamoxifen,TAM)作为雌激素受体阳性(estrogen receptor,ER+)乳腺癌的一线化疗药物使大多数患者受益,但原发性和继发性耐药问题严重影响临床治疗效果。深入研究ER+乳腺癌TAM耐药机制,改善治疗效果是当前亟待解决的问题。抑癌因子NDRG2(N-myc downstream regulated gene 2,NDRG2)在肿瘤发生发展中发挥重要作用,但是否参与ER+乳腺癌TAM耐药尚不清楚。本研究旨在探明NDRG2在ER+乳腺癌TAM耐药中发挥的作用和机制。通过RT-PCR与免疫印迹分析对比TAM敏感型和耐药型ER+乳腺癌细胞发现,NDRG2的mRNA转录水平和蛋白质翻译水平在TAM耐药细胞中表达显著下调,且与耐药能力负相关(P<0.001);CCK-8细胞毒性实验和软琼脂克隆形成实验证实,在耐药细胞中过表达NDRG2可显著降低TAM药物半抑制浓度IC₅₀和软琼脂克隆形成率(P<0.001),逆转耐药表型。分子机制上,X-box 结合蛋白 1(X-box binding protein 1,XBP1)mRNA剪切实验与内质网相关降解(endoplasmic-reticulum associated degradation ,ERAD)报告蛋白的结果显示,过表达NDRG2可增强耐药细胞中剪切型XBP1s mRNA转录与ERAD报告蛋白CD3ε-YFP表达(P<0.001),引发耐药细胞内质网强应激反应;免疫印迹检测结果显示,过表达NDRG2可显著提高耐药细胞中内质网应激感受器肌醇需要激酶1α(inositol requiring enzyme 1,IRE1α)的磷酸化水平及其下游因子,例如内质网EIP辅助因子(endoplasmic reticulum-localized DnaJ 4,ERdj4)、PKR蛋白激酶的细胞抑制剂(cellular Inhibitor of the PKR protein kinase,P58^IPK)、α甘露糖苷酶样应激蛋白 (er degradation enhancing α mannosidase likeprotein,EDEM)和蛋白质二硫键异构酶家族 A 成员 5 (protein disulfide isomerase family a member 5,PDIA5)的表达水平(P<0.001)。小鼠异种移植瘤研究进一步证实,在耐药细胞中过表达NDRG2可增强TAM治疗效果,显著抑制耐药移植瘤生长(P<0.001)。以上研究结果表明,通过提高耐药细胞中NDRG2表达,增强TAM治疗引发的内质网强烈应激,可逆转ER+乳腺癌细胞耐药性,改善TAM治疗效果。研究结果为解决ER+乳腺癌TAM耐药问题提供了新的思路和有价值的潜在药物靶点。

本文旨在研究热激蛋白70(70-kD heat shock proteins,Hsp70)过表达对C2C12细胞成肌成脂状态下糖酵解的影响。本文以C2C12细胞为研究材料,采用腺病毒过表达Hsp70基因,通过荧光定量PCR技术和Western印迹技术检测糖酵解基因的表达变化。研究表明,在C2C12细胞成肌分化的过程中,Hsp70基因与Gsk3β、Pkm、Prkag3、Pfkm和Hk-2基因表达趋势基本一致,推测Hsp70在成肌分化过程中与糖酵解途径有关。细胞过表达Hsp70在成肌分化后期能显著上调Gsk3β、Pkm、Prkag3和Pfkm基因的表达(P<0.05),对Hk-2基因的表达未见显著影响(P>0.05)。C2C12细胞成脂诱导过程中,Hsp70基因与Gsk3β、Pkm、Prkag3、Pfkm和Hk-2基因表达趋势基本一致,推测Hsp70在成脂诱导过程中与糖酵解途径有关。过表达Hsp70时,C2C12细胞成脂诱导中后期,脂滴数量明显高于对照组,Gsk3β、Pkm、Prkag3和Pfkm基因的表达显著上调(P<0.05),Hk-2基因的表达未见显著影响(P>0.05)。综上所述,Hsp70在C2C12细胞成肌成脂状态下,通过促进糖原分解为6-磷酸葡萄糖,从而加强糖酵解途径,为Hsp70基因对C2C12细胞糖酵解的功能研究提供参考。

FLASH/CASP8AP2为基因组中一个独特的基因,参与多个细胞调控过程,包括细胞凋亡、组蛋白基因pre-mRNA的加工、转录调控以及细胞周期进程等。临床医学研究表明,FLASH是急性淋巴细胞白血病的一种预后标志物,还是多种癌细胞存活的关键因子。因此,对FLASH功能的深入研究有望为相关疾病治疗提供新的视角。我们先前鉴定FLASH为p53的结合因子,并发现其能够增强p53的转录活性。在此基础上,本文阐述了FLASH和p53相互作用的分子机制。研究结果表明,p53 K386突变显著降低其与FLASH(aa 51~200)和FLASH-SIM(aa 1 534~1 806)的结合强度。然而,GST沉降分析仅能检测到SUMO与FLASH-SIM而不是FLASH(aa 51~200)之间的相互作用。在细胞中过量表达FLASH增强了整体性SUMO1修饰以及p53的SUMO1修饰,这可能是FLASH增强p53转录活性的一种作用机制。由于PML NB为细胞内SUMO的亚细胞反应器,而PML IV亚型能够特异性地增强p53的SUMO修饰,我们在此分析了FLASH与PML IV之间的相互作用,并鉴定了二者相互作用的结构域基础:FLASH-N3A(aa 501~802)和FLASH-C2(aa 1 807~1 981)均能与PML IV(aa 228~633)结合。进一步的研究显示,PML IV能够增强FLASH调控的整体性SUMO修饰和p53的SUMO修饰,即二者在功能上存在协同性。FLASH 与肿瘤抑制因子p53 和PML IV 之间的相互作用,丰富了对其功能的认识,有望揭示FLASH在肿瘤发生过程中的作用机制,为癌症的诊断和治疗提供新的思路。

全反式维甲酸(ATRA)是早幼粒细胞分化的有效诱导剂,其对红系分化过程的作用尚不完全清楚。为研究ATRA在红系分化进程中的作用及其表观遗传调控机制,本文以诱导白血病细胞K562向红系分化为模型,对ATRA干扰红系分化过程的调控机制进行研究。首先利用血红素(hemin)诱导K562细胞向红系分化;流式细胞术结果显示,ATRA影响细胞向红系分化过程中的谱系变化,阻滞细胞分化进程;ATRA处理分化中的细胞后,红系分化相关基因表达水平降低;而通过3C、FAIRE和ChIP技术对其中的表观遗传机制进行探究发现,ATRA处理细胞后,β-珠蛋白家族基因座位内的染色质可及性降低,LCR与其靶基因启动子之间的相互作用频率降低;而基因座位染色质可及性降低导致了红系相关转录因子GATA1、LDB1、LMO2和TAL1在LCR及珠蛋白家族基因座位的启动子区的富集频率降低。上述结果表明,ATRA处理分化中的细胞导致红系分化相关基因的染色质可及性降低,更加封闭的染色质结构阻碍了LCR招募转录因子与基因启动子区的结合,进而抑制β-珠蛋白家族基因表达,这种动态的变化过程阐明了ATRA调控红系分化的表观遗传机制。

阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)是一种与年龄相关的认知功能下降的神经退行性疾病。1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)参与多种细胞过程,被证实在神经系统发育中发挥重要作用。本文旨在探究S1PR2对Aβ_25-35诱导的AD细胞模型损伤的作用及可能机制。研究通过Aβ_25-35诱导SH-SY5Y细胞构建细胞损伤模型,并且构建靶向S1PR2的干扰序列用于干预细胞中S1PR2的表达。Western印迹及RT-PCR检测S1PR2蛋白及基因表达,发现Aβ_25-35诱导的细胞模型中S1PR2蛋白及基因表达均显著增加(P<0.01),S1PR2干预后模型组内S1PR2蛋白及基因表达显著降低(P<0.001)。CCK8检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示,S1PR2干预后显著增加Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞的增殖活性,减少细胞凋亡(P<0.01)。Western印迹检测细胞中APP、Tau、p-Tau和PSD95的表达,结果显示,S1PR2干预后显著降低模型组细胞内APP、Tau和p-Tau的表达,增加突触蛋白PSD95的表达,可显著改善Aβ_25-35诱导的细胞损伤(P<0.001)。另外,试剂盒检测细胞中ATP的产生,流式细胞术检测ROS含量及线粒体膜电位以分析细胞的线粒体功能,结果显示,Aβ_25-35诱导SH-SY5Y细胞显著降低了细胞中ATP的产生,增加了ROS含量,减少了线粒体膜电位(P<0.001)。S1PR2干预后显著增加Aβ_25-35诱导的细胞模型中ATP的产生,降低ROS含量,增加线粒体膜电位(P<0.001)。最后,通过Western印迹检测AKT/mTOR通路蛋白质表达,结果显示,Aβ_25-35诱导SH-SY5Y细胞促进了p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的表达,S1PR2干预后显著抑制AKT/mTOR通路的激活(P<0.001)。总而言之,S1PR2可能通过促进AKT/mTOR通路调节线粒体功能参与Aβ_25-35诱导的细胞损伤进程。

当前胶质瘤的治疗面临耐药性问题,导致传统化疗药物效果受限。本研究旨在探究三氟甲基喹唑啉化合物(KZL204)抗胶质瘤的潜在作用机制。通过CCK-8检测,我们发现KZL204能显著抑制耐药癌细胞的生长,其48 h的半数抑制浓度(IC₅₀)为3.63±0.38 μmol/L,显著优于阳性对照药物替莫唑胺(TMZ)(IC₅₀值为141.72±3.65 μmol/L)。此外,流式细胞仪分析显示,KZL204处理能显著提高耐药肿瘤细胞的凋亡率,并将细胞周期阻滞在G₂/M期。同时,Traswell实验证实,KZL204对耐药癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。转录物组学分析揭示,KZL204处理后耐药癌细胞中2 435个差异表达基因,其中1 320个上调,1 115个下调。KEGG和GO富集分析表明,这些差异基因显著富集在凋亡相关信号通路。进一步的生物信息学预测和韦恩图分析确定了35个潜在的关键节点基因,其中PI3K-AKT信号通路在差异表达基因中最为显著。实时荧光定量PCR(RT-qPCR:Quantitative Real-time PCR)验证了KZL204对CREB3L1、CSF1、CXCL5、BCL3等基因的下调作用,以及对FOS、LTA、PTGS2、MAP2K3等基因的上调作用。蛋白质水平的免疫印迹检测也证实了KZL204对凋亡蛋白质表达的影响,包括上调Bax、切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)表达,下调AKT、Bcl-2、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶8的蛋白质表达。综上所述,KZL204通过调控PI3K-AKT和凋亡相关信号通路,显著抑制了耐药性胶质母细胞瘤的生长和转移,并诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期,展现了其作为抗耐药性胶质瘤候选药物的潜力。

宫颈癌是全球第4大常见的女性癌症,目前,手术和放疗仍然是治疗非转移性宫颈癌的主要方法,然而,复发性和转移性宫颈癌尚无有效治疗手段。寻找新的更加有效的宫颈癌治疗靶点就显得尤为重要。已知白介素-6(interleukine-6,IL-6)作为肿瘤促进因子在宫颈癌的发展和转移过程中发挥着十分重要的作用。已有报道显示,间充质干细胞在多种肿瘤中发挥抑癌作用,但对于其内在机制的报道较少;且在宫颈癌的发展过程通常伴随着IL-6表达的增加。在IL-6存在的炎症病理条件下,MSCs对于宫颈癌细胞的增殖和迁移是否仍具有抑制作用仍未可知。本研究通过检测人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUC-MSCs)对IL-6诱导的HeLa细胞增殖、迁移、侵袭以及STAT3/Bcl-2、AMPK/mTOR信号通路的调节作用, 探讨其对宫颈癌Hela细胞生物活性的影响及其分子机制。集落形成实验、细胞划痕实验以及Transwell侵袭结果证明,炎症因子IL-6显著促进HeLa细胞增殖、迁移和侵袭(P < 0.05)。而20%和50% MSCs条件培养基显著抑制IL-6诱导的HeLa增殖(P < 0.0001)、迁移(P < 0.01)和侵袭能力(P < 0.0001)。进一步的机制研究结果显示,炎症因子IL-6 显著上调抗凋亡信号通路中STAT3和Bcl-2的mRNA(P < 0.0001)和蛋白质(P < 0.01)含量;同时下调AMPK、TSC1 和TSC2等基因的表达(P < 0.001),最终上调细胞代谢相关基因mTOR的表达(P < 0.01)和蛋白质磷酸化水平(P < 0.05)。20% MSCs条件培养基显著抑制HeLa细胞中STAT3/Bcl-2信号通路(P < 0.05)。50% MSCs条件培养基显著抑制HeLa细胞中STAT3/Bcl-2信号通路(P < 0.01)同时激活AMPK/mTOR信号通路(P < 0.05),诱导细胞周期阻滞(P < 0.0001)。综上所述,MSCs条件培养基通过下调STAT3信号通路和上调AMPK信号通路抑制白介素-6诱导的HeLa细胞的增殖、迁移与侵袭。本研究结果有助于进一步阐释IL-6在宫颈癌中发生发展的作用和机制,为寻找宫颈癌治疗的新研究方向提供实验依据。

胰腺多肽(pancreatic polypeptide,PP)是一种含36个氨基酸的胰腺激素,在评估胰腺功能和辅助诊断相关疾病中发挥重要作用。以PP为靶点,筛选特异性的PP纳米抗体,评估其与PP抗原是否具有结合活性。利用原核表达系统制备了高纯度的PP抗原,经免疫羊驼后构建了高库容和高丰度的胰腺多肽免疫的纳米抗体噬菌体文库,并通过噬菌体展示技术进行文库筛选,获得8株胰腺多肽纳米抗体。选取1株纳米抗体(PP-VHH)构建原核表达体系,经IPTG诱导表达、纯化与鉴定,通过间接ELISA和双抗夹心ELISA分别检测和评价抗原抗体的结合活性和血清中PP含量,结果显示,PP-VHH与PP具有结合活性,且PP-VHH可用于检测鸡和人血清中的PP。建立的双抗夹心ELISA法拟合曲线R²为0.9868,可检测不同个体鸡血清中PP浓度为48～55 pg/mL。而人血清中PP浓度范围波动较大。综上所述,本研究筛选到的1株纳米抗体PP-VHH,可用于检测鸡和人血清中的PP含量,为评估胰腺功能异常或诊断相关疾病提供基础。

开发了石英晶体微天平(QCM)-指数富集配体系统进化(SELEX)技术,用于筛选出与砷(Ⅲ)有高亲和力的适配体。设计随机单链DNA文库,以砷(Ⅲ)为靶标固定在巯基乙胺修饰的晶振片上,捕获溶液中处于游离状态的适配体,构建QCM-SELEX筛选方法。经过6轮筛选,对次级文库进行高通量测序,通过QCM共振频率变化计算得出6S1解离系数Kd值为0.36 μmol/L。将6S1作为探针,构建QCM生物传感器用于检测砷(Ⅲ),该传感器在0.01 μmol/L~0.2 μmol/L范围内有较好的线性关系,对砷(Ⅲ)检测限为5.2 nmol/L(3σ),具有良好的选择性。

脾是机体最大的淋巴器官,参与病原体清除和抗体产生的免疫反应过程,并参与代谢平衡调节。高原低氧环境可影响脾组织脂质代谢,但影响脂质代谢的关键机制仍不清楚。我们旨在使用脂质组学分析方法研究高原低氧对小鼠脾组织脂质代谢的影响。将C57BL/6小鼠分别置于海拔4 200 m(高原低氧组, HST组)和400 m(平原常氧组, PSC组),30 d取脾组织。使用超高效液相色谱-Orbitrap质谱系统进行脂质组学分析。30 d时在高原低氧环境下,小鼠脾指数降低,并出现白髓减少,生发中心扩大,边缘模糊,静脉充血等病理学改变。脂质组学分析结果显示,共鉴定到41种脂质亚类和2 473种脂质分子,甘油三酯(triacylglycerides, TGs)和磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines, PCs)为脂质分子鉴别到最多的2种。使用单变量和多变量分析,鉴定到44个差异脂质分子,它们主要集中于磷脂代谢。随后,对磷脂代谢途径中的关键酶进行RT-qPCR检测,发现其mRNA表达量均有差异(P < 0.05)。提示高原低氧环境主要影响小鼠脾组织磷脂代谢,并通过减少PC和磷脂酸(phosphatidic acid, PA)含量,促进其转化为磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)和心磷脂(cardiolipin, CL)并通过CDP-乙醇胺(CDP-Ethanolamine, CDP-Etn)途径促进PE生成。该研究为高原低氧环境下脾组织中磷脂代谢异常提供新的实验依据。

肿瘤干细胞作为肿瘤组织中一小群具有自我更新和多向分化潜能的细胞,可以启动原发肿瘤并介导治疗耐药、肿瘤复发和转移,但其在细胞间层面如何影响结直肠癌的机制仍尚不清楚。因此,本文探究了肿瘤干细胞及其分泌的外泌体对结直肠癌恶性表型的影响。首先,从结直肠癌肿瘤组织中分离出CD166⁺CD44⁺肿瘤干细胞(CSC),通过超速离心法提取肿瘤干细胞源性的外泌体(CSC-exo)和结直肠癌SW480细胞源性的外泌体(S-exo),并进行NTA粒径分析、电镜观察和Western 印迹鉴定。将成功分离得到的CSC和CSCexo与结直肠癌SW480细胞共培养,共培养后的细胞通过CCK-8、细胞凋亡实验发现,经过CSC或CSCexo共培养后的SW480细胞凋亡率从20%下降至13%(P < 0.01),并且侵袭能力显著增加(P < 0.001)。此外,通过动物体内实验发现,S-exo治疗组的肿瘤生长速度比CSCexo治疗组的缓慢,CSCexo抑制了5-FU对结直肠癌肿瘤的药物疗效。PET/CT显像、免疫组化分析以及Western 印迹结果显示,CSCexo增强了结直肠癌肿瘤对葡萄糖类似物18F-FDG的摄取和糖酵解酶HK2、PFKFB2、PKM2和LDHA的表达。此外,用siRNA干扰糖酵解酶的表达会阻断CSCexo引起的耐药现象。综上,本研究表明,结直肠癌干细胞传递外泌体影响肿瘤葡萄糖代谢途径,并促进化疗耐药和侵袭能力,揭示了恶性肿瘤微环境的形成和动态变化机制。

磁分离是从生物样本中富集特定目标物的常用方法。传统特异性磁分离方法一般通过将抗体与磁珠偶联获得免疫磁珠的方式用于特定目标物的捕获,但由于抗体有成本高、捕获目标物后不易释放等缺点,免疫磁珠难以满足众多研究领域对同时满足目标物大批量、高特异性富集的需求。核酸适配体同抗体一样具备目标物高特异性捕获的能力,相较抗体具有制备成本低、结构简单和化学稳定性高等优点,更适合用来大批量、高特异性富集特定目标物,因此在本研究中,本文利用石墨烯对单链和双链核酸的吸附能力不同的特性,以CD63适配体为例设计了一套可以将适配体展示于石墨烯表面并用于捕获、富集和释放目标物的方法。该设计主要包括2个单元,一是可以贴附于石墨烯表面并将CD63适配体展示于石墨烯外的双链寡核苷酸支架,二是采用与支架足部序列互补的单链寡核苷酸,将所捕获的目标物从石墨烯表面解吸附。本研究首先以氧化石墨烯(GO)纸为石墨烯界面,通过对支架或CD63蛋白等进行荧光标记,并对比支架释放前后及CD63蛋白捕获前后GO纸表面荧光强度变化表示其支架释放效果与CD63蛋白捕释情况,随后应用氨基修饰的石墨烯壳铁氮磁珠搭载CD63适配体双链支架,用于捕获细胞裂解液中CD63蛋白。结果表明,该支架可以将适配体展示于石墨烯表面捕获CD63蛋白并可以可控释放,使用挑选的改性石墨烯磁珠搭载该适配体双链支架,可以用于细胞裂解液中CD63蛋白的捕获。该方法有望实现多种蛋白质的特异性富集或通过捕获外泌体膜蛋白而富集外泌体等多种用途。

JIB-04(Jumonji histone demethylase inihibitor,JIB-04)是一种泛组蛋白赖氨酸去甲基化酶抑制剂,可抑制多种肿瘤发生发展,但其具体机制仍不清楚。本文以肝癌细胞HepG2和Huh7为研究对象,探讨了JIB-04对肝癌细胞的增殖影响,并揭示其可能的分子机制。CCK-8和EDU检测细胞增殖实验显示,JIB-04明显抑制肝癌细胞HepG2和Huh7活力,且具有浓度依赖性,其半数抑制浓度分别为0.7689 μmol/L及0.7392 μmol/L。流式细胞术检测细胞内ROS水平变化,结果显示,JIB-04可显著激活细胞内ROS的累积。通过谷胱甘肽(glutathione,GSH)检测试剂盒和脂质过氧化物检测试剂盒分别检测细胞内GSH和脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平发现,在2 μmol/L JIB-04处理下,HepG2和Huh7细胞内GSH分别下降88.4%和80.7%,而脂质过氧化物分别升高4.75倍和9.25倍。通过qRT-PCR和Western印迹分析发现,JIB-04显著降低铁死亡相关因子GPX4和SLC7A11的mRNA水平和蛋白质水平,同时铁死亡相关通路蛋白质MDM2明显下调,P53蛋白水平明显上调。机制研究显示,JIB-04可以使赖氨酸特异性去甲基化酶KDM4C的蛋白质水平下调约58%和51%。通过ChIP检测发现,在JIB-04处理肝癌细胞后MDM2基因启动子区域H3K9me3分别提高了2.19倍和2.14倍,同时qRT-PCR证明,JIB-04处理肝癌细胞后MDM2 mRNA水平显著下调。综上所述,本研究初步揭示了JIB-04可下调特异性去甲基化酶KDM4C的表达,进而影响MDM2基因启动子区域H3K9me3甲基化水平抑制MDM2基因表达,减少MDM2蛋白与P53蛋白结合,P53蛋白水平表达上调,同时,铁死亡相关蛋白质SLC7A11和GPX4的表达下调,导致细胞内GSH耗竭、ROS与脂质过氧化物积累,最终导致细胞发生铁死亡。

氯胺酮是谷氨酸NMDA受体的拮抗剂,也是当下滥用较严重的一种精神活性物质,长期滥用会引起机体多个系统的损害,探讨氯胺酮的成瘾机制并筛选相关生物标志物对毒品防控具有重要的意义。本研究先对斑马鱼胚胎/幼鱼进行氯胺酮急性暴露实验,然后取6月龄的斑马鱼,通过条件性位置偏爱实验建立氯胺酮成瘾模型,RNA-seq检测斑马鱼脑转录组,qPCR和Western印迹分别检测其中关键基因表达。结果显示:与对照组相比,氯胺酮组中斑马鱼胚胎的自主抽动、胚胎孵化率及幼鱼存活率都有不同程度的降低,移动距离更是大幅下降,由对照组的1 904.2 mm降到300 μmol/L氯胺酮组的319.0 mm;条件性位置偏爱实验显示对照组斑马鱼在鱼缸的活动没有明显变化,而氯胺酮组斑马鱼在鱼缸明区的活动时间从训练前的385.2 s提高到训练后的706.4 s,时间占比提高了26.8%(^***P < 0.001),说明斑马鱼对对氯胺酮刺激产生了偏爱;KEGG分析显示氯胺酮处理的差异基因在神经活性配体-受体相互作用通路中富集,GSEA分析进一步发现氯胺酮显著上调谷氨酸能突触通路(NES值为1.5);此外,与对照组相比,氯胺酮组的Grin2b和Gria2的mRNA水平分别升高至4.6倍、1.4倍,同时蛋白质水平分别升高至2.0倍和1.4倍。这说明氯胺酮能够诱导斑马鱼成瘾,谷氨酸能突触通路可能参与调控作用。

AP2转录因子属于AP2/ERF超家族,参与调节植物生长发育的各种生物学过程,以及对生物和非生物胁迫的响应。然而,关于紫苏 (Perilla frutescens) AP2转录因子家族的研究未见报道。在本研究中,从紫苏基因组中鉴定到18个AP2家族成员,使用生物信息学方法分析了基因结构、保守基序和顺式作用元件。WRINKLED1 (WRI1) 是许多植物物种中脂质生物合成的关键调节因子,在油脂合成过程中发挥重要调控作用。通过序列比对发现其中1个成员与AtWRI1序列高度同源,含有2个保守的AP2结构域,命名为PfWRI1。结合转录物组数据分析了PfAP2家族基因在紫苏不同组织和种子发育不同阶段的表达水平,结果表明,PfWRI1仅在紫苏种子中高表达,暗示PfWRI1可能与种子的发育过程有关。进而构建植物过表达载体pCAMBIA1303-PfWRI1,通过农杆菌侵染技术转化野生型 (Col)以及突变体 (wri1-1)拟南芥,分别获得过表达和回补株系。结果表明,相比于Col,PfWRI1的表达导致拟南芥种子含油率提高了8.90%~13.57%,并促进转基因拟南芥种子中油酸 (C18:1)和亚油酸 (18:2)的积累,减少棕榈酸 (C16:0)、花生酸 (C20:0)和花生一烯酸 (C20:1)的积累。此外,外源PfWRI1基因的表达增加了糖酵解和脂肪酸生物合成相关基因AtPKP-α、AtPKP-β1、AtBCCP2、AtSUS2和AtLIP1的表达。综上所述,PfWRI1可能通过与上述基因互作,增加不饱和脂肪酸含量来促进油脂积累。

紫苏 (Perilla frutescens)含有丰富的生物活性物质和营养成分,是严格的短日照植物。目前,对紫苏的研究主要集中在产量和脂肪酸积累等农艺性状,而对紫苏开花进程及花器官形成的研究较少,其分子调控机制尚不明确。FLOWERING LOUC T (FT)是目前公认的感知光周期的关键基因,在花转变中发挥重要作用。PfFT3是FT-like亚家族基因,其在植物开花调控的功能尚待揭示。本研究首先通过亚细胞定位证明PfFT3定位于细胞核和细胞质。之后构建植物表达载体pCAMBIAI1303-PfFT3,并通过农杆菌介导的花序浸染法转化野生型Col-0和突变体fd-2、fd-3和ft-10拟南芥,以此分别获得稳定遗传的纯合的过表达和回补转基因株系。结果分析表明,PfFT3的过表达能够显著促进拟南芥开花并且能够挽救突变体fd-2、fd-3和ft-10的晚花表型,进一步研究表明,外源PfFT3基因的表达促进下游内源开花基因AtSOC1、AtAP1、AtFUL和AtLFY的表达。综上所述,本研究阐明了PfFT3在促进开花过程的积极作用,为深入研究PfPEBP基因的功能及紫苏短日照早花优良种质培育奠定基础。

贻贝是一类极具经济价值和生态价值的双壳贝类,对其先天免疫防御机制的研究在海洋生物免疫学研究中占据重要地位。血淋巴是贻贝的主要免疫组织,采用贻贝血细胞Nanopore全长转录物组,结合基于SDS-PAGE分析的血清差异蛋白质组学手段,开展了厚壳贻贝血淋巴对不同微生物免疫响应的关键分子挖掘。研究结果表明,在不同微生物诱导后的贻贝血清中,共鉴定到蛋白质44种,其中26种蛋白质表现为在不同微生物胁迫后具有与对照组相比的显著差异表达(P<0.05),其功能涉及蛋白质折叠保护、细胞自噬与凋亡的调节、活性氧产生、能量代谢调节、细胞解毒功能以及炎症反应调节等。上述蛋白质在不同细菌和真菌胁迫后,其在血细胞中的基因表达量变化趋势存在差异,反映出贻贝对不同细菌和真菌诱导具有不同的响应策略。上述研究结果为了解贻贝先天免疫系统在应对不同类别微生物侵袭过程中,其差异化免疫响应机制,以及贻贝在微生物感染后,特异性标志蛋白质的筛选提供了新的科学依据,也为后续贝类养殖业的健康发展和病害防治提供了思路。

近年来,关于长非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)在疾病中的应用研究被广泛关注。LncRNAs被证实在肿瘤治疗中发挥至关重要的作用,通常作为肿瘤因子或抑癌基因参与调控肿瘤的发生发展。课题组前期通过转录组学发现了在结直肠癌中可以作为靶点的新lncRNA 606938,然而关于其在结直肠癌中的功能及作用机制尚不清楚。本研究通过反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验发现,相比正常结肠上皮细胞,lncRNA 606938在结直肠癌细胞株中低表达。过表达DLD-1与SW620细胞株中lncRNA 606938的表达,结直肠癌细胞的克隆形成能力显著下降(分别下降了97% 和54.5%)。流式细胞术的结果显示,lncRNA 606938过表达使细胞周期阻滞在G₁期(分别延长了50.5% 和63.9%),且促进结直肠癌细胞的凋亡(分别增加了1.9% 和3.3%)。Western 印迹结果显示,lncRNA 606938过表达之后,结直肠癌细胞中相关癌基因(β-联蛋白、c-Myc、cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK 4、CDK 6)的表达下调,抑癌基因(TRIM33、caspase 2、actived caspase 3)的表达上调。而在沉默lncRNA 606938之后得到相反的结果。在机制方面,通过核糖核酸交互沉降实验(RNA pulldown)、RNA免疫共沉淀(RIP)和功能挽救实验(Rescue)证实,lncRNA 606938可以靶向结合并促进TRIM33的表达,进而促进β-联蛋白的降解,并抑制β-联蛋白及下游的原癌基因c-Myc、cycline D1等的表达,最终抑制结直肠癌的进程。本研究阐明了lncRNA 606938通过靶向TRIM33/β-catenin信号途径抑制结直肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制,揭示了lncRNA 606938作为抑癌基因的潜力,为结直肠癌的临床治疗提供了新靶点和新策略。

长非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)PART1可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA),在多种肿瘤的发生发展中发挥关键作用,然而PART1在喉鳞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)中的研究尚属空白。我们基于前期lncRNA测序数据发现,PART1在LSCC组织中显著低表达。进一步分析TCGA等公共数据库中的测序和临床数据,共发现了LSCC癌/癌旁组织中146个差异表达的lncRNA(95个上调,51个下调)和2 424个差异表达的mRNA,结果显示,PART1在LSCC中普遍低表达(P < 0.0001),且PART1高表达组预后明显更好(P < 0.05)。本文采用生物信息学手段构建了LSCC中PART1的ceRNA调控网络,并确定与之相互作用的miRNA与mRNA。在体外验证了PART1对LSCC细胞的重要性。通过过表达载体,显著提高了PART1在LSCC细胞中的表达量(P < 0.001);5-乙炔基-20-脱氧尿苷染色实验、凋亡分析、划痕愈合实验、Transwell实验和鬼笔环肽染色等研究结果显示,体外过表达PART1可以显著影响LSCC细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭(P < 0.001)。因此,PART1可能参与并抑制LSCC的发生和发展。本研究将为阐明PART1在LSCC中的作用提供理论依据。

认知功能障碍是2型糖尿病的严重并发症之一,运动干预改善糖尿病认知具有一定的疗效,但具体作用机制尚不清楚。本研究旨在探究跑台运动干预改善2型糖尿病小鼠认知功能障碍的作用及分子机制。取雄性8周龄m/m小鼠10只作为对照组,db/db小鼠40只随机分为4组,每组10只,分别为db/db组(模型组)、db+Exe组(运动组)、db+Exe+SB203580组(运动联合p38 MAPK抑制剂组)、db+SB203580组(p38 MAPK抑制剂组)。db+Exe组和 db+Exe+SB203580组进行运动干预(40 min/次,5次/周,共8周);db+Exe+SB203580组和db+SB203580组在运动干预前2 h腹腔注射SB203580,(5 mg/kg,5次/周,共8周)。体重及空腹血糖测量结果显示,8周跑台运动干预可降低糖尿病小鼠体重及空腹血糖(P<0.01);水迷宫结果显示,跑台运动改善了糖尿病小鼠的认知功能障碍(P<0.05);免疫荧光染色结果显示,跑台运动降低了海马组织NLRP3的荧光强度,其中CA1区和CA3区具有显著性差异(P<0.05);跑台运动降低了海马组织PI的荧光强度,其中DG区具有显著性差异(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,跑台运动降低了小鼠海马组织中IL-1β和IL-18 mRNA的表达,其中IL-1β mRNA的表达具有显著性差异(P<0.05);Western印迹结果显示,跑台运动减少了海马组织中凋亡相关蛋白质胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9和Bax的表达(P<0.01);降低了TXNIP(P<0.01)和焦亡相关蛋白质NLRP3、GSDMD-N、IL-1β、IL-18、切割胱天蛋白酶1和 胱天蛋白酶1的表达(P<0.05);减少了坏死性凋亡相关蛋白质p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、RIPK3的表达(P<0.05)。加入p38抑制剂后,跑台运动联合p38抑制剂干预更进一步地抑制了胱天蛋白酶3、TXNIP、GSDMD-N、IL-18的表达(P<0.05),胱天蛋白酶9、Bax、NLRP3 、IL-1β、切割胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶1的表达水平也呈现下降趋势;RIPK1、p-RIPK3的表达显著增加(P<0.05),p-p38、p-RIPK1、RIPK3的蛋白质表达水平呈上升趋势。综上所述,跑台运动干预可有效改善2型糖尿病小鼠的认知功能障碍,其作用机制部分是通过p38 MAPK信号通路调控细胞泛凋亡。

近年来已有研究表明,C/EBP β在肝癌的发生发展中发挥重要的作用,但其具体分子调控机制尚不清楚。本研究通过分析GEO数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库发现,C/EBP β mRNA在肝癌中低表达(P<0.05),且其低表达与肝癌患者预后密切相关。进一步,通过功能富集分析和TIMER数据库分析显示,C/EBP β主要参与细胞周期、DNA转录等生物学过程,且C/EBP β表达水平与CD4⁺ T细胞和巨噬细胞的免疫浸润具有较强的相关性(P<0.05)。为了进一步研究C/EBP β对肝癌细胞增殖和迁移的影响。在肝癌细胞中瞬时转染C/EBP β siRNA,将其分为si-NC组和siC/EBP β组。通过qRT-PCR、Western 印迹检测肝癌细胞中C/EBP β在mRNA和蛋白质水平均显著降低(P<0.05);通过MTT检测、平板克隆形成实验和5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷(Edu)实验证实,敲低C/EBP β促进肝癌细胞的增殖(P<0.05);Transwell和划痕实验证实,敲低C/EBP β促进肝癌细胞的迁移;Western 印迹法检测敲低C/EBP β对肝癌细胞内迁移相关蛋白质(E-cadherin、N-cadherin)以及Wnt/β-catenin信号通路蛋白质表达的影响,结果表明,敲低C/EBP β促进肝癌细胞EMT上皮间质转化,并能激活Wnt/β-catenin信号通路的基因表达(P<0.05)。综上所述,C/EBP β在肝癌组织中低表达且与患者生存预后成正相关。敲低C/EBP β可能通过激活Wnt/β-catenin信号通络促进肝癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化,为C/EBP β在肝癌的发生发展中的作用提供了依据,可能是一个肝癌诊治过程中的潜在靶点。

cdc73基因编码粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)RNA聚合酶II辅助因子Cdc73,参与G₂期检查点激活并调控细胞周期。但cdc73基因缺失对细胞有丝分裂动力学的调控尚不清楚。本研究采用活细胞成像、荧光蛋白标记技术探究粟酒裂殖酵母cdc73基因缺失后对细胞有性生殖和细胞有丝分裂中微管、肌动蛋白、线粒体和组蛋白动力学的影响。结果表明:在有性生殖中,cdc73基因缺失会导致子囊孢子长度增加14.23%,产4个孢子数量的细胞减少64.08%;活细胞成像结果分析发现,在有丝分裂中,分裂后期微管伸长的长度缩短11.21%,伸长时间减少17.39%;肌动蛋白环形成和收缩速率分别降低33.33%和26.09%,形成和收缩时间分别延长58.00%和40.38%;同时,肌动蛋白环、线粒体和组蛋白表达量都增加。本研究揭示了cdc73基因缺失可抑制有丝分裂中纺锤体的伸长,延缓肌动蛋白环的形成与收缩,为进一步探寻Cdc73蛋白在细胞分裂中参与调控微管和肌动蛋白动力学功能提供了一定的科学依据。

异质性细胞叠套结构(heterotypic cell-in-cell structure, heCICs)介导独特的非自主性细胞死亡,广泛参与肿瘤发生、发展和临床预后等多种重要的病理学过程。亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(methylenetetrahydrofolata dehydrogenase 2, MTHFD2)作为一碳代谢的关键酶之一,在多种肿瘤细胞中高表达。在本研究中,为了探究MTHFD2对heCICs形成能力的影响,首先应用活细胞染料对肝癌细胞和免疫细胞分别进行标记,利用荧光显微镜对细胞进行拍摄分析建立heCICs模型。进一步通过RNAi技术瞬时敲低细胞中的MTHFD2,结果显示,MTHFD2敲低后,PLC/PRF/5和Hep3B分别与免疫细胞形成heCICs的能力显著升高(均P<0.01)。通过同源重组方法构建MTHFD2重组表达质粒,进一步构建MTHFD2过表达细胞系;将过表达细胞系与免疫细胞共培养检测MTHFD2过表达对heCICs形成能力的影响,结果显示,过表达MTHFD2后heCICs形成率显著降低(均P<0.001)。综上,本研究表明,MTHFD2是heCICs形成的负调控因子,为靶向MTHFD2促进heCICs形成增强免疫细胞胞内杀伤提供了研究基础。

外泌体可以改善由缺氧缺血引起的神经细胞损伤,但星形胶质细胞来源的外泌体(astrocyte-derived exosomes,As-exo)与线粒体功能、线粒体相关内质网膜(mitochondrial associated ER membrane,MAM)的功能及线粒体自噬是否相关目前尚未明确。本研究旨在探究星形胶质细胞来源外泌体对氧糖剥夺再复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)后PC12细胞线粒体功能、MAM以及线粒体自噬的调控作用。超速离心法提取星形胶质细胞培养基上清中的外泌体并对其进行鉴定。利用活细胞工作站观察到荧光标记后的外泌体在24 h时即在PC12细胞内出现明显的富集现象,同时在激光共聚焦扫描显微镜下观察到外泌体与线粒体出现共定位现象;采用Seahorse细胞能量代谢分仪检测线粒体压力变化:与Control组相比,OGD/R组的基础呼吸、质子漏、最大呼吸和ATP相关呼吸都有明显降低(P<0.05或P<0.01),OGD/R+exo组与OGD/R组相比4项指标都升高且差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);线粒体和内质网共定位结果表明,MAM受到氧糖剥夺再复氧伤害时,结构出现距离减小的聚合现象,而As-exo处理后MAM聚合现象减弱;流式结果表明,As-exo,一定程度恢复由氧糖剥夺损伤带来的线粒体膜电位降低和ROS升高;Western 印迹结果显示,As-exo能显著抑制由OGD/R引起的线粒体自噬相关蛋白张力蛋白同源物诱导的假定激酶1(PTEN induced kinase 1,PINK1)和Parkin蛋白(parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase,Parkin)升高,加入As-exo可降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达量,升高P62蛋白的表达水平,降低OGD/R引起的线粒体自噬水平。由此可见,OGD/R处理能引起PC12细胞的线粒体功能紊乱、MAM结构改变及线粒体自噬增加,As-exo处理后能改善细胞的线粒体功能、减弱MAM的形成和降低线粒体自噬,从而具有预防缺血性脑卒中再灌注损伤的治疗潜力。

HDAC(histone deacetylase)是一类可对蛋白质进行去乙酰化修饰的表观修饰酶,通过改变细胞核内组蛋白乙酰化状态,调控启动子活化水平,从而影响下游基因的表达水平,但其在内皮分化过程中的表达变化尚不清楚。本研究利用3阶段法诱导hiPSCs向内皮细胞定向分化,利用qRT-PCR检测Ⅰ类HDAC(HDAC1、2)、Ⅱ类HDAC(HDAC4、5)基因的表达变化。研究发现,HDAC5分子在内皮分化中有着显著的表达变化,在中胚层分化阶段下调90%(P<0.01),在血管前体阶段上调至3.7倍(P<0.01),继而在内皮晚期分化阶段下调70%(P<0.01)。免疫印迹结果进一步证实,HDAC5蛋白在内皮分化过程中存在阶段性表达变化。机制研究中显示,HDAC5中胚层分化阶段的变化受Wnt信号调控。通过CHIR99021处理以及Wnt3a质粒过表达,激动Wnt信号通路,会引起HDAC5下调。通过IWP-2抑制Wnt信号通路,会促进HDAC5表达恢复。此外研究发现,HDAC5主要定位于细胞核,IWP-2恢复HDAC5表达,但大部分滞留在胞浆。进一步研究显示,中胚层分化阶段HDAC5下调与中胚层分化标志物BraT的表达启动相关。通过HDAC抑制剂BML210处理发现,其可以促进早期中胚层分化,干扰血管前体细胞的内皮分化,增强内皮晚期阶段分化。总体而言,内皮诱导分化过程中,HDAC5有着显著的阶段性表达改变。Wnt信号激活是调控HDAC5在中胚层分化阶段下调的主要机制。

糖尿病是一种发病率高且并发症多的代谢性疾病,其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)占比较大。目前研究表明,T2DM伴随着肝、肾等脏器损伤引起并发症,严重危害人体健康。铁死亡通过芬顿反应产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS),ROS累积会激活缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α),从而引发血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)水平升高,铁死亡抑制剂——铁抑素-1(ferrostatin-1, Fer-1)具有强抗氧化能力,所以基于缺氧诱导因子-1α/血管内皮生长因子(HIF-1α/VEGF)信号通路,探讨Fer-1对糖尿病中晚期小鼠肝、肾组织的保护作用。实验以21~22周龄db/db小鼠作为糖尿病中晚期模型,铁死亡抑制剂Fer-1为干预药物。db/m小鼠为空白对照组,连续4周测量体重、血糖,实验中还对各组小鼠进食量、饮水量进行记录;测定血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平,测定肝肾组织中ROS、谷胱甘肽(glutathione, GSH)活性以及尿蛋白含量,并用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色处理肝、肾组织切片,光镜观察病理学形态,再通过Western 印迹法分别检测肝、肾组织中HIF-1α、VEGF和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白质水平。在db/db组小鼠中发现,Fer-1(1 mg·kg^-1, ig)可明显减少进食量和饮水量,降低小鼠血清中的ALT、AST水平、肝肾组织中ROS生成量以及尿蛋白水平,显著升高GSH活性,显著改善了肝、肾的病理组织状况,并且明显抑制肝肾组织中HIF-1α和VEGF蛋白质指标、提高GPX4蛋白水平。Fer-1虽不能改变糖尿病小鼠的体重和降低血糖,但能对糖尿病中晚期小鼠的肝、肾组织发挥保护作用,其作用机制可能与HIF-1α/VEGF和GPX4有关。

赖氨酰氧化酶LOXL2是一种依赖于铜离子的胺氧化酶,催化胶原蛋白和弹性蛋白的赖氨酸残基侧链发生氧化脱氨,发挥着稳固细胞外基质的作用。而稳定性是蛋白质的一个重要特性,直接影响蛋白质的分子动态及其正常功能发挥,这与人类的健康和疾病密切相关。然而,关于LOXL2的稳定性目前鲜有报道,哪些位点对其稳定性有显著影响尚不清楚。本研究采用冷冻电镜和Alphafold2的数据,建立LOXL2的全长结构,通过分子动力学模拟得到其优化构象。再通过4种方法(mCSM,PremPS,DeepDDG和FoldX),计算所有位点的稳定性属性,筛选出对稳定性有显性影响的位点(定义为关键位点)。结果表明,95个关键位点对LOXL2的稳定性具有显著影响,在5个结构域上的分布数量依次为14、13、8、11和26,而结构域间的连接肽段上也有23个关键位点。在这些关键位点中,类型及数量分别为Leu(24个)、Val(20个)、Ile(12个)、Trp(11个)、Phe(11个)、Tyr(6个)、Cys(6个)、Met(4个)和Arg(1个)。其中大部分关键位点(88个)为疏水性质,这与蛋白质折叠的主要力量为疏水作用的情况是一致的,而Cys两两成对,构成二硫键,对LOXL2的结构及功能发挥重要作用。讨论中,我们将预测结果与实验值进行比较,并用自由能微扰方法,对部分关键位点进行比较,从多方面论证此项工作的可信度。此项研究,可为靶向LOXL2的疾病治疗研究,提供重要指导。

DNA双链断裂是电离辐射诱发最严重DNA损伤,能启动细胞周期阻滞、修复和死亡系列信号反应,其中周期阻滞是DNA损伤应答的重要过程,为DNA损伤修复提供了充足的时间。周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent kinase 4/6,CDK4/6)、周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase1,CDK1)和Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)等是细胞周期调控关键激酶,其抑制剂可以阻滞细胞周期进程,是否具有细胞放射防护作用有待进一步探究。本文选择人宫颈癌细胞HeLa、人正常乳腺细胞MCF-10A以及人脐静脉上皮细胞HUVEC为研究对象,研究比较了PLK1抑制剂Rigosertib、Volasertib,CDK4/6抑制剂Palbocilib,CDK1抑制剂Ro-3306的辐射防护作用。流式细胞术检测表明,Rigosertib、Volasertib、Ro-3306将细胞阻滞于G₂期(P < 0.05,P < 0.01或P < 0.001),Palbocilib将细胞阻滞于G₁期(P < 0.05,P < 0.01或P < 0.001)。免疫荧光检测结果显示,Rigosertib、Volasertib、Ro-330可显著减少γ射线照射 后γH2AX foci数目(P < 0.001),表明上述药物可促进DNA修复。HR和NHEJ报告系统证实,Rigosertib、Ro-3306同时通过同源重组和非同源末端连接2种修复途径提高DNA修复效率(P < 0.05或P < 0.001),Palbocilib、Volasertib能提高HR修复效率(P < 0.01)。从上述结果优选出PLK1抑制剂Rigosertib进行深入研究,发现Rigosertib可显著降低辐射诱导的细胞凋亡(P＜0.05或P < 0.01)。CCK-8和克隆形成实验证实,Rigosertib促进受照后细胞的增殖与存活率(P < 0.05,P < 0.01或P < 0.001)。综上所述,我们分析比较了Rigosertib、Volasertib、Palbocilib、Ro-3306四种药物对细胞放射敏感性的影响,其中Rigosertib保护细胞免受辐射损伤最为显著,为放射损伤防护药物的研发提供了新的技术路径和实验依据。

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是由于骨髓造血干细胞的恶性增生导致的疾病。虽然酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKI)对慢性粒细胞性白血病的治疗取得长足进展,但耐药问题仍未解决。因此,寻找新的治疗药物和靶点十分关键。有研究表明,miRNAs与慢性粒细胞白血病在内的多种肿瘤有密切联系,齐墩果酸(oleanolic acid,OA)对白血病细胞有较好的抑制效果。通过对转录物组测序结果发现,齐墩果酸可以显著上调丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶4(serine/ threonine- protein kinase 4, STK4)的水平,而miR1a-5p是STK4的靶miRNA。因此,本文旨在探究齐墩果酸是否可以通过miR-18a-5p/STK4影响K562细胞恶性进展。K562细胞经齐墩果酸处理后差异表达基因富集在凋亡相关通路上。EdU实验和CCK-8实验结果发现,齐墩果酸降低K562细胞增殖能力(P＜0.05)。qRT-PCR,免疫荧光和Western印迹结果显示,齐墩果酸处理后,K562细胞中STK4蛋白质水平表达显著上调(P＜0.05),miR-18a-5p表达下调(P＜0.05)。在细胞中转染miR-18a-5p mimics,能显著抑制STK4的表达(P＜0.05);转染miR-18a-5p inhibitor能显著增加STK4的表达(P＜0.05)。活性氧(reactive oxygen species、ROS)检测和线粒体膜电位检测结果显示,齐墩果酸可以促进K562细胞中ROS的增加,降低线粒体膜电位。过表达STK4后,与Vector组相比,细胞的线粒体膜电位下降;敲降STK4可以逆转齐墩果酸组导致的线粒体膜电位下降。流式细胞术检测显示,齐墩果酸能明显促进细胞凋亡的发生,而转染miR-18a-5p mimics后凋亡率显著下调(P＜0.05);过表达STK4可以促进细胞从早期凋亡向晚期凋亡转化,而同时转染miR-18a-5p mimics可以抑制这一现象。我们的研究结果证实,齐墩果酸可以通过维持miR-18a-5p的低表达和保持STK4的高表达状态来促进K562细胞的凋亡。

心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床最常见的心律失常,对AF致病基因的研究,有助于AF早期筛查。本文旨在家族性AF人群和散发性AF人群中筛选具有潜在发病意义的易感基因,并对其在AF发生机制进行初步探讨。首先对4名家族性AF进行全外显子组测序 (WES),鉴定AF相关基因。然后用Sanger测序在非家族性AF人群和健康人群中证实易感基因突变情况,应用Western印迹分析其蛋白质表达情况,利用膜片钳技术分析突变基因对外向钾离子电流的影响。家族共有39人,其中有4人发生AF,这4名AF患者存在2个共有的突变基因FAM160A2(纯合突变,rs77726581 c.1375C>T)和MUC5B(杂合突变,rs199736618 c.12272C>T)。在52例非家族性AF患者中,有5例存在FAM160A2相同位点杂合突变,在健康人群中未发现此突变;而MUC5B在非家族性AF人群和健康人群中均发生杂合突变。FAM160A2蛋白在非家族性AF散发人群和健康人群中表达水平并无显著性差异。FAM160A2基因突变明显降低外向钾离子电流(与野生型比较,P<0.001)。由此可见,FAM160A2基因功能缺失性突变可能是AF发生的新分子生物学机制,可用于AF早期筛查。

蛋白酶体激活物复合物亚基 2(proteasome activator complex subunit 2, PSME2)表达异常与多种肿瘤发生发展密切相关,但在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中功能及临床意义尚不明确。本研究分析了TCGA-ESCC和GSE53625数据库中ESCC转录物组数据,发现PSME2高表达组ESCC患者预后不良,且ESCC组织中PSME2蛋白表达水平高于癌旁组织。沉默KYSE30细胞和NE6-T细胞中PSME2表达,ESCC细胞的增殖、侵袭、迁移和克隆能力均显著下降,同时伴随着LC3-II/LC3-I蛋白表达明显升高、p62蛋白表达降低和自噬激活。GSEA富集分析表明,PSME2低表达组IL-6/STAT3信号通路激活,沉默KYSE30细胞和NE6-T细胞诱导了IL-6分泌和p-STAT3表达增加。上述PSME2沉默诱导的分子变化,能够被LMT28或WP1066逆转。PSME2沉默联合WP1066,使KYSE30与NE6-T细胞培养上清中LDH含量明显升高,Calcein/PI染色表明,死亡细胞率分别为36.69%和32.55%,显著高于PSME2沉默(6.78%和6.74%)或WP1066单独处理组(18.34%和9.70%)。本研究表明,PSME2促进ESCC恶性进展,PSME2沉默通过IL-6/STAT3信号通路代偿性激活ESCC自噬,联合PSME2沉默和STAT3抑制通过合成致死效应诱导食管鳞癌细胞死亡,表明PSME2是ESCC潜在分子治疗靶点,联合抑制PSME2和STAT3是ESCC治疗的新选择。

越来越多的证据表明,长非编码RNA(lncRNA)在生物学功能调节中发挥着重要的作用。实时定量PCR(RT-qPCR)检测显示,与健康器官捐献者(n=23)相比,长非编码RNARP11-879F14.2在心力衰竭(heart failure,HF)患者(n=21)心肌中表达水平显著升高,但其在心肌肥厚调节中可能的作用和机制尚不清楚。利用腺病毒介导在乳小鼠心肌细胞(neonatal mouse ventricular cardiomyocytes, NMVCs)和乳大鼠心肌细胞(neonatal rat ventricular cardiomyocytes, NRVCs)中过表达RP11-879F14.2,检测对NMVCs中心肌肥厚相关基因,包括肌球蛋白重链(MYH7)、骨骼肌肌动蛋白(Acta1)以及心钠素(NPPA)表达的影响,结果显示,过表达RP11-879F14.2可显著抑制NMVCs和NRVCs中心肌肥厚相关基因表达。RT-qPCR和Western 印迹结果证实,当过表达RP11-879F14.2时可显著促进NMVCs中丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)表达。并且,过表达PKM2和RP11-879F14.2可一致地抑制NMVCs和NRVCs中心肌肥厚相关基因表达和去氧肾上腺素(phenylephrine, PE)诱导NRVCs的表面积增加,而敲降PKM2可逆转RP11-879F14.2对NMVCs中心肌肥厚相关基因表达的抑制作用。利用Seahorse 96XF细胞能量分析仪检测显示,过表达RP11-879F14.2和PKM2可一致增加NMVCs中葡萄糖代谢水平,而沉默PKM2对RP11-879F14.2上调NMVCs中糖酵解、三羧酸(TCA)循环和线粒体电子传递链(ETC)相关基因的表达有显著的抑制作用。因此,PKM2介导RP11-879F14.2发挥抑制心肌细胞肥大的作用。

随着细胞治疗的快速发展,大规模慢病毒的生产成为工艺环节中的瓶颈,因此,优化293T高滴度和高纯度的CAR慢病毒载体生产工艺显得至关重要。本研究旨在优化包装慢病毒的293T贴壁细胞,节省时间,节约成本,提高慢病毒包装的能力。同时对优化慢病毒载体中出现悬浮细胞结团生长的现象进行探索,检测其影响结团的因素。分别采用快速、慢速驯化方式将293T贴壁细胞驯化为悬浮培养,并比较其细胞形态、细胞密度、细胞活率、慢病毒包装能力和冻存复苏后稳定一致性,筛选出最优的悬浮驯化条件。通过调节Ca^2＋浓度和EDTA添加量来研究比较细胞结团生长状况。结果证明,使用无血清培养基OPM-293 CD05 溶剂(medium)可以将293T贴壁细胞快速驯化为293T悬浮细胞,并能制备出慢病毒滴度且优于贴壁细胞的包装滴度(^*P<0.05)。Ca^2＋浓度会影响细胞结团大小,添加EDTA能有效分离分散非必要的细胞抱团生长。研究结果显示,传统293T贴壁细胞可以使用无血清培养基OPM-293 CD05 溶剂快速驯化成悬浮细胞;在一定范围内,Ca^2＋浓度越高细胞所结团块及粒径越大,EDTA添加量越高细胞所结团块及粒径变小。这为优化慢病毒载体包装工艺和悬浮培养条件,同时为体外规模化细胞培养放大和生产奠定了理论基础,具有一定的实用价值。

识别关键蛋白质对疾病治疗、药物设计等领域有重要作用。本文首先采用5种节点重要性排序算法,对4种酵母菌PPI网络进行关键蛋白质识别,并通过分析不同网络之间共有的关键蛋白质,构建了关键蛋白质子网。再通过杰卡德相似度指标,筛选出子网中拓扑特征相似的关键蛋白质对,发现4种网络中存在Gavin-EPG 1、Gavin-EPG 2、Babu-EPG 1、Babu-EPG 2、LCMS-EPG、MALDI-EPG共6个核心蛋白质组。尽管它们大都是核糖体蛋白质,然而不同的酵母菌PPI网络中核心蛋白质组中蛋白质的组成差异很大。本文所发现的关键蛋白质以及核心蛋白质组对进一步研究核糖体上蛋白质如何相互作用影响肽链的合成以及折叠提供了重要的理论参考。

在多种肿瘤中,生长阻滞特异性转录因子5(growth-arrest specific transcript 5,GAS5)高表达与患者的良好生存期相关。GAS5存在多种剪接变异体,本研究探讨GAS5部分剪接变异体在髓系白血病细胞系中的表达模式。并基于对凋亡诱导敏感的慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞系K562,研究GAS5部分剪接变异体对K562细胞自身增殖、凋亡以及对靶向药物伊马替尼(imatinib,IM)的敏感性的影响。反转录PCR结果显示,GAS5剪接模式在髓系白血病细胞系HL-60、K562、NB4和KASUMI-1之间未见明显差异。相较于指数增长期,GAS5_AE表达水平在细胞密度引起的生长停滞期有一定程度的累积。通过核转染,将GAS5剪接变异体(pcDNA3-GAS5_1B、-GAS5_2B、-GAS5_3A、-GAS5_4A、-GAS5_O1或-GAS5_AE)转入K562细胞的单克隆株中。通过台盼蓝染色、吖啶橙染色后进行细胞计数,克隆形成实验检测细胞集落形成能力。结果与对照组相比,瞬时转染GAS5剪接变异体并无抑制细胞的基础增殖或增强细胞对药物的敏感性。建立GAS5_O1的稳定转染株,延长培养时程并计算倍增时间,发现GAS5_O1的表达水平和倍增时间成正比(R²=0.5692)。在稳转株O1-C8中观察到GAS5_O1可促进IM引起的细胞生长抑制(56.94%±2.84% vs. 36.07%±2.32%,P<0.05)和凋亡(29.33%±1.30% vs. 52.00%±2.52%,P<0.05)。上述结果表明,GAS5_O1的上调可能增加CML细胞的倍增时间,并使CML细胞对IM处理敏感。

在高等生物的进化过程中,mRNA的3′ 非翻译区(3′ untranslated region, 3′ UTR)序列显著增加,提示3′UTR在生物功能调节中可能发挥重要作用。我们发现狭缝引导配体1(slit guidance ligand 1, SLIT1) 3′UTR在肥厚型心肌病(HCM)患者心肌中水平降低,但其对肥厚心肌中血管功能调节的作用机制不清楚。利用腺病毒介导在主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs)中过表达SLIT1 3′UTR,检测HAECs中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases,eNOS)和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor, VEGFA)表达。分别采用划痕实验和基于Matrigel胶的管腔形成实验检测HAECs的迁移和成管腔能力。结果发现,过表达SLIT1 3′UTR会升高HAECs中p-eNOS、eNOS和VEGFA水平(P<0.01),并促进HAECs迁移和成管腔能力(P<0.01)。生物信息学预测提示,SLIT1 3′UTR上有多个微RNA(miRNA)的潜在结合位点,反义RNA纯化技术(RNA antisense purification, RAP)筛选和利用Ago2抗体进行(RNA结合蛋白质免疫沉淀 (RNA binding protein immunoprecipitation, RIP)结果显示,SLIT1 3′UTR与miR-34a-5p存在结合作用,而过表达SLIT1 3′UTR的HAECs中miR-34a-5p水平显著降低(P<0.05)。Western 印迹结果证实,miR-34a-5p可逆转过表达SLIT1 3′UTR对去乙酰化酶SIRT1的上调作用(P<0.05)。在HAECs中转染miR-34a-5p和si-SIRT1,可一致地抑制过表达SLIT1 3′UTR引起的p-eNOS、eNOS和VEGFA增加(P<0.05, P<0.01),及促进HAECs迁移和成管腔的能力(P<0.01, P <0.001)。因此,SLIT1 3′UTR可以特异性吸附miR-34a-5p,通过miR-34a-5p/SIRT1轴发挥促进内皮细胞迁移和管腔生成的作用。

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指肝中储存过多的脂肪,与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病(type-2 diabetes mellitus, T2DM)、血脂异常等代谢综合征密切相关。肝纤维化是NAFLD进一步发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的关键过程,减少肝内的脂肪积累,从而延缓或阻止NAFLD向纤维化的进展是治疗的关键。树豆酮酸A(cajanonic acid A, CAA)在2型糖尿病中能够有效改善胰岛素抵抗,发挥降糖减脂作用。本研究旨在探究CAA对NAFLD肝损伤的保护作用。通过采用db/db自发性NAFLD小鼠模型,将db/db小鼠分为NAFLD组和CAA给药组,CAA组予50 mg/(kg·d)灌胃给药,同期C57BL小鼠作为正常对照组(NC组),每组6只。小鼠生化指标检测和组织病理染色发现,CAA干预可有效缓解db/db小鼠的糖脂代谢紊乱、肝功能损伤(P＜0.05)及肝脂肪变性和减少脂质沉积(P＜0.05)。ELISA法结果显示,经过CAA治疗后肝组织上清液中白细胞介素1β(Interlecukin-1β, IL-1β)的水平显著降低(P＜0.05),提示CAA具有明显抗炎作用,并且CAA干预显著减轻小鼠肝的纤维化程度,天狼星红染色发现,CAA组胶原沉积显著减少(P＜0.05),进一步Western 印迹结果表明,CAA组纤维化相关基因纤连蛋白(fibronectin, FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)蛋白质水平表达降低,E-钙黏着蛋白(E-cadherin, E-ca)的表达升高(P＜0.05)。E2F转录因子1(E2F transcription factor 1, E2F1)被证实在肝中是葡萄糖和脂质代谢的主要因子,在肥胖小鼠中表达增加,并且可通过PPARγ的转录调节参与脂肪组织代谢,我们猜测,E2F1是CAA改善NAFLD肝脂质沉积和纤维化的中间作用靶标。通过免疫组织化学染色观察E2F1和其同家族拮抗转录因子E2F转录因子7(E2F transcription factor 7, E2F7)在小鼠经CAA处理后在肝组织核质中均表达,通过Western 印迹法和实时荧光定量PCR进一步检测蛋白质和mRNA的表达发现,在CAA组中E2F1较NAFLD组基因表达降低(P＜0.05),E2F7基因表达增加(P＜0.05),并且spearman秩相关分析提示,E2F1和E2F7呈显著负相关(P<0.05)。以上结果表明,树豆酮酸A可有效减轻db/db小鼠非酒精性脂肪性肝损伤,改善糖脂代谢紊乱,抑制脂质过度沉积,减轻肝纤维化以缓解NAFLD进一步发展,同时E2F1和E2F7可能参与了CAA改善脂质代谢和纤维化的过程。

藤黄健骨胶囊可以提高绝经后骨质疏松模型鼠的骨密度来改善其骨微结构损害,但具体机制尚未阐明。本文主要研究藤黄健骨胶囊抑制绝经后骨质疏松症大鼠成骨细胞凋亡与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路的关系,旨在探讨藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松症的作用机制。采用去卵巢法建立绝经后骨质疏松大鼠模型,分别给予藤黄健骨胶囊(0.09、0.18、0.36 g/kg)灌胃,连续干预8周后进行指标检测。采用TUNEL染色观察股骨组织凋亡情况,结果发现,藤黄健骨胶囊各剂量组股骨组织凋亡阳性细胞和凋亡率均减少(P<0.01)。采用双重免疫荧光染色观察股骨组织成骨细胞中SIRT1、PGC-1α和Nrf2表达水平表达情况,结果发现,藤黄健骨胶囊中、高剂量组成骨细胞PGC-1α表达荧光面积明显升高,各剂量组成骨细胞SIRT1和Nrf2表达荧光面积也明显升高(P<0.01)。qPCR和Western印迹检测股骨组织SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达水平和翻译水平变化,结果显示,藤黄健骨胶囊中、高剂量组股骨组织Runx2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2蛋白质水平均明显升高,Caspase-9蛋白质水平明显下降,各剂量组股骨组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2 mRNA水平也均明显升高,而其各剂量组股骨组织Caspase-3 mRNA水平、蛋白质水平和Caspase-9 mRNA水平均则明显降低(P<0.01)。综上,本研究初步揭示了藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松模型鼠成骨细胞凋亡的抑制与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路有关,SIRT1可能是调控成骨细胞凋亡的重要靶点。

基于纳米抗体(nanobody,Nb)和磁小体(bacterial magnetic particles,BMPs)的免疫磁珠在污染物分离分析中具有良好的应用前景,然而,不同长度柔性连接肽(linker)对免疫磁珠性能的影响尚未见相关报道。为了探究柔性连接肽长度对免疫磁珠的性能影响,本研究使用pET-28a作为载体,在磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine,SDM)Nb基因上融合了不同长度的柔性连接肽,分别为pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys和pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys,并使用大肠杆菌BL21(DE3)作为重组工程菌进行表达,最终获得Nb-(G4S)1-Cys和Nb-(G4S)4-Cys重组蛋白质。利用异源双功能试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP),分别将重组蛋白质与BMPs进行偶联,构建了免疫磁珠。利用免疫印迹对偶联结果进行了初步鉴定,并对偶联条件进行了优化。同时,使用透射电镜和Zeta电位分析仪对免疫磁珠的水合粒径、Zeta电位和分散性进行了分析。研究结果表明,SPDP能有效地将Nb-(G4S)1-Cys和Nb-(G4S)4-Cys定向固定在BMPs表面。通过差值法计算发现,Nb-(G4S)1-Cys与BMPs的偶联效率高于Nb-(G4S)4-Cys与BMPs的偶联效率。进一步表征结果显示,BMP-(G4S)1-Nb的Zeta电位绝对值更高,水合粒径更小,并且具有较低的多分散性指数,说明其在水相体系中具有更强的胶体稳定性。综上所述,利用BMPs和Nb-(G4S)1-Cys构建的免疫磁珠性能优于BMPs和Nb-(G4S)4-Cys构建的免疫磁珠。这为今后选择合适长度的连接肽构建高效的免疫磁珠分离分析SDM提供了理论依据。