代谢功能障碍相关脂肪性肝病(metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease , MASLD)已跃居我国慢性肝病首位,发病机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨mTOR信号通路(包括mTORC1和mTORC2)在肝细胞脂质代谢中的调控作用及其分子机制。首先以小鼠肝细胞AML-12为模型,建立油酸(OA)诱导的脂质累积模型,CCK8检测结果显示,0.4mmol/L OA对细胞生长无毒性,且油红O染色及TG含量检测结果显示,OA处理可以显著促进细胞内外脂质累积,Western印迹结果显示,OA处理可激活mTORC1信号通路。采用mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素,激动剂MHY1485,以及siRNA介导的Raptor和Rictor基因沉默技术,通过Western印迹、RT-qPCR和TG含量检测等方法,分析mTOR信号通路活性、脂质合成相关基因(PPARG、DGAT1、GPAT4、ACSL1)表达及甘油三酯(TG)代谢变化,结果显示,雷帕霉素抑制或Raptor沉默均能降低mTORC1通路活性,减少脂质合成相关基因表达和TG含量;而MHY1485激活mTORC1则进一步加剧脂质沉积。此外,沉默Rictor抑制mTORC2通路后,同样可降低p-AKT表达、TG含量及脂质合成基因转录水平。综上所述,本研究证实,在OA诱导的肝细胞脂质累积模型中,mTORC1和mTORC2信号通路均被激活,并共同通过上调脂质合成相关基因(PPARG、DGAT1、GPAT4、ACSL1)的表达,正向调控甘油三酯的合成,从而促进肝细胞的脂质沉积。

谷氧还蛋白2(glutaredoxin 2,Grx2)是一种重要的内源性抗氧化蛋白质,在维持细胞氧化还原平衡和线粒体功能中发挥着重要的作用。为探讨Grx2对高糖诱导的胰岛β细胞氧化应激和线粒体损伤的影响,本研究通过高糖(33mmol/L)作用48 h建立胰岛MIN6细胞损伤模型。CCK8和细胞胰岛素含量检测发现,Grx2能够增强高糖诱导抑制的细胞活力,并增加胰岛素的释放量(P＜0.01);细胞ATP含量和细胞线粒体通透性转换孔(MPTP)荧光检测发现,Grx2可以上调细胞内ATP含量(P＜0.01)、抑制高糖诱导的MIN6细胞MPTP开放(P＜0.01);活性氧(reactive oxygen species,ROS)及GSH/GSSG比值测定证实Grx2具有较强的抗氧化功能(P＜0.01);细胞内丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)以及细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性测定发现,Grx2可明显降低高糖环境下MIN6胰岛细胞MDA和LDH的水平(P＜0.01),同时升高SOD和CAT水平(P＜0.01);Western印迹进一步检测发现,外源性给予Grx2可以上调高糖抑制的Grx1 (P<0.05) 和Grx2蛋白质表达水平(P＜0.01)。以上结果表明,外源性给予Grx2可通过逆转高糖抑制的抗氧化蛋白Grx1和Grx2蛋白质水平表达,抑制高糖诱导的氧化应激和线粒体损伤,从而发挥保护胰岛β细胞功能的作用。

纳米/微塑料(nanoplastics/microplastics,NP/MPs)作为全球性新兴污染物,其暴露已被证实与胃肠道损伤密切相关;然而,NP/MPs引起的十二指肠损伤分子机制尚不明确。本研究基于ICR小鼠模型,分别对0.08μm、1 μm及10 μm三种粒径聚苯乙烯NP/MPs进行24 h急性(250mg/kg)和28 d亚急性(50mg/kg)暴露实验,旨在明确其体内分布特征及对十二指肠结构与功能的影响,并探讨潜在的分子机制。急性实验发现,NP/MPs在腹腔部位以灌胃途径蓄积最多,并在小肠绒毛结构间滞留与富集,且以小粒径颗粒富集更为显著。亚急性暴露后,十二指肠组织形态结构受损,杯状细胞数量减少。与对照组相比,NP/MPs暴露均导致十二指肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin与Zonula occludens-1(ZO-1)表达降低(P<0.05)。且NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)及炎症因子白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的表达呈现不同程度上升。进一步发现,活化的半胱天蛋白酶1与活化的半胱天蛋白酶3(P<0.001)、GSDMD-NT与GSDME-NT(P < 0.05)表达增加,提示细胞焦亡参与十二指肠损伤。以上结果表明,NP/MPs体内蓄积以经口途径为主,并在小肠中吸收和累积,可能通过触发NLRP3引起细胞焦亡参与十二指肠损伤。本研究为理解NP/MPs的肠道毒性机制提供了实验依据,对评估其健康风险以及制定相应的防护策略具有科学意义。

本研究聚焦于解析黄伞菌株 Pholiota adiposa YAHS 的木质纤维素降解机制,旨在为秸秆生物炼制提供理论依据与菌种资源。研究先采用苯胺蓝-愈创木酚平板筛选法,从陕北黄土高原分离出 11 株真菌,借助 DNS 法测定纤维素酶和木质素酶活性,并结合 ITS 序列分析,筛选鉴定出高效降解菌株 Pholiota adiposa YAHS 。利用 Illumina NovaSeq 平台与 Nanopore MinION 平台相结合开展全基因组测序,以 DESeq2 分析转录物组差异表达基因,基于 UPLC-QTOF-MS 开展非靶向代谢物组学研究,通过整合多组学数据解析其降解通路 。结果显示,Pholiota adiposa YAHS 基因组大小为 55.2 Mb,编码 719 个碳水化合物活性酶(CAZymes),其中糖苷水解酶(GHs)占比 37.4% 。多组学联合分析表明,该菌株可通过外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、β-甘露聚糖酶、单加氧酶等关键酶基因,经关键通路“蔗糖与淀粉代谢通路”及果糖和甘露糖代谢通路以及氨基苯甲酸降解通路等,降解糖化木质纤维素生成单糖、寡糖和糖醇等碳水化合物 。本研究初步通过多组学联合分析,解析了黄伞属真菌的木质纤维素降解机制,揭示多种纤维素降解酶在该过程中的关键作用,为新型生物炼制技术开发提供了重要的菌株资源与理论支撑 。

PDGF-D属于血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factors, PDGFs)家族成员,是结缔组织细胞的主要有丝分裂原,特异性结合并激活血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor β, PDGFRβ),在原肠胚形成、器官发育、早期血管形成过程中发挥重要作用。全长PDGF-D因其前结构域(prodomain)的抑制作用,以无活性潜伏态形式分泌。本研究为实现在体外可控激活PDGF-D,将Prodomain与生长因子结构域间的天然酶切位点替换为人鼻病毒3C蛋白质酶(HRV 3C)特异性识别序列(LEVLFQ↓GP)。该突变体在HEK-293T细胞中表达并分泌,经亲和层析纯化,可被3C蛋白质酶有效切割。切割所释放的生长因子结构域能特异性激活PDGFRβ受体的酪氨酸磷酸化活性。综上,本研究通过设计改造PDGF-D蛋白酶切割位点,在真核系统中实现了潜伏态蛋白质的体外表达与可控激活,为深入探究PDGF-D与其受体相互作用的分子机制提供了关键技术支撑。

转录因子调控紊乱与多种疾病密切相关,尤其在癌症中表现突出。然而,由于筛选过程的复杂性,鉴定调控转录因子的化合物仍然具有挑战性。为此,本文建立了一个基于双荧光素报告系统的化合物筛选系统。以肺癌细胞系H1299为模型,聚焦转录因子ZBTB11及其下游调控分子COQ3,改造荧光素酶报告体系,建立双荧光转录报告系统,同时结合IncuCyte S3自动化成像系统,实现了评估影响ZBTB11转录调控活性的高通量化合物筛选方法。该方法可在90 min内完成约300种化合物的拍摄及荧光相关数据的采集。应用此方法,本文在2 945种化合物中筛选出GMI/RMI排名前18种和排名后8种的化合物,通过免疫印迹验证了这些化合物的活性。本研究建立了一种新型高通量筛选平台,用于在特定细胞背景下鉴定调控目标转录因子活性的化合物。

ZC3H12A是一种具有RNA内切酶活性的免疫调节蛋白质,通过降低特定促炎因子(IL-1β)mRNA的稳定性,减少炎症介质的产生,并能通过阻断NF-κB信号通路的活性,负向调控炎症反应。近年发现,ZC3H12A在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用,但其在食管癌中的表达调控机制尚不清楚。本研究通过生物信息学方法、qRT-PCR和Western印迹分析发现,ZC3H12A在食管癌组织及细胞中高表达并与患者预后不良相关。通过UCSC基因组数据库,发现ZC3H12A基因包含5个NF-κB结合区,其中可信度最高的结合区包含1个经典的κB位点。在此基础上,通过ChIP-PCR实验证明IL-1β诱导食管癌细胞NF-κB结合ZC3H12A。通过ChIP-qPCR实验发现,IL-1β诱导NF-κB显著富集ZC3H12A的DNA片段。通过qPCR和Western 印迹检测发现,IL-1β诱导食管癌细胞上调ZC3H12A表达,然而NF-κB的抑制剂Bay11-7082及其siRNA显著阻断IL-1β诱导上调ZC3H12A表达。以上结果表明,在食管癌细胞中,IL-1β诱导NF-κB转录上调ZC3H12A。这提示NF-κB与ZC3H12A之间存在负反馈调控回路,参与维持炎症信号网络的动态平衡。本研究不仅揭示了ZC3H12A 在食管癌中的表达调控机制,还突出了NF-κB-ZC3H12A信号轴在食管癌炎癌转化中的重要性。

蜱通过吸血传播多种病原体,对全球公共卫生和人类健康构成严重威胁。然而,蜱在接触大量病原体的过程中自身却能免受感染,暗示其体内可能富含防御病原体的特殊活性物质。通过生物信息学分析,本文从全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)基因组数据库中注释到1个新型防御素基因IpDf3,并借助大肠杆菌重组融合蛋白质表达、亲和层析、小肠激酶酶切、RP-HPLC高效液相色谱等方法成功制备该多肽,用以后续验证其功能。抗菌实验表明,重组全沟硬蜱防御素Ox-IpDf3(氧化型IpDf3)对4种革兰氏阳性菌和2种革兰氏阴性菌均具有不同程度的抗菌活性,特别是对金黄色葡萄球菌(S. aureus AB94004)和表皮葡萄球菌(S. epidermidis AB208188)的抗菌作用尤为明显。同时,DTT处理和点突变半胱氨酸残基显著降低Ox-IpDf3抗菌活性,说明Ox-IpDf3多肽中分子内二硫键对其抗菌活性的发挥十分关键。杀菌动力学和扫描电镜结果表明,Ox-IpDf3能导致细菌表面出现不规则凸起或凹陷,甚至细胞膜的破裂,说明其抗菌机制可能与细胞膜的直接损伤密切相关。综上,这些研究有助于理解全沟硬蜱防御素的抗菌特性及其生理功能。

热激蛋白90 (heat shock protein 90,HSP90)是一类结构保守且在免疫过程中具有重要功能的蛋白质。此前已从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)血清中鉴定到一种分泌型HSP90(Mc-HSP90-S)。为了解该蛋白质在贻贝先天免疫系统中的生物学功能,对Mc-HSP90-S开展了序列特征、表达模式、原核重组表达以及表达产物体外活性分析。结果表明,Mc-HSP90-S由797个氨基酸残基组成,理论分子量为91.68 kD,理论pI为4.89。Mc-HSP90-S在贻贝免疫相关组织中具有相对高表达,热胁迫和微生物胁迫均可显著上调Mc-HSP90-S的基因表达量(P<0.05)。重组Mc-HSP90-S蛋白在体外表现出明显的抑菌活性和选择性微生物凝集活性,其机制可能在于通过消耗ATP而对细菌生长产生抑制。此外,重组Mc-HSP90-S可显著上调贻贝免疫信号相关基因TLR4在鳃组织的相对表达量(P<0.05)。上述结果为深入了解分泌型HSP90在贻贝中的免疫和分子功能奠定了基础。

基因组不稳定性与DNA损伤修复异常是肿瘤细胞的核心特征,亦是多种化疗药物的作用靶标。长非编码 RNA(long non-coding RNA)作为基因表达的关键调控因子,参与调节多种生物学过程。本研究利用顺铂(DDP)、过氧化氢(H₂O₂)、新制癌菌素(NCS)及紫外线(UV)辐照构建了4种DNA损伤模型,并鉴定发现lnc-DUSP6在顺铂诱导DNA损伤反应中特异性上调。功能获得与缺失实验结果表明,lnc-DUSP6能显著提高顺铂诱导的DNA修复能力与细胞存活率,进而引起顺铂耐药产生。检测发现,lnc-DUSP6在顺铂耐药的A549/DDP细胞中的表达水平显著高于顺铂敏感的A549细胞,并且沉默lnc-DUSP6可有效提高A549/DDP细胞的顺铂敏感性。Lnc-DUSP6临近基因DUSP6与与顺铂敏感性密切相关,RIP结果证实,lnc-DUSP6与DUSP6直接相互作用,并且沉默lnc-DUSP6后DUSP6的表达水平显著下调,提示lnc-DUSP6可能通过与DUSP6的相互作用提高其蛋白质稳定性。此外,过表达DUSP6可显著逆转lnc-DUSP6沉默对顺铂处理后DNA修复及细胞存活的抑制作用。综上所述,本研究阐明了lnc-DUSP6在顺铂耐药中的调控机制:lnc-DUSP6通过与DUSP6相互作用增强其蛋白质稳定性,促进顺铂诱导的DNA损伤修复,从而引起顺铂耐药的产生。本论文的研究,不仅加深对顺铂耐药产生机制的理解,也为提升顺铂的临床抗肿瘤疗效提供新的策略。

CD28作为以胞外可变免疫球蛋白样结构域为特征的共刺激分子亚家族的创始成员,是T细胞中关键的共刺激受体,它与抗原提呈细胞表面的B7(CD80、CD86)分子结合产生协同刺激信号,在癌症治疗中具有重要地位。但目前只有少量抗体药物开发管线。本研究利用原核表达纯化专利CN114605540A所筛选的抗CD28纳米抗体(anti-CD28 nano antibody,_CD28Nb),并通过酶联免疫吸附实验测定_CD28Nb与CD28的结合活性。随后采用坐滴法获得晶体,利用X射线衍射技术剖析_CD28Nb的晶体结构并用拉式图(ramachandran plots)评估模型质量,通过分子对接阐明其在CD28胞外结构域上的结合表位。结果表明,_CD28Nb结构分辨率为1.43 Å,空间群为P4₁2₁2,_CD28Nb在CD28上的识别表位共25个。经对比发现,_CD28Nb与已发表的CD28-抗体复合物的结合模式高度相似,凭借其广泛的结合界面展现出作为CD28信号调控工具的潜力。

长非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在细胞生理和病理过程中发挥着重要的调控作用。本研究聚焦于长非编码RNA DANCR(lncRNA DANCR),探索其通过竞争性结合微RNA(microRNA, miRNA)miR-125a-5p间接调控Smurf1的分子机制。通过生物信息学预测、双荧光素酶报告实验和RNA免疫共沉淀检测,我们发现DANCR能够与miR-125a-5p发生物理结合(P＜0.001),且这种结合具有特异性。进一步的研究表明,DANCR的过表达能够抑制miR-125a-5p对Smurf1的抑制作用(P＜0.01),从而上调Smurf1的蛋白质水平。在HEK-293T细胞模型中,DANCR的高表达与Smurf1的高表达呈正相关,表明DANCR可通过ceRNA机制促进Smurf1的升高。本研究揭示了DANCR-miR-125a-5p-Smurf1轴在细胞调控网络中的重要作用,为相关疾病的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。

本文基于嘌呤能受体P2X配体门控离子通道7的受体(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7,P2X7R)/ NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)信号通路探讨牛膝提取物 (achyranthes bidentata extract, ABE)对大鼠膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的效果及机制。在动物实验中,采用“内侧副韧带横断(medial collateral ligament transection,MCLT)+部分半月板切除术(partial meniscectomy,PM)”建立大鼠KOA模型。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色和番红固绿染色评估膝关节软骨损伤情况,TUNEL染色评估软骨细胞凋亡情况。微型计算机断层扫描技术(micro-computed tomography,Micro-CT)评估骨损伤和KOA严重程度。在体外实验中,采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理大鼠膝关节原代软骨细胞,四唑盐比色(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)法和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞活力和细胞毒性情况。酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫印迹法(Western blot,WB)检测各组炎性细胞因子和基质蛋白质水平。流式细胞术检测天冬氨酸特异性的胱天蛋白酶 1(cysteine-requiring aspartate protease 1,Caspase-1)活性。免疫荧光法检测软骨细胞内NLRP3水平。体外研究结果表明,通过ELISA检测,ABE显著降低了大鼠原代软骨细胞中LDH的释放量(P<0.01),同时炎症因子白介素-18(interleukin-18,IL-18)(P<0.01)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)(P<0.01)水平也明显受到抑制;此外,Western印迹分析进一步揭示,ABE处理有效抑制了软骨降解酶基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)(P<0.01)和基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)(P<0.001)的蛋白质表达,同时显著提升关键基质蛋白Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ,Collagen Ⅱ)(P<0.001)的水平,共同证实ABE通过调控炎症与基质代谢通路抑制软骨细胞焦亡和损伤的机制;体内实验进一步证实,ABE有效改善KOA大鼠软骨组织损伤(例如H&E染色显示结构破坏减轻,番红固绿染色表明基质流失减少),抑制骨赘形成及软骨细胞焦亡;分子机制上通过下调P2X7R(P<0.001)、NLRP3(P<0.001)等通路蛋白质表达延缓KOA进展。ABE通过抑制P2X7R/NLRP3信号通路抑制软骨细胞焦亡,改善软骨组织损伤,从而延缓大鼠KOA的病理进展,表明ABE可能是一种有前景的KOA治疗药物。

幽门螺杆菌(helicobacter pylori, H. pylori)在介导胃黏膜损伤中发挥了极其重要的作用,同时研究表明,中高海拔与慢性胃炎也存在显著联系。本研究旨在探究缺氧协同H. pylori感染在调节胃上皮细胞病理性炎症损伤中的影响及其潜在的作用机制。通过收集平原及高原地区未感染和感染H. pylori临床患者胃窦黏膜组织,并体外构建缺氧协同H. pylori感染胃上皮的细胞及人胃类器官模型,运用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)和Western印迹检测缺氧协同H. pylori感染对胃黏膜病理性炎症损伤,以及缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)表达的影响,结果发现,在体内的人胃炎临床样本及体外胃上皮细胞及胃类器官模型中,缺氧协同H. pylori感染可诱导HIF-1α表达水平上调(P＜0.05);经在体外细胞模型中进行信号通路筛查,探讨缺氧协同H. pylori感染诱导HIF-1α表达上调的机制发现,当PI3K/AKT信号通路被阻断时,缺氧协同H. pylori感染诱导的HIF-1α的表达受到显著抑制(P＜0.05);最后利用生物信息学及转录物组测序对HIF-1α调控的下游靶基因进行初步验证,结果提示,溶质载体家族2成员1(solute carrier family 2 member 1, SLC2A1)是HIF-1α调控的下游重要靶分子之一(P＜0.05)。综上结果表明,缺氧协同H. pylori感染可经PI3K/AKT通路诱导HIF-1α表达上调,后者可促进SLC2A1的表达上调,提示高原地区H. pylori感染患者其胃黏膜微环境中糖酵解水平可能更活跃,这为研究缺氧协同H. pylori感染胃上皮细胞病理性炎症损伤的作用机制提供了新的理论支撑,也为防治缺氧协同H. pylori感染相关性胃炎提供新思路。

热激蛋白(heat shock protein, HSPs)是一类广泛存在于各种生物体中的应激蛋白质,当机体受到不良刺激时会迅速合成,发挥保护机体作用。DNAJC5是热激蛋白质HSP40家族的一员,本文旨在探究其在东北林蛙(Rana dybowskii)细菌性感染中的作用。本研究通过同源克隆方法获得东北林蛙DNAJC5全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;再采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)注射东北林蛙,构建炎症模型;运用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)技术检测Ah胁迫下DNAJC5在不同组织中的转录水平,利用免疫印迹(Western blot)技术,分析不同感染时间点DNAJC5蛋白的动态变化。结果显示,东北林蛙DNAJC5基因CDS区全长600 bp (NCBI登录号为:OQ944896),编码199个氨基酸,序列中含有DNAJ保守结构域,属于典型HSP40家族成员。qRT-PCR结果显示,DNAJC5在不同组织中均有表达,正常生理状态下,DNAJC5基因在脾中表达量最高,肝次之;感染Ah后肝、脾、肺、肾、皮肤和胃DNAJC5 mRNA 均在12 h达到表达量峰值(P<0. 01),心和肌肉组织在6 h达到峰值(P<0. 01)。Western印迹分析显示,DNAJC5蛋白在肝和脾中分别增加了1.39 和 1.13 倍(P>0.05),呈先升后降的动态表达趋势,转录和翻译水平二者具有一致性。综上所述,DNAJC5基因可能参与对抗Ah侵染的免疫应答过程,本研究结果为进一步探讨两栖类的抗细菌感染机制提供理论依据。

MYB蛋白质家族是植物中最大的转录因子家族之一,广泛参与生长发育、逆境应答及次生代谢过程,但金银花MYB蛋白质家族成员尚未被鉴定。本研究采用生物信息学方法对其进行全基因组鉴定与分析,涵盖基本理化性质、系统进化树、基因结构、保守基序、顺式作用元件等,并通过构建pCAMBIA1300-GFP融合载体、烟草叶片瞬时转染检测MYB6、MYB106d、MYB114蛋白质的亚细胞定位。结果显示,共鉴定到147个LjMYB基因,分属17个亚家族(S1~S17);其编码氨基酸长度52~1 060 AA,等电点4.42~11.52 pI,外显子1~13个,分子量6 086.3~119 075.08 kD。MEME分析发现,不同MYB的基序数量及分布存在差异,同一亚家族结构特征相似;顺式作用元件分析表明,其启动子区域含光响应、激素应答及生物与非生物胁迫相关元件和结合位点。染色体分布显示,MYB基因存在显著基因组加倍(可能与染色体进化加倍相关);金银花与拟南芥MYB基因的共线性分析显示,121对同源基因分布于拟南芥所有染色体,体现进化保守性。表达谱分析表明,金银花MYB基因在生长发育中作用不同,且对不同光照强度敏感程度有差异;亚细胞定位显示,LjMYB6、LjMYB106d以及LjMYB114均定位于细胞核。综上,金银花MYB蛋白质家族具有多样生物学特性,可能参与生长发育、激素调控及生物/非生物胁迫响应过程。

胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)、代谢综合征(metabolic syndrome)及代谢相关的脂肪肝疾病(metabolic-associated fatty liver disease, MAFLD; non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)等多种代谢疾病的共同病理改变。肝胰岛素信号通路失调是胰岛素抵抗的重要原因,但其调控机制尚待进一步解析。人抗原R蛋白(human antigen R, HuR)是一种重要的RNA结合蛋白质,其通过对相关基因的转录后调控维持细胞代谢稳态。本研究利用肝细胞HuR特异性敲除小鼠(HuR cKO)模型,探讨了肝细胞HuR缺失对胰岛素敏感性以及相关信号通路的影响。研究发现,HuR cKO小鼠在8周高脂喂养后表现出明显的胰岛素抵抗,表现为空腹血糖升高(P＜0.05)和胰岛素敏感性下降(P＜0.01)。进一步研究显示,HuR缺失显著下调胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate protein-2, IRS2)的蛋白质水平(P＜0.01),伴随下游苏氨酸激酶2(threonine kinase 2, AKT2)(P＜0.05)及糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase-3 β, GSK3β)信号通路活性减弱(P＜0.01)。就机制而言,HuR结合IRS2 mRNA的3′非翻译区(3′ untranslated regions, 3′ UTR),促进其mRNA稳定性,进而促进了IRS2的蛋白质表达水平(P＜0.01)。上述研究从HuR对IRS2的转录后调控角度解析了胰岛素抵抗的机制,为相关干预提供了实验依据。

长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis)是我国特有的淡水鲸类,种群数量仅约1 200头,属极度濒危物种。雌雄长江江豚在生长发育方面存在显著差异,为解析其性别差异的分子调控机制,本研究聚焦于非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)——一类关键的基因表达调控因子,在性别决定与分化中扮演重要角色。基于全转录物组测序技术,系统分析了雌雄长江江豚血液中ncRNA的差异表达谱及其功能注释。结果显示,共鉴定出205个差异表达环状RNA(雌性上调87个,下调118个)、122个差异表达的长非编码RNA(雌性上调54个,下调68个)和48个差异表达的微RNA(雌性上调32个,下调16个)。功能富集分析表明,这些差异表达的ncRNA通过能量代谢(例如ATP结合、PI3K-Akt通路)、免疫调节及信号转导等核心生物学过程协同调控两性分化。荧光定量PCR对关键下游基因(MAPK1、IRS1、ALAD和C1QC)的验证结果,与测序数据揭示的调控趋势一致,为差异ncRNA的功能提供了间接实验证据。本研究系统揭示了ncRNA在长江江豚性别差异中的多维调控网络,为理解其生理分化机制及制定濒危物种保护策略提供了分子层面的理论依据。

泛醇-细胞色素C还原酶复合物伴侣(ubiquinol-cytochrome C reductase complex chaperone,BCS1L)主要参与线粒体复合体Ⅲ组装,与线粒体遗传病发病、前列腺癌患者疲劳等有关,然而其在结肠腺癌中的作用尚不清楚。本研究通过整合多组学分析和功能实验,系统探讨了BCS1L在结肠腺癌中的临床意义及分子机制。结果发现,BCS1L在结肠腺癌组织中表达水平显著上调(P<0.05),其高表达与患者不良预后及年龄显著相关(P<0.05)。功能富集结果显示,BCS1L与有机阴离子转运、羧酸转运、有机酸转运等相关信号通路有关。免疫细胞浸润结果显示,BCS1L高表达组中Treg细胞占比增多。突变图谱结果显示,PCLO、ABCA13、LRP1B、FAT3、HYDIN和SOX9等基因突变频率在BCS1L高表达组显著升高(均P<0.05)。实验验证结果显示,敲低BCS1L能够显著抑制结肠腺癌细胞的增殖能力、克隆形成能力及迁移能力(均P<0.05)。以上研究结果表明,BCS1L可能通过调控物质转运及调节免疫抑制性肿瘤微环境在结肠腺癌细胞生长和迁移过程中发挥关键作用。

小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)凭借其多向分化潜能和自我更新特性,已成为解析哺乳类胚胎发育机制的理想模型。叶酸作为一碳代谢的核心辅酶,其缺乏导致的神经管缺陷(neural tube defects, NTDs)已成为全球性公共卫生问题^[1],但其致病机制不明。叶酸是否会通过影响小鼠胚胎干细胞向神经谱系分化进而参与NTDs疾病的发生尚不明确。本研究通过构建叶酸缺乏mESCs向神经谱系分化模型,系统解析叶酸在神经谱系定向分化中的作用及其与神经管畸形发生的潜在关联。研究结果显示,在mESC向神经谱系分化过程中,叶酸缺乏mESCs诱导的拟胚体直径显著小于正常叶酸对照组(P<0.05);通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)及免疫荧光检测神经前体细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达水平,结果显示, 相较于正常叶酸对照组,叶酸缺乏组巢蛋白的mRNA水平和蛋白质水平均下降(P<0.05)。此外,免疫荧光染色也显示Ki67荧光水平在叶酸缺乏组明显下降(P<0.05),提示叶酸缺乏诱导分化的神经前体细胞增殖能力受损。同时,在神经分化过程中的关键时间节点第4d(day 4, D4)、第8d(day 8, D8)分别对其进行转录物组测序。分别对比对照组和叶酸缺乏组在D4和D8的差异表达基因(differentially expressed gene,DEGs)进行GO功能富集,结果提示,叶酸缺乏导致中胚层分化偏倚,提示叶酸缺失可能通过破坏胚层命运决定导致神经分化异常。比较D4和D8的对照组和叶酸缺乏组DEGs,KEGG通路分析进一步揭示PI3K-AKT、MAPK及Wnt信号通路在叶酸缺乏组显著富集。Western印迹检测PI3K、AKT及其磷酸化蛋白质水平在叶酸缺乏组的D8显著升高,使用PI3K抑制剂可使叶酸缺乏组Nestin、Pax6、Otx2表达水平显著升高(P<0.05),可挽救叶酸缺乏导致的外胚层分化下降现象。综上,本研究通过构建叶酸缺乏小鼠胚胎干细胞分化模型,揭示叶酸在神经谱系命运决定过程中的作用,阐明叶酸缺乏导致的谱系命运决定异常可能是NTDs发生的原因之一。本文的研究为阐释叶酸缺乏导致神经管畸形的致病机制提供新视角,也为相似发育缺陷的致病机制研究提供新的理论依据。

细胞周期调节基因核糖核苷酸还原酶调节亚基M2(ribonucleotide reductase regulatory subunit M2,RRM2)在多种癌症中能够引发细胞衰老、细胞周期停滞或细胞死亡。尽管已有研究表明RRM2在癌症细胞中发挥重要作用,但关于RRM2通过索拉非尼(sorafenib,Sor)调控铁死亡的具体机制仍缺乏系统的阐述。本研究旨在探讨RRM2通过索拉非尼诱导肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞发生铁死亡的作用机制。分别使用不同浓度的索拉非尼(0,10,15,20,25,30 μmol/L)干预人肝母细胞瘤细胞(HepG2)和人肝胆癌细胞(Huh7),随后通过CCK8法检测加用索拉非尼对HepG2细胞和Huh7细胞增殖抑制的影响,确定建立HepG2和Huh7细胞模型的最适浓度,实验分组PCDH组(转染空载质粒的细胞,作为过表达对照)、PCDH+sor组(转染空载质粒联用11 μmol/L索拉非尼干预细胞)、OE-RRM2组(过表达细胞中的RRM2)、OE-RRM2+sor组(转染RRM2过表达载体联用11 μmol/L索拉非尼干预细胞)、SINC组(转染空载体的细胞,作为敲低对照)、SIRRM2-1、SIRRM2-2、SIRRM2-3组(运用siRNA敲低细胞中的RRM2)。CCK-8和平板克隆实验结果表明,敲低RRM2导致细胞增殖能力降低,而过表达RRM2与上述结果相反(P＜0.05);谷胱甘肽(glutathione,GSH)结果表明,敲低RRM2导致细胞GSH含量降低,而过表达RRM2与上述结果相反(P＜0.05);胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的结果表明,敲低RRM2导致细胞ROS含量升高,而过表达RRM2与上述结果相反(P＜0.05);线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的结果表明,敲低RRM2导致细胞MMP升高,而过表达RRM2与上述结果相反(P＜0.05);qRT-PCR及Western印迹的结果表明,敲低RRM2导致谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和GSH合成酶(glutathione synthetase,GSS)及缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)/诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达水平降低,而RRM2过表达组与上述结果相反(P＜0.05)。免疫荧光(immunofluorescence,IF)的结果表明,敲低RRM2导致HIF-1α蛋白的表达水平降低(P＜0.05)。以上研究结果表明,肝癌细胞内的RRM2可以通过索拉非尼的影响来激活,进而抑制肝癌细胞发生铁死亡。同时,RRM2可能通过激活HIF-1α/iNOS/VEGF信号通路抑制细胞铁死亡促进HCC恶性进展。

肥胖及相关代谢性疾病在全球范围内的流行已成为重大公共卫生挑战,亟需寻找有效的干预策略。白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT)“棕色化”与线粒体生物发生作为改善能量代谢的新靶点,其调控机制尚未完全阐明。达格列净(dapagliflozin, DAPA)是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2, SGLT2)抑制剂,除降糖作用外,是否通过调节脂肪代谢发挥抗肥胖效应,目前尚不明确。本研究旨在探讨DAPA是否通过腺苷酸活化蛋白质激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)依赖性机制促进线粒体生物发生、诱导WAT“棕色化”,从而改善肥胖及相关代谢紊乱。通过高脂饮食诱导的C57BL/6J肥胖小鼠模型和3T3-L1脂肪细胞模型,从体内和体外两个层面评估DAPA的干预效果。结果显示,DAPA显著降低肥胖小鼠的体重、脂肪组织及肝的重量(均 P < 0.05),改善血脂异常与肝功能损伤(均 P < 0.05),并减轻脂肪细胞肥大和肝脂肪变性。蛋白质印迹和免疫组织化学染色结果表明,DAPA可上调3种脂肪组织中解偶联蛋白1、线粒体转录因子A、核呼吸因子1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α及磷酸化AMPK的蛋白质表达(均 P < 0.01),并增加线粒体DNA含量(P < 0.01)。细胞实验进一步表明,DAPA以浓度依赖方式减少脂质积累,增强线粒体膜电位和三磷酸腺苷水平,并促进上述因子表达(均 P < 0.01);而使用AMPK抑制剂Compound C或线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮可部分逆转该效应(均 P < 0.01)。本研究结果提示,DAPA通过激活AMPK依赖性机制促进线粒体生物发生、诱导WAT“棕色化”并增强棕色脂肪组织功能,从而改善肥胖及代谢紊乱。该发现不仅深化了对SGLT2抑制剂多效性的理解,也为其拓展应用于非糖尿病肥胖的治疗提供了理论依据与实验支持。

本研究旨在探讨胰淀素 (amylin) 是否通过室旁核 (paraventricular nucleus PVN) 内MC4R神经元调控食欲及血糖。本文利用抗体标记和Western印迹分析验证了胰淀素的抑食效应及其对室旁核内c-Fos的激活作用。在使用胰淀素受体拮抗剂 AC187 时,食欲抑制与室旁核内c-Fos表达被阻断 (P<0.01),这表明胰淀素的作用主要通过其受体激活实现。进一步通过脑立体注射AAV-Cre-EGFP病毒实现室旁核内MC4R条件性敲除 (CKO),结果显示,MC4R表达下降约80% (P<0.01),CKO小鼠注射胰淀素后采食量介于对照组之间,提示MC4R神经元在抑食中发挥部分作用。糖耐量实验表明,胰淀素预处理30 min后显著改善小鼠葡萄糖耐受能力 (P<0.01),而CKO小鼠中的降血糖效应部分减弱 (P<0.05),表明MC4R也参与血糖调控。同时为鉴定室旁核内MC4R神经元类型,本文通过FISH和免疫荧光技术检测其与囊泡γ-氨基丁酸转运体(intracellular vesicular GABA transporter, VGAT) 及囊泡谷氨酸转运蛋白2 (vesicular glutamate transporter 2, VGlut2) 的共表达,发现MC4R主要与VGlut2阳性兴奋性神经元共定位 (≈50%,P<0.01)。以上结果表明,胰淀素能部分通过室旁核内MC4R兴奋性神经元调控食欲和血糖代谢,提示胰淀素在能量稳态中的多重调节能力。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m⁶A)是真核生物中最丰富的RNA修饰形式之一,在基因表达调控、细胞增殖与分化等过程中发挥关键作用。m⁶A甲基转移酶METTL3作为该修饰的核心酶,其结构特征与细胞功能关系尚需深入解析。本研究旨在构建人源METTL3的原核表达体系,并探讨其重组蛋白质在肺上皮细胞中的功能作用。通过RT-PCR从HEK-293T细胞中扩增METTL3 CDS序列,克隆至pET28a表达载体,构建含His标签的重组表达质粒。经IPTG诱导,METTL3主要以包涵体形式表达,利用8mol/L尿素裂解及200mmol/L咪唑梯度洗脱纯化该蛋白质,Western印迹验证其表达正确和纯度较高。功能实验发现,重组METTL3处理BEAS-2B细胞后可显著增强细胞增殖活性,尽管m⁶A修饰水平未出现明显变化。综上结果表明,成功构建并获得功能性His-METTL3蛋白,初步提示其可能通过非m⁶A依赖机制促进肺上皮细胞增殖,为进一步阐明METTL3调控机制及其在表观遗传和肺疾病研究中的应用提供了实验依据和理论基础。

知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)是我国著名的传统中药材之一,其广泛的药用功效与其体内的活性成分密切相关。类黄酮糖苷作为知母的重要活性成分之一,具有多种药理活性,近年来受到研究者们的重视。作为催化类黄酮糖苷生成的下游关键修饰酶,糖基转移酶在类黄酮糖苷的生物合成途径中发挥着至关重要的作用。然而,知母中类黄酮糖基转移酶的相关报道较少。本研究基于知母转录物组数据挖掘并克隆出1条糖基转移酶基因AaUGT2。序列分析表明,AaUGT2的开放阅读框长度为1 347 bp,编码448个氨基酸。实时荧光定量PCR显示,AaUGT2在知母的须根、根茎和叶部位均有表达,其中,AaUGT2在根茎中表达量最高。原核表达表明,AaUGT2成功表达出可溶性蛋白质,重组蛋白质大小理论值为70.88 kD。体外酶促反应检测显示,AaUGT2具有类黄酮7-O-糖基化活性。本研究成功从知母中挖掘并克隆出AaUGT2基因,并通过功能验证证实AaUGT2属于类黄酮7-O-糖基转移酶,为进一步解析知母类黄酮糖苷生物合成途径奠定基础。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原发性癌症的主要形式,与CD8^＋ T细胞免疫浸润及免疫抑制密切相关。本研究旨在构建HCC患者CD8^＋T细胞相关预后风险模型,并将其用于治疗指导。通过整合整体和单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据,我们鉴定出稳定的CD8^＋ T细胞特征基因。这些特征基因构建出三基因风险评分模型(KLRB1、RGS2和TNFRSF1B),并且该模型的预后能力在外部独立队列中得到验证。将患者分为高风险组和低风险组,发现两组免疫微环境存在显著差异:高风险患者M2巨噬细胞丰度增加(P<0.0001),而低风险患者表现出升高的CD8^＋ T细胞浸润(P<0.001)。高风险组对免疫治疗的预测反应较差(P<0.01)。药物敏感性分析表明,高风险患者可能受益于PI3Kβ抑制剂AZD6482和TGFβR抑制剂SB505124等药物。相反,低风险患者的治疗选择包括IGF-1R抑制剂BMS-754807及新的基于嘧啶的抗肿瘤代谢药物吉西他滨。免疫组织化学证实了模型基因在HCC肿瘤和邻近组织中的差异表达。总之,我们建立并验证了CD8^＋ T细胞相关的风险模型,有效预测HCC患者预后并为个性化治疗策略提供信息。

双硫死亡状态与肿瘤患者炎症反应、免疫抑制和药物敏感性相关。然而,其在结直肠癌诊疗中的价值尚不清楚。基于此,研究使用单细胞测序数据和细胞特异性标记基因分析双硫死亡与不同结直肠癌细胞类型的相关性,发现结直肠癌高双硫死亡区域集中于上皮类细胞中。结合程序性细胞死亡蛋白1抑制剂治疗结直肠癌患者的肿瘤组织差异基因表达数据,建立双硫死亡相关预后模型分析发现,高双硫死亡水平结直肠癌患者风险较低,免疫治疗敏感性高。结合空间转录物组学分析发现,双硫死亡相关基因泛醇细胞色素C还原酶核心蛋白Ⅰ(ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1, UQCRC1)是潜在的结直肠癌诊疗靶点,其表达在上皮类结直肠癌细胞中较高,与结直肠癌免疫浸润区域存在共定位。进一步的生信分析和实验检测显示,UQCRC1在结直肠癌组织中低表达,过表达UQCRC1可抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移,是潜在的结直肠癌诊疗靶点。

胃癌是全球发病率和死亡率均居前列的消化道恶性肿瘤,亟需开发更有效的靶向治疗策略。多聚(ADP-核糖)腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly (ADP-ribose) polymerase,PARP)抑制剂已在同源重组修复(HR)缺陷型肿瘤中取得显著疗效,但在胃癌中的应用受限。临床研究发现,幽门螺杆菌感染合并同源重组修复(HR)基因缺陷罹患胃癌的风险将大幅提高,因此,PARP抑制剂极大可能会使胃癌患者获益。基于此本研究通过利用激酶抑制剂库与PARP抑制剂进行联合用药筛选,发现细胞周期依赖性激酶8/19(cyclin dependent kinase 8/19,CDK8/19)抑制剂Senexin A与PARP抑制剂合成致死效果显著(P<0.05)。通过CCK8和克隆形成实验证实,联合用药较单药处理具有更强的抗增殖和克隆抑制能力(P<0.0001)。机制上,通过彗星电泳实验发现,联合用药组出现了比单药组更显著彗星拖尾(P<0.0001),说明该过程是通过抑制DNA修复相关通路促进DNA损伤从而实现对肿瘤更好的杀伤效果。另外,我们还发现单独使用CDK8/19抑制剂细胞内γH2AX及53BP1 foci的数目显著增加(P<0.0001),这说明CDK8/19影响了辐射后的胃癌细胞DNA损伤修复过程。通过转录物组测序分析发现,CDK8/19抑制剂靶向胃癌细胞中的DNA损伤修复、细胞周期调控以及RNA剪接等相关信号通路。免疫共沉淀实验证实,抑制CDK8/19激酶活性可以显著抑制PARP1的磷酸化水平。免疫组化结果发现,CDK8在胃癌组织中高表达,具有潜在的预后与治疗靶点价值。综上所述,本研究从机制上揭示了CDK8/19增强PARP抑制剂敏感性的作用路径,为胃癌的精准治疗和PARP抑制剂适应症扩展提供了理论依据和转化潜力。

岩藻多糖(fucoidan,FUC)是一种天然的海藻类药物。本文前期研究发现,岩藻多糖能显著抑制人骨肉瘤143B细胞活性并诱导其死亡,但是其作用机制不详。铁死亡(ferroptosis)是一种新型细胞死亡方式,目前已经成为治疗肿瘤的重要靶点。本研究旨在探究FUC诱导143B细胞铁死亡情况,并阐明其潜在的分子机制。采用不同浓度岩藻多糖(0、10、100、400 μg/mL)处理143B细胞48 h,每个浓度设4个复孔,每组实验至少重复3次。CCK-8和LDH检测结果显示,岩藻多糖(10、100、400 μg/mL)可显著降低143B细胞活力并诱导其死亡;钙黄绿素-乙酰氧基甲酯(calcein-AM)染色、FeRhoNox-1染色和C11 BODIPY 581/591染色结果表明,岩藻多糖显著增加143B细胞内不稳定铁池(LIP)、Fe²⁺和脂质活性氧(Lip ROS)水平;谷胱甘肽(GSH)检测结果显示,岩藻多糖明显降低细胞内谷胱甘肽含量;RT-qPCR结果显示,岩藻多糖显著降低铁死亡相关因子溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA水平,增加前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)的mRNA水平;Western印迹分析发现,岩藻多糖显著降低SLC7A11和GPX4蛋白质水平,增加ACSL4蛋白质水平,并减少p-PI3K/PI3K比值、p-AktSer473/Akt和p-AktThr308/Akt比值;免疫荧光染色结果发现,岩藻多糖显著抑制p-AktSer473的核转位。铁死亡抑制剂 ferrostatin-1(Fer-1)和铁螯合剂 deferoxamine(DFO)可明显抑制岩藻多糖诱导的143B细胞死亡;此外,PI3K/Akt通路的激活剂740Y-P显著抑制 岩藻多糖诱导的143B细胞铁超载和脂质过氧化,并恢复SLC7A11和GPX4 蛋白质水平。以上结果表明,岩藻多糖可通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导143B细胞铁死亡,这可能是预防和治疗骨肉瘤疾病的潜在靶点。

乳腺癌(breast cancer,BRCA)的高转移与复发率使其成为全球癌症相关死亡的主要原因之一,探索其分子机制就显得尤为重要。课题组前期研究已证明,miR-326调控EPHB3抑制BRCA细胞的进展。本研究进一步探讨LncRNA通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)机制与EPHB3竞争性结合miR-326影响BRCA进展的分子机制。通过生物信息学分析筛选出与miR-326具有潜在结合位点的LncRNA SNHG12,结果显示,SNHG12在BRCA组织中显著高表达,且与miR-326之间存在表达水平的负相关趋势,与EPHB3之间存在正相关趋势,提示其可能参与ceRNA调控网络。核质分离实验表明,SNHG12主要定位于胞质,双荧光素酶报告实验验证了其可直接结合miR-326。功能实验表明,敲低SNHG12可显著抑制BRCA细胞的增殖、侵袭与迁移;而抑制miR-326则会逆转此效应。此外,生物素标记的miRNA下拉检测结果显示,SNHG12和EPHB3在miR-326的下拉产物中显著富集,提示二者可与miR-326直接结合。Western印迹和挽救实验表明,SNHG12通过吸附miR-326解除其对EPHB3的抑制作用,进而上调EPHB3表达,促进BRCA细胞的增殖、侵袭与迁移能力。综上,本研究首次阐明LncRNA SNHG12通过ceRNA机制调控miR-326/EPHB3轴在BRCA中发挥促癌作用。提示SNHG12/miR-326/EPHB3通路可能成为BRCA分子诊断与靶向治疗的潜在新靶点。

2型糖尿病相关认知功能障碍(diabetes-related cognitive impairment, DCI)是糖尿病的重要并发症,而运动在缓解DCI中起重要作用,但其作用机制尚不清晰。本研究旨在探讨外泌体miR-126a-5p在运动改善DCI中的作用及其机制。将24只16周龄雄性db/db小鼠按照随机数字表法分为糖尿病组(n = 12; DM)和运动干预组(n = 12; DE)。对照组为同周龄雄性m/m小鼠(n = 12; CON)。DE组进行为期8周中等强度跑台训练(10 m/min, 每周5 d)。MWM实验发现,与CON组相比,DM组小鼠逃避潜伏期延长(P<0.01),游泳速度和目标象限时间下降(P<0.001),海马组织及其外泌体miR-126a-5p表达水平下降(P<0.001)。运动干预后,DE组小鼠逃避潜伏期减少(P<0.05),游泳速度和目标象限时间均显著提高(P<0.05),同时海马组织及其外泌体miR-126a-5p表达升高(P<0.001)。形态学染色发现DM组小鼠较于CON组,在CA1、CA3区海马神经元的数量和NeuN荧光强度表达下降以及胶质细胞的表达上升(P<0.05),而DE组小鼠则提高神经元的数量和NeuN荧光强度(P<0.05)。Western印迹结果显示,与CON组相比,DM组海马组织中β淀粉样蛋白(amyloid β, Aβ)、靶蛋白高迁移率族蛋白B1(protein high-mobility group box 1, Hmgb1)、蛋白核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-alpha, TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)的表达均显著上调(P<0.05),运动干预后DM组表达水平均下降(P<0.05)。在体外细胞实验中,过表达miR-126a-5p的外泌体可显著降低HG诱导的HT22细胞表达淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)、NF-κB、Hmgb1和上清液TNF-α、IL-1β的含量 (P<0.05)。相反,抑制外泌体中miR-126a-5p表达则增加APP、Hmgb1、NF-κB、TNF-α、IL-1β水平(P<0.05)。综上所述,8周跑台改善db/db小鼠的认知功能,其机制可能与EXs-miR-126/HMGB1/NF-κB通路减轻海马组织炎症反应有关。

病理性心肌肥大是心力衰竭的早期重要心脏结构重塑特征,其进展可驱动心力衰竭的发生与发展。其主要结构特征是心肌细胞异常增大。目前针对心肌细胞肥大的有效干预靶点仍有待确定。先前的研究表明,细胞的形状和大小可由肌动蛋白相关蛋白2/3 (Arp2/3)复合物调控,该复合物是一种参与肌动蛋白质成核和组装的肌动蛋白结合蛋白质。然而,Arp2/3复合物在心肌细胞肥大中的作用尚不清楚。在本研究中,发现了Arp2/3复合物在心肌细胞肥大病理进程中的新调控作用。研究表明,在血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)诱导的原代大鼠心肌细胞和H9c2细胞肥大中,Arp2/3复合物的所有亚基mRNA水平均显著上调(P<0.05)。进一步研究表明,siARPC2可以抑制Ang Ⅱ诱导的原代大鼠心肌细胞和H9c2细胞中胎儿基因的重激活和心肌细胞面积的扩大(P<0.05)。此外,Arp2/3复合物的上游激活因子SH3结构域与Nck相互作用蛋白质(SPIN90)、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Rac1)和WASP家族Verprolin同源蛋白2(WAVE-2),在AngⅡ诱导的原代大鼠心肌细胞和H9c2心肌细胞肥大中上调(P<0.05),这表明Arp2/3复合物被过度激活。CK666是一种特异性的Arp2/3复合物抑制剂,进一步研究证明,CK666可以阻止Ang II在原代大鼠心肌细胞和H9c2细胞中诱导的胎儿基因的重激活和心肌新生大鼠原代心肌细胞细胞面积的扩大(P<0.05)。本研究揭示了Arp2/3复合物在Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大中发挥至关重要的作用,有利于进一步研究 Arp2/3 复合物调控病理性心肌肥大的分子机制。

吉非替尼是第一代表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI),通过靶向突变型EGFR,在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗中表现出显著疗效。然而,耐药性的出现限制了其长期临床获益。细胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20, CDC20)是调控细胞周期的关键蛋白质,在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用,但其在NSCLC耐药性获得中的调控机制尚未见报道。本研究旨在揭示CDC20驱动非小细胞肺癌吉非替尼耐药的分子机制。通过吉非替尼诱导构建耐药细胞株HCC827/GR(IC₅₀ 0.05 ± 0.01 μmol/L vs 36.24 ± 6.21 μmol/L)和PC9/GR(IC₅₀ 0.02 ± 0.01 μmol/L vs 25.36 ± 5.57 μmol/L)。通过生物信息学技术分析证实,CDC20的转录水平在肺癌样本中呈现表达水平显著上调现象,其异常表达特征与患者总生存期缩短存在明显关联。Western 印迹检测证实,耐药细胞HCC827/GR和PC9/GR中CDC20蛋白水平明显高于亲本细胞(HCC827和PC9)。为深入探究CDC20在非小细胞肺癌吉非替尼耐药中的作用机制,我们首先通过CRISPR/Cas9技术敲除CDC20,发现该干预可显著恢复耐药细胞对吉非替尼的敏感性(IC₅₀ 37.08 ± 6.15 μmol/L vs 10.49 ± 1.83 μmol/L,7.23 ± 1.55 μmol/L),并同时促进细胞凋亡和诱导G₂/M期阻滞。与之相反,过表达CDC20不仅降低敏感细胞的药物敏感性,还能显著抑制吉非替尼诱导的细胞周期阻滞和凋亡。进一步机制研究表明,CDC20敲除可抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化,同时显著上调促凋亡蛋白质截断胱天蛋白酶3和Bax的表达,下调抗凋亡蛋白质Bcl-2的表达。这些结果证实,CDC20通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控非小细胞肺癌吉非替尼耐药,为克服靶向治疗耐药提供了新靶点。

本研究通过整合生物信息学分析与实验验证,系统探讨中胚层发育关键基因在黑色素瘤发生发展中的分子机制。基于基因集变异分析(gene set variation analysis,GSVA)算法对406例皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma,SKCM)患者的7 752项生物功能进行富集分析,发现中胚层发育在黑色素瘤的发生发展中具有重要作用。通过LASSO-COX算法筛选出SMAD4、NODAL、BMPR1A和ZFP36L1共4个核心调控基因,并构建预后相关风险评分体系。基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析显示,这些基因主要富集于mRNA代谢过程和TGF-β信号通路相关通路。通过定量聚合酶链式反应、蛋白质印迹及免疫组化证实:SMAD4和BMPR1A在肿瘤组织中的表达下调与不良预后显著相关(P<0.05);NODAL通过调控上皮-间质转化(EMT)过程促进肿瘤侵袭转移;ZFP36L1高表达组则表现出更好的化疗敏感性。进一步分析发现,核心基因表达水平与肿瘤免疫浸润特征及免疫检查点分子存在显著相关性。本研究通过多组学分析结合实验验证,揭示了中胚层发育相关基因在黑色素瘤进展中的关键作用,阐明了SMAD4/NODAL/BMPR1A/ZFP36L1通过免疫微环境调控和EMT过程影响肿瘤生物学行为的分子机制,为黑色素瘤的分子分型和靶向治疗提供了新的理论依据。

程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)和程序性死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)是一对经典免疫检查点,其相互作用在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。但由于PD-1和PD-L1存在复杂的糖基化修饰,且真核细胞中的PD-1和PD-L1在蛋白质水平的表达量低,限制了靶向二者相互作用的药物筛选及抑制剂的开发。本研究针对二者相互作用的关键结构域,利用金门桥组装(golden gate assembly)无缝克隆技术构建了表达功能性截短体蛋白质PD-1^33-150和PD-L1^19-239的真核载体,并利用HEK-293T细胞系验证了其高效表达。经亲和层析纯化,每升细胞培养基可获得蛋白质纯度＞95% 的PD-1^33-150和PD-L1^19-239蛋白分别为5 mg和3mg。利用生物膜干涉技术(biolayer interferometry,BLI)和流式细胞术(flow cytometry,FCM),我们检测了纯化后PD-1^33-150和PD-L1^19-239的结合动力学参数、平衡常数以及其细胞结合活性。与昆虫细胞和大肠杆菌在蛋白质水平表达的PD-1胞外域相比,哺乳细胞表达的PD-1^33-150对PD-L1的亲和力提高了近24和50倍,同时使结合的解离速率降低至原来的1/400以下,这可能是由于不同的糖基化修饰对PD-1和PD-L1蛋白的相互作用具有重要影响。综上,本研究建立了人源PD-1^33-150/PD-L1^19-239功能性截短体在蛋白质水平的高效表达与纯化平台,为PD-1/PD-L1抗体药物筛选及小分子免疫检查点抑制剂的开发提供了高质量的分子工具。

异黄酮主要分布于豆科植物中,具有丰富的保健功效。异黄酮合成酶(IFS)是一种膜结合细胞色素P450酶(P450),催化独特的芳环迁移和羟基化。到目前为止,研究得到的植物P450酶晶体结构数量有限。通过培养硒代蛋氨酸取代晶体,利用MAD方法测定了蒺藜苜蓿IFS分辨率为1.9 的晶体结构,并进行了分子对接和突变研究。结合咪唑的IFS结构具有Iα螺旋-环-Iβ螺旋基序,与其他P450酶的螺旋I相对应。与常见的P450结构相比,IFS/咪唑复合物结构包含1个额外的结构域,即γ-结构域。IFS/咪唑复合物结构是一种同源二聚体,其中一个分子的γ-结构域与另一个分子的β-结构域发生作用。血红素基团平面与Iα螺旋-环-Iβ螺旋基序形成约40°的夹角。分子对接和突变研究表明,Trp-128和Asp-300可能在底物结合和识别中发挥重要作用。来自Iα螺旋-环-Iβ螺旋基序的Phe-301、Ser-303和Gly-305可能在芳环迁移中发挥重要作用。这些新颖的结构特征揭示了IFS独特的反应机制,为在豆科作物中进行IFS育种工程奠定了基础。

木糖醇脱氢酶(XDH)是能够分解戊糖的酵母和真菌中参与木糖利用的关键酶。除了可以生产木酮糖以外,XDH还可以用于木糖醇浓度检测的生物传感器的开发,具有重要的研究意义。在本研究中,构建了来源于嗜热真菌埃默森篮状菌Talaromyces emersonii的木糖醇脱氢酶(TeXDH)的大肠杆菌表达质粒pF58-TeXDH。TeXDH在16 ℃下以可溶性形式在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。通过使用Ni-NTA亲和柱进行纯化,获得了纯度较高的重组TeXDH。分子排阻层析和SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的重组TeXDH以天然三聚体的形式存在,分子量约为116 kD,由3个相同的亚基组成,每个亚基的分子量约39 kD。TeXDH严格依赖NAD⁺作为辅酶,而不依赖NADP⁺。TeXDH的最适温度和pH值分别为40 ℃和10.0。经过EDTA处理,TeXDH的酶活性降低到起始酶活的43.26%。二价金属离子Mg²⁺或Ca²⁺能够恢复TeXDH的酶活性,分别达到起始酶活的103.32%和110.69%,是TeXDH酶的最佳二价金属离子辅因子。而二价金属离子Mn²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺和Cd²⁺能够显著抑制TeXDH的活性。ICP-MS和分子对接分析表明,1 mol/L的TeXDH结合了2 mol/L的Zn²⁺离子和1 mol/L的Mg²⁺离子。另外,TeXDH对木糖醇具有较好的底物特异性,为未来木糖醇生物传感器的发展奠定了基础。

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)作为儿童最常见的颅外实体肿瘤,其高度恶性特征和不良预后亟待深入研究。近年来,微小RNA(miRNA)作为重要的转录后调控分子,在肿瘤发生发展中发挥关键作用。基于上述背景,本研究将重点关注miR-3910,探讨其在NB细胞系SH-SY5Y中的生物学功能以及其分子调控机制。通过生物信息学分析和转录物组测序技术,我们发现了miR-3910的潜在关键靶分子,从而为NB的精准诊断和有效治疗提供基因靶点。在本研究中,运用qRT-PCR检测转染mimic nc与miR-3910 mimic后的SH-SY5Y细胞中miR-3910表达水平,与nc组相比,mimic组的SH-SY5Y细胞中miR-3910表达显著上调(P < 0.01);采用CCK-8法和细胞划痕试验定量分析miR-3910对细胞增殖与迁移能力的影响,细胞增殖能力在48 h显著提高(P < 0.05),迁移能力在48 h明显增强(P < 0.01);借助流式细胞术测定miR-3910对细胞周期进程的作用,细胞周期进展加速,G₀/G₁期细胞百分数减少(P < 0.01),S期细胞显著增加(P < 0.05)。综合生物信息学分析及高通量转录物组测序技术预测miR-3910过表达后SH-SY5Y细胞中的关键分子变化。经转录物组测序及生物信息学分析,筛选出EIF3CL(EIF3C)、RNF103-CHMP3(VPS24)、SULT1A4(SULT1A4)、CORO7-PAM16(CORO7)、H4C12(Histone H4)、TBC1D3(TBC1D3A/B/C)等6个(别名来自GeneCards数据库)与NB相关基因,且qRT-PCR和Western印迹验证结果与测序结果一致(P < 0.01)。综上所述,miR-3910过表达显著促进SH-SY5Y细胞的增殖、迁移及周期进展,并揭示了一系列潜在的靶向关键分子,为深入理解NB发病机制提供了新视角,为NB的分子靶向治疗提供理论依据和潜在干预靶点。