研究论文
祝凯华, 张德祥, 陶颖, 张舒龙, 范坤, 刘厚宝
肝门部胆管癌发病隐匿,常因胆汁淤积引起梗阻性黄疸,导致肝功能受损。对肿瘤合并恶性梗阻性黄疸,临床通常在手术前行胆汁引流。目前,胆汁引流方式主要是经皮经肝胆道引流 (percutaneous transhepatic biliary drainage,PTBD) 和内镜下逆行胆管引流 (endoscopic retrograde biliary drainage,ERBD),2种引流方式各有优劣。PTBD引流易引起肿瘤种植转移,但机制不清楚。本文分析肝门部胆管癌PTBD及ERBD引流胆汁,从中分离获得肿瘤细胞,通过体外肿瘤球形成及体内移植瘤模型对PTBD与ERBD胆汁中肿瘤细胞的致瘤性及机制进行研究。以胆结石组作为阴性对照,分为良性结石组(30例),ERBD减黄组(13例),PTBD减黄组(14例),其中良性结石30例的胆汁中无肿瘤细胞,未形成肿瘤球,ERBD减黄13例胆汁中有3例形成肿瘤球 (23%),PTBD减黄14 例胆汁有6 例形成肿瘤球 (42%),PTBD组细胞的肿瘤球形成能力显著高于ERBD组。皮下移植瘤检测表明,PTBD组移植瘤生长能力显著高于ERBD组,PTBD胆汁中的肿瘤细胞具有更强的致瘤能力。在机制研究中,RT- PCR检测表明,PTBD组肿瘤球干细胞转录因子Nanog的mRNA水平显著高于ERBD组。在3例PTBD组细胞中敲低Nanog, 肿瘤球形成,皮下移植瘤生长均被降低,Nanog在PTBD肿瘤细胞强的致瘤能力中发挥重要作用。PTBD细胞中Nanog的mRNA半衰期长于ERBD组,Nanog的 mRNA受转录后修饰潜在调控。本文发现,PTBD肿瘤细胞中Nanog的m6A水平高于ERBD组。对RNA修饰的甲基转移酶及去甲基化酶进行检测表明,ALKBH5 (α - ketoglutarate dependent dioxygenase alkb homolog 5)的 mRNA表达水平在PTBD组低于ERBD组,且与Nanog的m6A水平显著相关。敲低ALKBH5,Nanog的m6A水平升高,而过表达ALKBH5则下调Nanog的m6A水平。双荧光素酶活性检测表明,ALKBH5敲低显著增强荧光素酶活性,而ALKBH5过表达则降低荧光素酶活性。进一步研究证实, 敲低ALKBH5,Nanog的mRNA和蛋白质水平均被上调,相反过表达ALKBH5,Nanog的mRNA和蛋白质水平被下调。ALKBH5介导Nanog去甲基化修饰,PTBD组低的ALKBH5水平促进其Nanog的m6A修饰上调。过表达ALKBH5降低肿瘤球生长;敲低ALKBH5肿瘤球生长被上调,但同时敲低Nanog,升高的肿瘤球生长被抑制。综上,肝门部胆管癌经PTBD与ERBD减黄胆汁中的肿瘤细胞可形成肿瘤球,具有致瘤性。相比于ERBD组,PTBD胆汁中肿瘤细胞ALKBH5的表达水平低,增强了Nanog的m6A修饰,上调Nanog表达水平,具有更强的致瘤性,对揭示PTBD引流易引起肿瘤种植转移具有重要意义。