中国生物化学与分子生物学报

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马元武, 张连峰

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 783-787.

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近十年，转座子作为一种遗传工程工具对脊椎动物的的基因遗传研究作出了重大贡献，这得益于转座子Sleeping Beauty（SB）和PiggyBac（PB）的发现。SB和PB宿主范围极其广泛，从单细胞生物到高等哺乳动物都能够发挥作用。转座过程发生需要转座序列和转座酶的存在。经过改造转座子系统可以携带一段外源DNA序列到宿主基因组中。作为一种非病毒载体的SB和PB转座系统具有高转座效率、安全性高等突出优势。两种转座子比较，发现PB的转座效率相对于SB要高，而SB转座转座靶点更容易出现在供体附近位置，它们优势互补在遗传工程和诱导多潜能干细胞（iPSCs）以及基因治疗方面表现出巨大潜力和应用价值。

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天然反义RNA (NATs): 基因表达的重要调控分子

毕延震, 黄捷, 姜黎

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 788-795.

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天然反义RNA (natural antisense transcripts, NATs) 是在多个物种广泛表达的一类非编码RNA分子，可在转录水平，转录后水平，翻译水平等多个层次采取不同的机制调节靶基因的表达，对器官形成，细胞分化和疾病发生等各种生理和病理过程都有重要的调控作用. 本文在总结、回顾近年来天然反义RNA研究进展的基础上，着重介绍和阐述NATs的作用方式，并提出未来NATs研究需要重点解决的两个问题：一是开发合适的实验系统研究特定条件下NATs的表达与生物学功能，二是NATs的自身表达调控机制. 深化对其生物学意义的认识.对天然反义RNA的研究为药物开发和疾病治疗提供了新的思路和突破口.

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调控骨骼肌纤维类型转化的信号通路

袁媛 , 刘月光, 史新娥, 杨公社

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 796-801.

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摘要：骨骼肌由异质性的肌纤维组成，不同类型的肌纤维具有不同的形态、代谢、生理和生化特性．根据不同肌纤维中表达的特异肌球蛋白重链亚型可将成体哺乳动物骨骼肌纤维分为四类，即Ⅰ，Ⅱa，Ⅱx和Ⅱb型．骨骼肌保持高度可塑性，当机体受到某些生理或病理刺激时，骨骼肌为了适应需要，通过激活胞内相关信号通路改变肌纤维特异基因的表达从而诱发肌纤维类型的转化．本文综述了细胞内参与调控肌纤维类型转化的多条重要信号通路，如Ca+信号通路，Ras/MAPK信号通路及多种转录调节因子，辅激活因子和抑制子等，为改善肉类品质，提高运动训练效果及治疗肌肉相关疾病奠定了理论基础．

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MicroRNAs对动物皮肤和毛发发育调控作用的研究进展

刘丹丹，赫晓燕，郝欢庆

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 802-808.

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MicroRNAs是近年来发现的一类由19-25个核苷酸组成的非编码单链小RNA分子，它们通过与靶基因mRNA3’UTR结合抑制靶基因的翻译，在转录后水平调控基因表达.MicroRNAs参与了包括细胞分化、增殖和凋亡及免疫系统应答在内的一系列发育调控和生物学过程.最近研究发现MicroRNAs在多种哺乳动物皮肤中均表达，并参与了哺乳动物皮肤及毛发发育的调控过程，这些都为研究这个新颖的调控因子在干细胞生物学和发育生物学中的功能奠定了基础.本文综述了近年来MicroRNAs对哺乳动物皮肤和毛发发育调控作用的研究状况.

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抑制GSK-3β活性促进NF-κB诱导的儿童急性淋巴细胞白血病细胞凋亡

胡艳妮, 徐酉华*, 顾晓艳, 李瑞燕

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 809-815.

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核转录因子-κB（NF-κB）是维持急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞生存的关键因子，近年来发现糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）可以正性调控NF-κB的活性.本研究通过抑制GSK-3β活性初步探讨ALL细胞中GSK-3β在NF-κB诱导细胞凋亡中的作用机制．收集ALL患儿骨髓单个核细胞，采用免疫荧光细胞化学方法检测到ALL细胞核内GSK-3β有明显聚集. 体外培养ALL细胞后经GSK-3β抑制剂氯化锂（LiCl）和SB216763处理，采用Western 印迹和EMSA方法检测发现，ALL细胞核内GSK-3β表达下降，而NF-κB P65蛋白无明显变化，但是其活性明显降低.同时RT-PCR结果显示NF-κB下游抗凋亡基因存活素（SURVIVIN）的表达随之下降，Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测结果证实ALL细胞凋亡明显增加（P＜0.01）.该结果表明，抑制GSK-3β活性可以下调NF-κB的转录活性，并通过下调抗凋亡基因SURVIVIN的表达而促进ALL细胞的凋亡.

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阻断MAPK通路促进雄激素受体招募NCoR并抑制前列腺癌细胞生长

洪伟, 邵杰, 邸宝华, 姚智

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 816-821.

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雄激素受体（androgen receptor, AR）是配体调节的转录因子，与前列腺癌的生长和内分泌治疗密切相关。醋酸环丙孕酮（cyproterone acetate, CPA）作为雄激素的拮抗剂已用于前列腺癌的治疗。结合了CPA的AR可与核受体协同抑制因子作用。已证实丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）可介导生长因子和雄激素受体的信号转导通路的交互作用。我们报道，激活的MAPK抑制结合了CPA的AR招募核受体协同抑制因子(nuclear receptor corepressor, NCoR)至雄激素反应元件上。应用MEK的抑制剂U0126阻断MAPK通路可促进结合了CPA的AR和NCoR相互作用并通过对NCoR的招募增加抑制AR的功能从而阻遏AR靶基因的表达。此外，联合使用CPA和U0126处理稳定表达NCoR的LNCaP细胞可显著抑制前列腺癌细胞的生长。本研究表明，联合应用AR的拮抗剂和MAPK抑制剂有助于前列腺癌的治疗。

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组蛋白不同乙酰化位点突变对酵母细胞生长和SSA3、GAL1基因表达的影响

李芬, 孔艳, 张帅, 马瑜, 胡岩岩

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 822-827.

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组蛋白乙酰化修饰对基因表达有重要影响。为揭示组蛋白H3 K14和H4 K8的乙酰化修饰对不同条件下细胞生长及SSA3、GAL1基因表达的重要性及两位点功能差异。构建了H3 K14、H4 K8和两位点共同突变为精氨酸的组蛋白突变株S14、S8和D814，对其在正常、半乳糖为单一炭源、高温、高盐等条件下的生长及SSA3、GAL1表达情况进行比较。结果表明双突变株温度敏感, 所有突变株对咖啡因敏感性增加。双突变株D814在各供试条件下的生长及SSA3和GAL1激活均明显慢于野生型和单突变株，除半乳糖和葡萄糖为单一碳源，30℃时两单突变株差别不大之外，其它4种条件下S8生长及SSA3和GAL1激活均慢于S14。表明H3 K14、H4 K8的乙酰化修饰对细胞生长和适应不利环境非常重要，在对不利环境条件的快速适应方面，H4 K8的乙酰化修饰可能比H3 K14更为重要。组蛋白突变株的表型缺陷是因该条件下细胞生存所必需的基因激活延迟所致。

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Nmp4促进TNF-α诱导的成骨细胞凋亡

杨周岐 , Fredrick M. Pavalko，商澎

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 828-835.

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摘要：成骨细胞凋亡增加是导致骨骼系统疾病如骨质疏松症发生的原因之一．研究表明，核基质蛋白4（nuclear matrix protein 4, Nmp4）通过负调控机制调节成骨细胞分化和增殖，进而抑制骨密度及骨量增加．Nmp4是否调节成骨细胞凋亡，还未有相关报道．本文以Nmp4基因敲除（Nmp4-KO）小鼠为实验材料，分离原代颅骨成骨细胞，以肿瘤坏死因子（TNF-α）为凋亡诱导手段，研究了Nmp4对成骨细胞凋亡的影响及其作用机制．体外细胞实验发现，Nmp4-KO显著抑制TNF-α诱导的成骨细胞内caspase-3激活．进一步研究揭示，Nmp4-KO促进细胞外信号调节激酶（Erk）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号途径的激活，抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化，从而对抗成骨细胞凋亡发生．免疫荧光及免疫印迹实验显示，TNF-α诱导处理可增强成骨细胞核因子NFκB磷酸化及其核转位，但Nmp4基因缺失无进一步促进作用，未经诱导处理的Nmp4-KO细胞内NFκB磷酸化水平显著高于野生型（WT）对照。TNF-α诱导处理虽然促使线粒体途径信号分子Bad磷酸化及Bcl-xl表达水平适当升高，但在两种细胞表型间无显著差异．这些结果证实，Nmp4基因敲除可促进相关抗凋亡信号分子的激活和表达，抑制促凋亡信号的激活，进而抑制成骨细胞凋亡发生．

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EoRab11a在游仆虫及HEK293T细胞中的定位

李江姣 , 聂宇 , 许静, 梁爱华, 王伟

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 836-840.

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Rab11是一种在真核生物细胞生命活动过程中发挥多种调控作用的小分子GTP酶．EoRab11a是游仆虫中的Rab11蛋白同源物，为了解EoRab11a蛋白在细胞中的功能，本研究将EoRab11a基因克隆到哺乳动物表达载体pEGFP-C2，构建重组表达质粒pEGFP-C2-EoRab11a，转染 HEK293T 细胞并观察其细胞定位．在间期HEK293T细胞中，EoRab11a定位于细胞核附近；在游仆虫细胞中，EoRab11a具有相同的分布模式．在HEK293T 细胞的胞质分裂过程中，EoRab11a先后在分裂沟附近、分裂沟收缩区、以及最后形成的中间体处分布，提示EoRab11a可能参与了胞质分离过程中分裂沟及中间体处的膜泡运输事件．结果表明Rab11家族蛋白的结构和功能从低等的单细胞真核生物到高等的哺乳动物具有一定保守性，不同物种的Rab11在细胞囊泡运输和胞质分裂过程中起着相似的调节作用．

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未性成熟雌性小鼠孕前砷暴露导致植入前胚胎体外发育阻滞

张传领 , 刘春梅 , 陆彩玲, 马旭

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 841-846.

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目前研究发现妊娠期环境砷暴露可以导致其后代发育异常如不孕不育、流产、早产、胎儿生长受限、子代先天畸形及性别比例失调等生殖健康问题，而对孕前砷暴露对植入前胚胎发育的影响的研究还不充分.我们选用3-5周龄雌性未性成熟小鼠，按8mg/Kg亚砷酸钠（NaAsO2）剂量隔日腹腔注射一次，共注射8次.结果显示：孕前砷暴露导致小鼠排卵能力明显下降，植入前胚胎大部分阻滞在1-2细胞期.同时发现这些阻滞的胚胎活性氧（ROS）水平明显升高，细胞色素C明显释放，细胞凋亡率明显升高.这些结果说明孕前砷暴露十分危害随后植入前胚胎的发育，这也预示着孕前砷暴露将有可能导致育龄妇女受孕困难.

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在笼型蛋白和脂筏介导的两种内吞途径中nephrin的磷酸化修饰动力学不同

秦晓松, 郑锐, 潘莉莉, 吴丽娜, 佟威威, 刘岩, 岳丹

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 847-853.

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研究肾小球裂隙膜的主要成分nephrin分子在细胞内的转运途径及不同转运途径对nephrin磷酸化的影响.分别应用笼型蛋白介导的内吞（clathrin-mediated endocytosis, CME）和脂筏介导的内吞（raft-mediated endocytosis, RME）标记物转铁蛋白和霍乱毒素B亚基对nephrin的内吞过程进行分析，并进一步应用两种内吞途径阻断物EPS15Δ和Dyn2aK44A，研究阻断nephrin的内吞途径对其磷酸化水平的影响. 结果显示，nephrin通过笼型蛋白和脂筏介导的两种内吞途径以不同速率进行内吞；与Src酪氨酸激酶家族成员Fyn共表达时，细胞内nephrin酪氨酸磷酸化被增强，而在Src家族激酶抑制剂PP2的作用下，nephrin酪氨酸磷酸化被减弱，表明nephrin的磷酸化过程是Fyn依赖的；内吞20 min时，笼型蛋白介导的内吞途径的特异性阻断物 EPS15Δ降低了nephrin磷酸化水平、笼型蛋白和脂筏介导的内吞途径的通用抑制剂Dyn2aK44A则增加了nephrin的磷酸化水平，综上结果表明：单独阻断脂筏介导的内吞可引起nephrin的磷酸化水平增加，脂筏介导的内吞对nephrin磷酸化过程起下调作用.

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杀雄剂SQ-1诱导小麦生理型雄性不育小花完整叶绿体差异蛋白质组学的鉴定

王书平, 张改生, 叶景秀, 李莉, 宋瑜龙, 王亮明 , 代军军 , 李莉 , 张龙雨, 牛娜 , 马守才, 朱建楚

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 854-861.

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为了在蛋白质水平揭示小麦雄性不育的分子遗传机制，以小麦经杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系，以及对应正常可育系所构建的等生理差异系为试材，应用差速离心和蔗糖密度梯度离心，首先分离出供试材料小花的完整叶绿体，制备蛋白样品后采用固相IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对完整叶绿体蛋白质进行了分离、银染，得到了重复性较好的双向电泳图谱．PDQuest 2DE软件分析识别出约150个较为清晰的蛋白质点，采用MALDI-TOF鉴定出的6个差异表达蛋白质分别是：PAP-fibrillin、ATRABB1A、底物同源结构域蛋白/Rho GAP结构域蛋白、铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、R2R3-MYB转录因子及1个假定蛋白质．生物信息学功能分析暗示,这些蛋白直接参与了花药内激素调节、蛋白质转运、蛋白质互作、活性氧积累及花药的发育，表明SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育其败育机理可能就与这些生理代谢过程的变异直接相关．

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亲和色谱和反相高效液相色谱测定菠菜和拟南芥中四氢叶酸代谢物及叶酸的含量

常振战, 张灵芝, A.Gage DOUGLAS

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 862-870.

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植物中来源于甘氨酸和丝氨酸的一碳单位转移给四氢叶酸用于四氢叶酸代谢物的生物合成．由于含量低、成份复杂以及稳定性差，植物组织中四氢叶酸代谢物和叶酸的定量分析一度是一个挑战性很强的课题．本研究旨在建立一种可靠方法测定对甲基基团要求不同的植物（例如累积甘氨酸甜菜碱的菠菜与不累积甘氨酸甜菜碱的拟南芥）中四氢叶酸代谢物和叶酸的含量，用于研究这些植物中通过叶酸途径的一碳单位通量．菠菜和拟南芥叶片在金色荧光灯下加液氮研磨，加入大鼠血浆轭合酶粗提物处理，提取物经叶酸结合蛋白琼脂糖亲和色谱柱纯化，用附有荧光和紫外检测器的高效液相色谱仪分离并测定四氢叶酸代谢物和叶酸的含量．菠菜和拟南芥叶片中单谷氨酸型N5-甲基四氢叶酸含量分别是252 ng/g 和 64 ng/g, 而总N5-甲基四氢叶酸的含量分别是370 ng/g 和 199 ng/g．两种植物均检测到少量的四氢叶酸和N5-醛基四氢叶酸,但只在拟南芥叶片而非菠菜叶片中检测到叶酸．实验结果显示，菠菜中单谷氨酸型和多谷氨酸型N5-甲基四氢叶酸的含量均比拟南芥显著增多．这种样品制备和高效液相色谱方法适于测定植物中四氢叶酸代谢物和叶酸的含量．

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一种含双歧杆菌种属特异性复制子的新型大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒的构建

石屹 , 杨业鹏 , 李载权 , 周梅, 李会娟, 张志豹 , 李五岭

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(9): 871-877.

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目前，双歧杆菌的转化是一个技术难题，与大肠杆菌等宿主菌的高转化效率不同，采用普通的原核质粒无法转化双歧杆菌.为此，本文提出双歧杆菌转化对质粒复制子具有“种属特异性”要求，并通过构建含有双歧杆菌特异复制子的新型穿梭质粒，以求解决这一难题.首先从GenBank获取长双歧杆菌隐性质粒pMB1的序列信息，采用Overlap-PCR方法获得其全长DNA，作为拟构建质粒的复制子；继而采用重组技术，将其与pMK4质粒片段（含大肠杆菌复制子pUC和抗氯霉素基因Cat）重组，构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒；用电穿孔法将重组质粒转化双歧杆菌，通过观察不同电转参数下的转化效率，选择双歧杆菌转化的最佳条件.结果，成功获得全长1 899 bp的pMB1复制子并构建成功含有pMB1和pUC双复制子的原核重组质粒，经酶切和测序鉴定正确，命名为pCMB1.以重组质粒成功转化了长双歧杆菌NCC 2705和NQ 1501，而其它3种野生型双歧杆菌（包括1株长双歧杆菌）未能转化成功.结论：质粒中含有双歧杆菌种属特异的复制子是实现双歧杆菌转化的必要条件；即使是含有特异复制子的质粒也只能转化有限数量种型甚至有限数量种株的双歧杆菌；选择最佳电转化条件能显著提高转化效率.

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