中国生物化学与分子生物学报

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赵妍，，余涛，邢少辰

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 95-103.

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位点特异重组系统由重组酶和相应的重组酶识别位点组成，通过两者间的相互作用，实现外源基因精确整合与切除等一系列遗传操作.主要可分为Cre/lox系统、FLP/frt系统、R/RS系统和Gin/gix系统.目前，研究最充分应用最广泛的位点特异重组系统为Cre/lox系统.此系统为位点特异重组系统家族中的一员，由38.5 kD Cre重组酶和34 bp lox位点组成，最早被应用于动物转基因研究，包括基因敲除、基因激活、基因易位等.近年来，随着研究的深入，Cre/lox系统被逐步应用到植物研究中，并在诸多领域取得重大进展.本文总结归纳了Cre/lox系统在定点整合、定点切除以及叶绿体转化等方面的最新研究成果，旨在为利用Cre/lox系统构建环境安全和高效表达的植物遗传转化体系提供参考.

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抗菌药物治疗疾病的新靶位——丙氨酸消旋酶

刘晓琴,石亚伟

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 104-108.

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丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶，催化L-丙氨酸与D-丙氨酸相互转化的一种酶，它广泛分布在低等生物,而不存在于人类等高等真核生物中.来自不同物种的丙氨酸消旋酶一级结构同源性较高，其大多功能单位为同源二聚体，拥有2个相同的活性中心，每个活性中心均是由来自不同亚基的2个保守残基共同组成.丙氨酸消旋酶催化生成的产物D-丙氨酸是合成细菌细胞壁肽聚糖的重要成分，也是调节细菌孢子萌芽的关键因子.因而丙氨酸消旋酶与由细菌引起的肺结核、炭疽热、中耳炎等疾病密切相关.近年来丙氨酸消旋酶已成为设计抗菌药物的又一理想靶位.本文从丙氨酸消旋酶的结构、功能、作用机理、抑制剂以及其与疾病的关系等方面进行了阐述.

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朊粒蛋白PrPSc寡聚体的形成与跨膜毒性

衡杰，吴琦

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 109-115.

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朊粒蛋白(prion protein, PrP)传染致病机制一直是朊粒（prion）研究领域的焦点. 由正常型朊粒蛋白(PrPC)向致病型朊粒蛋白(PrPSc)的转变是致病的关键步骤.本文综述了近年来PrPC向PrPSc转变的结构变化特征、PrPSc由单体形成寡聚体的组装机制、以及PrPSc寡聚体的跨膜机制与细胞毒性间的关系等方面的研究进展.

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宏基因组与宏基因组学

孟飞，，俞春娜，王秋岩，谢恬

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 116-120.

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宏基因组学诞生于上世纪90年代，是指不经过微生物培养阶段，采用直接提取环境中总DNA的方法，对微生物基因总和进行研究的一门新学科.宏基因组技术的出现，使得人们对占微生物总体99 %以上不可培养微生物的研究成为现实，微生物基因的可探测空间显著增大.总的来说，目前宏基因组技术的应用主要分为两个方面：一方面是筛选功能基因，开发具有所需功能的蛋白；另一方面是通过对宏基因组文库进行分析，探讨在各种环境下微生物间相互作用和微生物与周围环境间相互影响的规律，以便我们能更加客观、全面地认识微生物世界.在宏基因组技术的应用范围被不断扩展的同时，围绕着宏基因组文库的构建和筛选、测序和分析等方面的研究已成为宏基因组学发展的主要推动力，宏基因组技术的进步将不断提升其应用价值.

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Toll信号通路在中枢神经系统损伤中的作用

茅东升，来婷婷，陈琰，宋必卫，宋英

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 121-127.

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Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）是先天性免疫反应识别病原体的一个重要分子，在免疫系统中发挥关键作用.其家族各种成员的主要功能是识别入侵病原体表面的各种不同分子模式，随后启动免疫反应，达到保护机体作用. 在大脑中，小胶质细胞可以作为抗原提呈细胞，参与脑内免疫反应，也可以通过分泌各种促炎症因子启动或促进免疫反应，而TLR家族在中枢神经免疫系统的作用仍存在争议，它既可以通过促进神经免疫反应枢纽因子的表达来增强免疫，也可因免疫过度而损伤神经细胞.总之，Toll信号通路对中枢神经系统疾病有一定的调控作用.

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利用帕金森症的果蝇模型测试具有神经保护作用的化学活性分子

乐志操,黄爱玲,杨宇丰

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 128-133.

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帕金森症的果蝇模型对解析疾病的分子细胞机制贡献极大.为探讨利用地中海黑腹果蝇的疾病模型来筛选新型治疗帕金森症药物的可能性，我们构建了基于DJ-1A和PINK1两个遗传致病因子的帕金森症果蝇模型，测试抗氧化和消炎活性分子米诺环素和辅酶Q10对脑多巴胺浓度的影响.结果表明，米诺环素对DJ-1A果蝇模型有明显保护作用，能显著提高脑多巴胺的浓度，但是对PINK1果蝇模型没有保护作用；辅酶Q10对两种模型均有保护作用.因此，帕金森病的果蝇模型能够反映药物分子的特异性作用，为筛选新的帕金森病治疗药物提供了一条便捷的途径.

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敲减BMI-1表达诱导HeLa细胞G1期阻滞.

陈凤花,李一荣,王琳,胡丽华

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 134-139.

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B细胞特异性莫洛尼氏白血病毒插入位点1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site 1, BMI-1)在多种恶性肿瘤中高表达.为探索BMI-1在宫颈癌发生发展过程中的生物学作用，将构建成功并已鉴定为有效序列的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达载体BMI-1 shRNA2和BMI-1 shRNA4，转染人宫颈癌细胞系HeLa并筛选稳定转染细胞株，Western印迹检测BMI-1蛋白表达，实时荧光定量RT-PCR检测周期素依赖性激酶抑制剂p16INK4a(cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a)、人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）、同源盒A9(homeobox A9, HOXA9）、同源盒B4(homeobox B4, HOXB4) 和同源盒C13(homeobox C13, HOXC13)基因mRNA的表达变化，PI染色流式细胞仪检测细胞周期变化.结果表明, 在稳定转染BMI-1 shRNA2、BMI-1 shRNA4的HeLa细胞中，显著抑制BMI-1蛋白表达，上调p16INK4a、HOXA9和HOXC13 三者mRNA表达，而hTERT和HOXB4两者mRNA的表达水平无明显改变，同时G1期细胞增加、S期细胞减少，提示敲减BMI-1表达诱导HeLa细胞G1期阻滞，BMI-1可能是宫颈癌基因治疗的靶分子.

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头孢曲松耐药菌通过调整能量代谢相关蛋白产生耐药性

潘建义,，陈萍,王三英

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 140-149.

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随着抗生素药物的开发与利用, 细菌在对抗药物过程中逐渐发展出各种不同的耐药机制. 近年来高通量的蛋白质组学技术已逐渐用于细菌耐药性机理研究，但主要集中在对细菌外膜蛋白的作用进行分析. 本文采用2-D native/SDS PAGE方法从蛋白质复合物角度分析接近生理条件的胞浆蛋白在头孢曲松耐药性中的作用. 结果发现8个耐药性相关蛋白质，通过对蛋白质功能分析,揭示了细菌通过调整能量代谢相关蛋白产生耐药性的新机制. 进一步对相关菌株的次抑菌浓度和生存率分析，提示MalP和SucC等关键蛋白质可作为设计和开发新型抗菌分子的作用靶点.

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核因子相关因子2调节大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达

江刚，，戴爱国，胡瑞成

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 150-156.

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红系衍生的核因子相关因子2 (Nrf2)是调节抗氧化基因表达的关键转录因子.γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是肺内主要的抗氧化基因，但Nrf2如何调节γ-GCS表达目前仍不清楚.该文采用香烟烟雾提取物（CSE）诱导大鼠气道上皮细胞为研究对象，探索Nrf2调节γ-GCS基因表达机制.细胞免疫荧光显示,Nrf2蛋白质在CSE处理1、3和6 h组,主要在胞核中表达.细胞免疫化学与Western印迹显示,γ-GCS蛋白质在CSE 1、3、6 h组表达明显增强，其中Western印迹结果高于对照组（P＜0.05）；Nrf2胞核蛋白质表达增强.p-aPKCι/ζ蛋白质在CSE 1、3 h组表达增强，与对照组相比差异显著（P＜0.05）.RT-PCR结果表明,γ-GCS mRNA在CSE 1、3、6 h组表达明显高于对照组（P＜0.05）.γ-GCS活性在CSE 1、3、6 h组增高并高于对照组（P＜0.05）.GSH含量在CSE 3、6 h 组明显高于对照组（P＜0.05）.预先加入aPKCι/ζ抑制剂RO813220，Nrf2胞浆蛋白质表达增强，GSH含量、p-aPKCι/ζ蛋白质、γ-GCS蛋白质与其mRNA和活性均明显低于CSE 3 h组（P＜0.05）. 相关性分析显示Nrf2与γ-GCS、γ-GCS活性、p-aPKCι/ζ呈正相关，p-aPKCι/ζ与Nrf2、γ-GCS、γ-GCS活性呈正相关（P＜0.05）.以上结果表明，CSE可能通过aPKCι/ζ-Nrf2信号通路调节γ-GCS的表达水平和活性.

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双Intein介导3片段vWF的反式剪接

朱甫祥，郭猛，刘泽隆，屈慧鸽，迟晓艳

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 157-163.

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von Willebrand因子(vWF)基因突变导致血管性血友病(VWD)，由于其基因过大在基因治疗研究中难以为多数病毒载体携带. 利用双内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能研究断裂成3段的vWF基因分别表达后在蛋白水平的连接，旨在为vWF基因的3载体联合转移应用于VWD基因治疗研究提供依据. 将vWF cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段(N、M和C)，分别与split Ssp DnaE intein的N端(En)、C端(Ec)和split Ssp DnaB intein的N端(Bn)、C端(Bc)编码序列融合，构建到原核表达载体pET-28a(+)中的His-Tag的下游，得到3种表达载体pET-NEn、pET-EcMBn和pET-BcC. 分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，经IPTG诱导表达后，以SDS-PAGE分析融合蛋白的表达，并进一步用His-Tag的特异性抗体进行分析; 亲和层析纯化分别表达的带His-Tag标签的3段蛋白，复性后体外混合进行剪接实验以观察3片段vWF的连接. 结果显示，3段预期大小的融合intein的vWF蛋白均有表达，用His-Tag抗体进行的Western印迹得到进一步证实; 3段纯化的蛋白混合后可见明显的剪接条带形成，与vWF的预期分子量大小一致, 表明双intein通过蛋白质反式剪接可有效连接3个片段的vWF，为进一步应用蛋白质剪接技术的3重载体真核细胞转vWF基因奠定了基础.

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DKK-1通过上调nm23表达抑制乳腺癌细胞迁移

周晓雷,张晓东,叶丽虹

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 164-169.

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Dickkopf-1（DKK-1）作为Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）经典信号传导通路的拮抗剂而受到关注.为了进一步阐明DKK-1在乳腺癌细胞迁移中的作用及其分子机制，应用我们建立的乳腺癌细胞MCF-7高转移倾向亚克隆LM-MCF-7 细胞株，比较了DKK-1在不同转移能力的乳腺癌细胞株中表达水平及其与细胞迁移能力的关系. 结果显示，DKK-1在LM-MCF-7 细胞中表达明显下调；“伤口愈合”实验结果表明，在MCF-7细胞中，RNA干扰DKK-1可导致细胞迁移能力增强；相反，在LM-MCF-7细胞中过表达DKK-1则可抑制细胞的迁移. 进一步研究结果显示，DKK-1为肿瘤转移抑制因子nm23的上游激活因子. 因此，我们的研究结果表明，DKK-1表达水平下调导致nm23表达水平下调，解除了对乳腺癌细胞迁移的抑制作用，是LM-MCF-7乳腺癌细胞具有高迁移能力的原因之一; 反之，与LM-MCF-7相比，DKK-1在MCF-7细胞中高表达，其通过上调nm23可抑制乳腺癌细胞迁移. 这一发现对进一步揭示乳腺癌细胞转移的分子机制具有的重要意义.

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采用蛋白组学技术分析质粒介导siRNA的“Off-target”效应

周昌华, 章崇杰, 彭晓东, 魏大鹏, 王光迪

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 170-180.

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siRNA的“脱靶效应” (off-target effects)是RNA干扰应用研究领域的热点问题. 采用蛋白组学技术对质粒介导的siRNA稳定沉默原癌基因cmyc可能存在的“off-target”效应进行初步研究, 为siRNA靶向特异性的系统评价奠定理论与实验基础. 构建靶向c-myc的siRNA真核表达质粒p-Mat01-1及其错配质粒p-Mis09-1, 空质粒pEGFP-C1为对照，并稳定转染MCF-7人乳腺癌细胞. 通过RT-PCR和Western 印迹分析结果显示p-Mat01-1稳定转染克隆中c-myc/c-MYC的表达降低. 采用2-DE及LC-ESI-MS/MS等方法, 研究了p-Mat01-1 与pEGFP-C1稳定转染克隆的蛋白组表达差异. 结果显示, p-Mat01-1稳定转染克隆中有47个c-myc非调控蛋白点表达升高或降低, 约占423个随机检测蛋白点的11.1%. 这些蛋白涉及细胞骨架、代谢、增殖、信号传导、分子伴侣、氧化还原等多条途径. 实验结果表明, 质粒介导靶向cmyc的siRNA在MCF-7细胞中存在明显的“off-target”效应, 提示在设计siRNA实验及应用研究时应系统考察其靶向特异性.

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三维回转骨细胞条件培养基对成骨细胞功能的调节作用

孟芮，罗明志，王亮，高翔，狄升蒙，商澎

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 181-188.

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骨细胞是骨组织中主要的力学感受器.研究失重条件下骨细胞对效应细胞的调控作用对于揭示失重引起的骨丢失机制具有重要意义.本研究拟采用三维回转器模拟失重，探讨模拟失重骨细胞条件培养基（RCM）对成骨功能的调节作用.小鼠骨细胞系MLO-Y4三维回转培养72 h后，收集回转条件培养基（RCM）和未回转对照组的条件培养基（CCM），用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法、对硝基苯磷酸（pNPP）法和流式细胞术（FCM）分别检测RCM对小鼠成骨样细胞系MC3T3-E1增殖、周期及细胞分泌碱性磷酸酶（ALP）活性的影响.采用RT-PCR方法检测RCM对MC3T3-E1成骨相关基因表达的影响.结果显示，三维随机回转72 h后的MLO-Y4 RCM可促进MC3T3-E1增殖：条件培养基培养MC3T3-E1 24 h和48 h后， 50% RCM组比CCM组分别增加了1.62和1.60倍，差异显著（*P <0.05），培养72 h后，100% RCM组比CCM组增加了1.69倍，差异显著（*P<0.05）；细胞周期检测结果表明，条件培养基培养24、48 和72 h后，RCM组部分恢复CCM引起的MC3T3-E1细胞周期阻滞；MC3T3-E1的ALP活性在RCM组和CCM组之间无差异；RT-PCR检测结果表明，100% MLO-Y4条件培养基培养MC3T3-E1 48 h后，降低了成骨相关基因ALP、Runx2、OPN、OC的表达.差异显著（* P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001）.实验结果表明，三维随机回转模拟失重培养骨细胞72 h后的条件培养基促进了成骨细胞增殖，抑制了成骨相关基因表达.

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魔芋中神经酰胺类物质的HPLC-ELSD分析及其含量测定

刘仁萍,杨建奎,詹逸舒,曾炽,肖鹜轩,吴永尧

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(02): 189-194.

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建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器分析神经酰胺的方法并进行了含量的测定. 色谱柱：ZORBZX Eclipse XDB-C18(4. 6 mm×250 mm, 5 μm)，洗脱方法：梯度洗脱，柱温：35　℃，流动相：甲醇/水,流速：1　ml/min;检测器：蒸发光散射检测器,漂移管温度：40　℃，氮气流速：1.5 L/min. 系统探讨了梯度洗脱的起始浓度、洗脱的时间和洗脱梯度的程序设置，最佳的梯度洗脱条件为5 min内，甲醇浓度从60% 线性增加为90%,从5 min到25 min,甲醇浓度线性增加为95%，在此条件下样品和标准品的分离色谱峰对称性较好.随后测定了各种样品中神经酰胺的含量，并进行了方法学验证，结果神经酰胺在0.2～2 μg之间线性关系良好, 最低检测限为0.01 mg/ml,R2=0.999　2;平均回收率为93.3%, RSD=1.65% (n=5).本法灵敏、方便、准确,重现性好,可用于魔芋神经酰胺类物质的分离及其含量的测定.

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