中国生物化学与分子生物学报

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陈淑娟,王嘉玺,邹民吉,王利红,赵春文,彭善云,贾兴旺

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 611-614.

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人白细胞介素１８（ＩＬ－１８）是新近发现的细胞因子之一．研究表明它参与Ｔ１辅助细胞介导的细胞免疫．利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人外周血细胞扩增得到了ＩＬ－１８的ｃＤＮＡ并测定其核酸序列．利用基因重组技术构建ＩＬ－１８的表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达．这为以后进一步研究ＩＬ－１８的功能奠定了基础．

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乙肝病毒核衣壳启动子内三链DNA的形成

刘定燮,王昌才

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 615-621.

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用电泳迁移分析方法研究了２１ｎｔ脱氧寡核苷酸Ｇ３ＴＧ２ＴＧＴ２Ｇ５ＴＧ２ＴＧＴ（ＣＰ１）与１２９ｂｐ的乙肝病毒（ＨＢＶ）核衣壳启动子（Ｃｐ）片段内一位点结合形成的三链ＤＮＡ的特异性及稳定性．在克隆有ＨＢＶ基因组的质粒ｐＣＰ１０的酶切产物中，ＣＰ１仅与含Ｃｐ的１２９ｂｐ片段结合．在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中其解离常数（Ｋｄ）为１．４×１０－７ｍｏｌ／Ｌ．不同离子稳定三链ＤＮＡ的效果依次为ｓｐ４＋（精胺）＞Ｍｇ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｎａ＋＞Ｋ＋，离子之间存在相互竞争作用．比ＣＰ１多一误配碱基的脱氧寡核苷酸Ｇ２ＴＧ２ＴＧＴＧ３ＴＧ２ＴＧ２ＴＧ２Ｔ（ＣＰ２）在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中与Ｃｐ结合的Ｋｄ值约为ＣＰ１的１／７，而在６０ｍｍｏｌ／ＬＫ＋或５ｍｍｏｌ／ＬＺｎ２＋溶液中检测不到它与Ｃｐ的结合，这进一步显示了三链ＤＮＡ形成的特异性．细胞的生理离子浓度被认为是：Ｓｐ４＋１ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｋ＋１４０ｍｍｏｌ／Ｌ，因此，ＣＰ１在细胞内将能特异地与Ｃｐ结合并具有较好的稳定性．

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一种快速mRNA差异显示技术及用于分离辐射诱导转录子

周平坤,孙国敬,隋建丽,孙志贤

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 622-625.

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介绍一种从不同类型细胞或不同生长状态细胞中分离差异表达基因的快速ｍＲＮＡ差异显示技术．其特点是不用同位素标记，操作简便，在普通琼脂糖凝胶电泳中就能分辨差异显示的ｃＤＮＡ带，便于ＤＮＡ回收和进一步重组克隆．用此方法成功地分离到电离辐射诱导转录子．

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安徽庐江鸭乙型肝炎病毒LJ-76转染细胞系的建立

殷慎敏,陈鸿珊

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 626-630.

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为建立鸭乙型肝炎病毒ＬＪ－７６的转染细胞系，将ＬＪ－７６病毒ＤＮＡ插入到ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ位点上，分离得到含有双拷贝ＬＪ－７６ＤＮＡ的重组质粒．通过磷酸钙沉淀方法，将经ＣｓＣｌ等密度离心纯化的ＬＪ－７６ＤＮＡ双体导入到人肝癌细胞ＢＥＬ７４０２中．收集转染细胞的培养液进行蔗糖密度梯度离心，所得沉淀经检测发现含有ＬＪ－７６ＤＮＡ并具有特异性ＤＨＢＶ内源性ＤＮＡ多聚酶活性；对上述样品通过ＤｏｔＥＩＡ检测ＤＨＢＶ核心抗原及表面抗原结果为阳性．Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明转染细胞内存在病毒ＤＮＡ复制中间体ｃｃｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ和ｒｃＤＮＡ，而ｃｃｃＤＮＡ被认为是复制活动较为活跃的标志．电镜观察转染细胞的上清发现有病毒颗粒的存在．

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大鼠FMR1同源基因cDNA的克隆、测序与选择剪接的初步分析

季红,黄涛,朱宁宁,吴冠芸,沈岩,Ａ．Ｓｉtｔｌｅｒ,Ｊ－Ｌ．Ｍａｎｄｅｌ

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 631-636.

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应用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从新生大鼠脑组织总ＲＮＡ扩增大鼠ＦＭＲ１同源基因的ｃＤＮＡ片段，克降至ｐＵＣ１８质粒中进行序列分析．获得从终止密码子起共１６８１ｂｐ的编码序列，尚缺少约２００ｂｐ的５′序列．所克隆的这部分大鼠ＦＭＲ１ｃＤＮＡ，不含有对应于人ＦＭＲ１基因的外显子１２及外显子１７第一和第三剪接受点之间的序列，提示大鼠ＦＭＲ１基因也有选择剪接表达．同源性分析显示，大鼠ＦＭＲ１与小鼠ＦＭＲ１基因的同源性为９７．７％，与人ＦＭＲ１基因的同源性为９４．９％；与小鼠ＦＭＲＰ（ＦＭＲ１蛋白）的氨基酸序列同源性为９８．４％，与人ＦＭＲＰ的氨基酸序列同源性为９７．９％．以大鼠ＦＭＲ１ｃＤＮＡ片段为探针检测到大鼠不同组织中ＦＭＲ１基因的选择剪接表达．上述结果为以大鼠为动物模型深入研究ＦＭＲ１基因功能奠定了基础．

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u-PA/t-PA嵌合型纤溶酶原激活剂(ut-PA)的构建、表达、纯化和性质研究

孙天霄,李夏军,徐长法

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 637-643.

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将尿激酶原（ｐｒｏ－ＵＫ）ｃＤＮＡ和组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）Ａ链ｃＤＮＡ克隆到Ｍ１３ｍｐ１８中，经过二次寡核甘酸诱导的大片段定点删除和一次寡核苷酸诱导的多位点突变，得到ｕ－ＰＡ（Ｌｅｕ１４４－Ｇｌｙ４０８）／ｔ－ＰＡ（Ｓｅｒ１－Ｔｈｒ２６３）（ｕｔ－ＰＡ）融合基因．将ｕｔ－ＰＡ融合基因克隆到表达载体ｐＣＭ－βｎｅｏ中，与ｐＣＭ－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－细胞，筛选稳定表达株．收集无血清表达上清，经苯甲脒柱纯化得到ｕｔ－ＰＡ纯品，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和纤维蛋白自显影显示ｕｔ－ＰＡ有两种分子量形式，分子量分别为６８ｋＤ和６１ｋＤ．纤维蛋白亲和性试验表明，ＬＵＫ（低分子量尿激酶）对纤维蛋白没有亲和性，而含有ＬＵＫ的ｕｔ－ＰＡ则对纤维蛋白表现出很强的亲和性，但ｕｔ－ＰＡ的亲和性略低于亲本ｔ－ＰＡ．

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IL-1β对正常和自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞iNOS基因转录调控因子的影响

韩梅,温进坤

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 644-648.

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用ＩＬ－１β处理体外培养的ＳＨＲ和ＷＫＹ大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ），比较两种大鼠ｉＮＯＳ基因表达活性的变化，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＶＳＭＣ受ＩＬ－１β刺激后，两种细胞的ｉＮＯＳ基因均表现出极高的转录活性，并且ＳＨＲ的ｉＮＯＳｍＲＮＡ水平高于ＷＫＹ大鼠．以大鼠ｉＮＯＳ基因转录调控区上游６００ｂｐ（－１０３７～－４３８）和下游５００ｂｐ（－４３７～４６）ＤＮＡ片段为探针，与ＶＳＭＣ核蛋白孵育后，进行凝胶电泳迁移率改变分析（ＥＭＳＡ），结果显示，两种大鼠的ＶＳＭＣ被ＩＬ－１β处理后，其核蛋白可分别与转录调控区上游或下游序列结合形成一条电泳滞后带．但是，转录调控区上游序列和下游序列与核蛋白形成的复合物具有明显不同的电泳迁移率．与ＷＫＹ大鼠相比，ＳＨＲ的ＶＳＭＣ核蛋白与ＤＮＡ结合活性较高．提示ＳＨＲ的ＶＳＭＣｉＮＯＳ基因及其转录调控因子对ＩＬ－１β的反应与ＷＫＹ大鼠明显不同．

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表面电荷突变与胰蛋白酶底物专一性的改造

文华,张庭芳,张龙翔

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 649-654.

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分别利用酶切重组和“３＋１”引物ＰＣＲ定点突变的方法构建了三个胰蛋白酶表面电荷双突变体：Ｒ６２Ｄ＋Ｋ９７Ｅ、Ｒ６２Ｄ＋Ｋ１７５Ｅ和Ｋ９７Ｅ＋Ｋ１７５Ｅ．对三者在Ｅ．ｃｏｌｉＸ－９０菌中的表达产物进行了动力学测定，分别得到了三种双突变体在两种ｐＨ条件下，水解ＴＡＭＥ、ＴＬＭＥ两种底物的动力学数据．结果表明，Ｒ６２Ｄ＋Ｋ１７５Ｅ和Ｋ９７Ｅ＋Ｋ１７５Ｅ在ｐＨ６．８５时，对两种底物的催化活性与野生型相比下降了２～３个数量级，当ｐＨ升高至８．８５时，它们的活性基本丧失；双突变体Ｒ６２Ｄ＋Ｋ９７Ｅ虽然催化活性也有所降低，但随着ｐＨ的升高，它对Ｌｙｓ底物的特异性（选择性系数２５倍于Ａｒｇ底物）转变为对Ａｒｇ底物略高的特异性，基本符合分子设计．实验结果还表明，各种双突变体催化活性的降低主要是由于酶和底物的亲和力降低引起的．

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46,XY女性性反转患者SRY基因启动子区一个新的点突变及其功能分析

陈云弟,周刚,孙琼,陆建英,曾溢滔

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 655-660.

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通过ＤＮＡ序列测定在一名４６，ＸＹ女性性反转患者ＳＲＹ基因启动子区发现了一个新的突变：ｎｔ．－８１Ｇ→Ａ．该突变不见于正常男性，因此不是ＤＮＡ多态性．为了检测这一点突变对ＳＲＹ基因表达功能的影响，构建了分别由正常或突变的人ＳＲＹ基因启动子区片段调控氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）报告基因表达的两个质粒，寡核苷酸探针杂交证实该启动子片段正常或携带有Ｇ→Ａ突变．这两个质粒分别与ｐＳＶ－β－半乳糖苷酶内对照质粒共转染ＨｅＬａ细胞后，瞬间表达分析显示这一突变对ＣＡＴ酶活性水平无显著影响（０．５０＞Ｐ＞０．２０）．上述正常和突变的ＳＲＹ基因启动子片段与Ｋ５６２细胞核抽提物的凝胶阻滞实验也表明，突变对Ｋ５６２细胞核蛋白与ＳＲＹ基因启动子区的结合影响不大．研究ＳＲＹ基因的表达调控对阐明人的性别决定机制及性反转的病理机制具有重要意义

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碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肾小球系膜细胞原癌基因c-fos和c-myc表达的影响

刘静芳,温进坤

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 661-665.

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在建立大鼠肾小球系膜细胞（ＭＣ）体外培养方法的基础上，通过３Ｈ－ＴｄＲ参入实验，ＲＮＡ印迹分析和斑点杂交观察ｂＦＧＦ对ＭＣＤＮＡ合成及原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达的影响．结果表明，ｂＦＧＦ作用于ＭＣ１８ｈ，ＭＣ的３Ｈ－ＴｄＲ参入率明显增加（Ｐ＜０．０５），２４ｈ达到高峰（Ｐ＜０．０１）；ｂＦＧＦ显著诱导原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达，其表达活性分别于３０ｍｉｎ和１ｈ达到高峰．提示ｂＦＧＦ是ＭＣ的强效丝裂原，其对ＭＣＤＮＡ合成的促进作用与诱导原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达有关．

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人TPON端结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

刘丽,田生礼,王艳华,孟岩,芦兴武,谢宝树

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 666-671.

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在利用反转录－ＰＣＲ从人胎肝中获得编码人血小板生成素（ｈＴＰＯ）全长ｃＤ－ＮＡ的基础上，综合ＴＰＯ结构与功能的研究信息，在大肠杆菌中表达了成熟肽Ｎ端结构域．目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白的３０％；包涵体经变性、复性、凝胶过滤、离子交换层析等步骤处理后，所得产物给Ｂａｂｌ／ｃ小鼠腹腔连续注射８ｄ，第９ｄ摘眼球采血，计数血小板的数量．结果表明，ＴＰＯＮ端结构域具有明显促进血小板生成的作用．

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嗜热细菌的碱性磷酸酯酶的研究

盛小禹,王曦,高静波,毛裕民

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 672-676.

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从５８株来自国内温泉的嗜热细菌中分离到一株菌，它所产生的耐热碱性磷酸酯酶在９５℃中保温６０ｍｉｎ后仍保留原来活力的７５％．测定了酶的一系列性质，包括酶作用的最适ｐＨ、最适离子强度、最适温度，以及酶的热稳定性、米氏常数、活化能等等，还研究了一些无机离子、氨基酸以及表面活性剂对酶活的影响．ＤＮＡ杂交方面的初步实验结果表明用该酶标记的核酸作为非放射性探针可用于在高温下进行的杂交反应．

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鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片段的人源化分子设计

刘士辉,王国力,黄君健,俞炜源,黄培堂,黄翠芬

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 677-685.

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产生免疫原性的残基主要是位于蛋白表面的暴露残基，为了消除鼠抗体对人的免疫原性，利用表面再塑的方法对本室克隆的鼠抗人纤维蛋白抗体单链Ｆｖ片段进行了人源化分子设计．首先确定了鼠及人Ｆｖ片段的表面残基，在此基础上分析了鼠与人抗体Ｆｖ片段表面残基的差异，将存在差异的鼠抗体的表面残基换成人的，从而实现鼠抗体的人源化．提出了残基最高频率人源化及最相似链人源化两种分子设计方案．人源化的鼠抗人纤维蛋白抗体单链Ｆｖ片段的结构经Ｐｒｏｆｉｌｅｓ－３Ｄ检测证明合理，替换的表面残基的溶剂可及性未变，而且未对ＣＤＲｓ的空间构象产生明显影响，应不会影响与纤维蛋白的亲和力，为鼠抗体人源化实验研究奠定了基础．

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两相分配法制备玉米根质膜及其纯度鉴定

朱美君,陈珈,朱庆鸿,王学臣

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 686-690.

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用ＤｅｘｔｒａｎＴ５００，ＰＥＧ３３５０两相体系制备玉米根质膜．首先在高盐浓度（２２ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）下选用五种不同的聚合物浓度（５．８％、６．０％、６．２％、６．３％、６．４％，Ｗ／Ｗ），研究了玉米根质膜在两相体系中的分配情况，在此基础上进一步研究了Ｎａ－Ｃｌ浓度（２、４、５、１１、２２ｍｍｏｌ／Ｌ）对玉米根质膜的纯度及得率的影响．结果表明，制备玉米根质膜选用６．２％（Ｗ／Ｗ）聚合物浓度，７．５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的两相体系比较合适．标志酶鉴定及低ｐＨ值磷钨酸染色电镜检测均表明获得了高纯度密实的正向型的质膜囊泡，质膜标志酶ＶＯ３－４－ＡＴＰａｓｅ的活性潜势达８８．９％．

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人神经生长因子融合蛋白的纯化及其生物活性的研究

李卓玉,袁静明

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 691-694.

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用一株基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ２４２６／ｐＭＮ表达了麦芽糖结合蛋白－人神经生长因子融合蛋白．菌体超声破碎后，上清液经直链淀粉亲和柱一步即可获ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯融合蛋白（５５ｋＤ），为麦芽糖结合蛋白（４２ｋＤ）与人神经生长因子（１３ｋＤ）的络合物，产率约１０％．产物用鸡胚背根神经节检测生物活性，１ＢＵ不大于１０ｎｇ，与小鼠颌下腺β神经生长因子具有类似生物活性

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真核细胞基因工程产物人生长激素的纯化研究

于自然,俞新大,周卫东,耿朝晖,张宝珠,李建民,崔同昌

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 695-698.

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应用反相高效液相色谱法（ＲＰ－ＨＰＬＣ）对真核细胞基因表达产物人生长激素进行了纯化研究，发现在７１．６７％的乙晴浓度下人生长激素可有效地与其它杂蛋白分离，乙晴与人生长激素的短时间接触不影响其放射免疫活性．

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聚球藻类金属硫蛋白的纯化及部分性质的研究

郭祥学,陈正佳,但春涛,施定基,茹炳根

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 699-703.

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单细胞蓝藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｕｓｓｐ．ＰＣＣ７９４２）以５０μｍｏｌ／ＬＺｎ２＋诱导８ｄ后收集，破碎取上清液经凝胶过滤、离子交换层析及反相ＨＰＬＣ纯化得到类金属硫蛋白，产率为每升培养液收集１．５ｇ鲜藻，得２．５ｍｇ纯品．其单体分子量为８７５０，Ｎ未端测定为缬氨酸，氨基酸组成分析得每分子（５６个氨基酸）含１０个半胱氨酸，疏水氨酸较多，且含有芳香族氨基酸，原子吸收光谱测得每分子蛋白结合４个二价金属．以上表明，该种类金属硫蛋白与哺乳动物金属硫蛋白结构差异很大，可能只是一种进化上的趋同．

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凝溶蛋白对骨骼肌天然细肌丝的作用

陈明,李爱媛,周念辉

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 704-708.

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凝溶蛋白是Ｆ－肌动蛋白丝的钙依赖性切割性蛋白质．经过焦磷酸溶液选择性抽提和微酸性介质的有效分离，可以得到纯度较高的天然细肌丝．在Ｃａ２＋存在时，凝溶蛋白可以切割天然细肌丝．但是，凝溶蛋白对天然细肌丝的作用时程与其对Ｆ－肌动蛋白丝的作用有着显著差异，提示细肌丝中的非肌动蛋白蛋白质可能影响了凝溶蛋白对天然细肌丝的结合或者切割速率．

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硝酸盐、镁盐对林可霉素生物合成的促进作用

焦瑞身

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 709-715.

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在林肯链霉菌生物合成林可霉素代谢调节的研究中，发现硝酸盐可明显促进林可霉素的生物合成．加入硝酸钾０．８％，林肯链霉菌合成林可霉素的产量可增加３７％．在发酵９６ｈ之前加入硝酸盐均能促进林可霉毒的合成，但产量的增加随加入时间的延迟而降低．硝酸钾在促进产量的同时，使菌体生长减少，看来硝酸盐对林可霉素的合成与菌体生长之间起着调节作用．洗涤菌体试验指出，硝酸盐的加入诱导了林可霉素合成所需要的酶系，这可能是加入硝酸盐后，产生进一步氮代谢的结果；蛋白胨不能代替硝酸盐，进一步说明硝酸钾的作用并不是作为氮源利用．在蛋白质合成抑制剂氯霉素存在下，硝酸盐不再能促进林可霉素的合成，说明氯霉素抑制了硝酸盐或其代谢中间物所诱导的酶系的合成．同时还报导了镁盐促进林可霉素生物合成现象的初步观察结果．硫酸镁在促进林可霉素产量提高的同时，使菌体生长延迟．硫酸镁的这种作用机制可能是通过磷酸镁铵沉淀，降低了培养基中游离氨和可溶性磷酸盐浓度，解除了铵盐和磷酸盐对林可霉素合成的抑制．

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激动素、脱落酸和丙二醛对SOD活性影响及其与SOD构象和疏水性变化间的关系研究

伍泽堂,候万儒

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 716-718.

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激动素、脱落酸和丙二醛对ＳＯＤ活性影响及其与ＳＯＤ构象和疏水性变化间的关系研究伍泽堂候万儒（四川师范学院生物系，南充６３７０００）我们在实验中曾发现激动素（ＫＴ）激活小麦ＳＯＤ活性，脱落酸（ＡＢＡ）、丙二醛（ＭＤＡ）抑制小麦超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活...

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抽提大豆各组织总DNA方法的比较研究

忻骅,袁卫明,顾其敏

中国生物化学与分子生物学报. 1997, 13(06): 719-721.

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抽提大豆各组织总ＤＮＡ方法的比较研究忻骅袁卫明顾其敏（上海复旦大学生物化学系，上海２００４３３）十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）选择性沉淀ＤＮＡ的方法被广泛用于抽提生物组织，特别是植物组织的总ＤＮＡ，它简便快速，所得ＤＮＡ的纯度好，适用于进一步的酶切...

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