中国生物化学与分子生物学报

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柳永蕾;宋现让

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 1-8.

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乏氧诱导因子（HIF）是乏氧应答中起重要作用的转录因子，一直是乏氧研究的焦点.HIF由α亚基和β亚基组成，α亚基包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中α亚基因诱导条件不同通过选择性剪接产生不同变体.β亚基包括ARNT、ARNT2和ARNT3.α与β亚基在乏氧等应激反应时形成二聚体HIF启动靶基因转录表达，参与多种细胞生物学功能的调控.目前为止，大多数的研究都集中于野生型HIF-1α，对它的结构、表达调控及其调控做了相对全面而清楚的了解.后来通过多种策略及方法，陆续发现并克隆出了除HIF-1α外的HIF各亚基.研究不再局限于HIF-1α，而是扩展至HIF整个系统，如相继发现的HIF-2α和HIF-3α亚基，以及它们的变体，对HIF-1α的研究也更深入了，但是关于HIF-1α的变体、HIF-2α、HIF－3α及β亚基的表达调控及功能还不明确，是未来研究的方向.本文全面介绍HIF的最新研究进展，阐述HIF各亚基的结构、表达调控及其靶基因的表达情况.

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整合素β3亚单位胞内区在骨桥蛋白诱导血管平滑肌细胞黏附和迁移中的作用

李菁菁;温进坤;韩梅;陈英珠

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 9-16.

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为阐明整合素β3亚单位胞内区及其不同保守序列在骨桥蛋白（OPN）诱导血管平滑肌细胞（VSMC）黏附和迁移中所起的作用, 构建了整合素β3亚单位胞内区肽段真核表达载体（p-EGFP-C3-β3CD）, 并人工合成了含有β3亚单位胞内区不同保守序列（NXXY）的寡肽（肽-747和肽-759）, 通过导入VSMC, 观察它们对OPN诱导VSMC黏附和迁移的影响.结果显示, 整合素β3胞内区在VSMC中强制性表达可使细胞在OPN上的黏附和迁移明显下降（分别为对照组的34.3%和31.7%）,导入肽-747、肽-759和肽-747+肽-759均可显著抑制VSMC的黏附和迁移, 其中肽-747+肽-759的作用更强(分别为对照组的36.4%和31.1%). 免疫荧光结果显示, 在转染p-EGFP-C3-β3-CD或肽-747+肽-759的VSMC中, 黏着斑蛋白的磷酸化水平降低, 黏着斑形成明显减少.研究结果表明, 整合素β3亚单位胞内区及其NXXY保守序列在黏着斑相关蛋白募集、黏着斑形成及VSMC黏附和迁移方面发挥重要作用.

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纤溶酶原K5抗血管增生活性依赖其完整Kringle结构域

李朝阳;蔡卫斌;杨中汉;杨霞;宋志宏;周世豪;李明友;刘祖国;高国全

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 17-23.

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根据K5蛋白(Pro451—Ala541)的结构特征和二硫键分布特点，设计K5的两个缺失突变体K5 mut1(Cys461—Cys540，保留K5 kringle环3个完整二硫键但去除N端和C端多余氨基酸)和K5 mut2 (Cys482—Cys535，打开kringle环，只保留2个二硫键).以野生型人纤溶酶原K5 cDNA为模板，用PCR方法得到编码缺失突变体的DNA片段，定向克隆入pET22b(+)质粒载体，重组体转化进大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达，产物经亲和层析和高浓度甘油透析纯化后进行鉴定和生物活性测定.K5 mut1蛋白特异性抑制人视网膜微血管内皮细胞增殖，且活性强度是完整的K5蛋白2倍；K5 mut2对人视网膜微血管内皮细胞无显著抑制作用.结果提示，完整的Kringle结构（包含3个二硫键）是维持人纤溶酶原K5抗血管增生活性的必需结构域，而K5分子中Kringle结构域外的N端和C端氨基酸臂则并非其活性所必需.

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双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的克隆表达及其对丙型肝炎病毒蛋白合成的抑制

贾因棠;魏来;蒋栋;丛旭;费然

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 24-30.

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α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物，但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转，其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子——双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于PKR是否在IFN-α抗HCV的机理中起抑制作用目前仍有争议.为研究PKR对HCV蛋白合成环节是否有抑制作用，通过构建野生型 PKR真核表达载体（pPKRwt）及主要起负性调节作用的缺失突变PKR真核表达载体（pPKRΔ6）,并将pPKRwt /pPKRΔ6 与HCV复制子RNA同时转染Huh7细胞进行共表达, 用Western印迹检测 HCV IRES 下游的NPTⅡ蛋白表达水平，与转染空载体的对照细胞及单用IFN-α处理的细胞相比较.结果显示：表达PKRwt的细胞中NPTⅡ蛋白水平低于转染空载体的对照细胞，但高于经IFN-α单独处理的细胞;表达PKRΔ6的细胞中NPTⅡ蛋白水平与对照细胞无明显差别，但PKRΔ能部分抵消IFN-α的抑制作用，说明在IFN-α抑制HCV IRES指导的蛋白合成中，PKR有一定的抑制作用，但可能还有其它的PKR非依赖机制参与.

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黑色素瘤相关抗原家族新基因restin的组织表达谱

路凡;胡沛臻;傅海燕;赵文明;赵忠良;

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 31-36.

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Restin是从维甲酸诱导肿瘤分化细胞中克隆的一种黑色素瘤相关抗原家族(MAGE)的新成员.对该基因在不同组织、不同细胞系的表达水平进行研究,将有利于揭示其生物学功能.使用α3-2P-dCTP标记人restin编码区基因作为探针,针对12种不同成人组织mRNA的Multiple TissueNorthern(MTN)膜和含76种成人、胎儿及常用细胞系mRNA的Multiple Tissue Expression(MTE)Array膜进行杂交分析,同时利用地高辛标记探针对11种常见肿瘤组织进行原位杂交检测.结果显示,MTN膜杂交中,12种组织显示均一杂交条带,约1.8 kb,提示该基因可能不存在剪接变异体;MTE膜杂交中,正常组织中均有不同程度的表达,但在肿瘤细胞系中均低表达或者不表达;原位杂交的结果显示,在8种恶性肿瘤组织中均不表达,而在3种良性肿瘤组织中呈现较低的表达.结果提示,该基因在正常组织中的表达明显高于肿瘤组织和肿瘤细胞系,完全不同于其它MAGE-A、B、C的组织表达方式.结合该基因在维甲酸诱导分化的肿瘤细胞中高表达,推测restin可能与正常细胞的分化、增殖有关.

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外源性人TIMP-1基因在转基因小鼠染色体上的整合及定位

朱晗玉;陈香美;马润林;张冬芬;任建功

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 37-42.

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为探讨外源基因人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（human tissue inhibitor of metalloproteinase-1, hTIMP-1）基因在转基因小鼠家系染色体上的整合和精确定位，应用Southrn印迹检测外源基因在染色体上整合的位点及拷贝数.结果表明，外源基因是以单拷贝、单位点形式整合；应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术检测F4～F20代转基因小鼠中外源基因的整合.结果证明，该家系转基因小鼠自F4代起是纯合子，外源基因整合在17号染色体E区；反向PCR法（Inverse PCR, IPCR）克隆出约3.8 kb外源基因整合位点处的侧翼序列.分析表明，外源基因整合在17号染色体E1.3区，ALK（anaplastic lymphoma kinase, ALK）基因第23个内含子区域.结果提示，获得的转基因小鼠为纯系，外源基因hTIMP-1已稳定整合在转基因小鼠染色体上，并能遗传给后代.

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人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

仇灏;金美芳;周迎会;孙其昌;刘可人;沈宏杰;吴士良

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 43-48.

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反义封闭人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 (pp-GalNAc-T2)的基因表达, 对胃癌细胞SGC7901中转化生长因子-β1(TGF-β1)与基质金属蛋白酶2 (MMP2)基因表达及细胞增殖有影响.在对几株肿瘤细胞的pp-GalNAc-T2基因表达水平进行分析后, 以高表达pp-GalNAc-T2的人胃癌细胞株SGC7901的总RNA为模板, 利用RT-PCR方法扩增两段不同长度pp-GalNAc-T2基因片段, 构建反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901, 通过Ｇ418筛选, 建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901 ppGalNAc-T2基因表达的亚细胞克隆.通过流式细胞术、荧光显微镜、RT-PCR及Western印迹检测反义封闭pp-GalNAc-T2基因RNA表达后胃癌细胞SGC7901增殖以及TGF-β1、MMP2表达水平的变化. 反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达后, 胃癌细胞SGC7901 pp-GalNAc-T2的表达水平明显降低, 细胞分裂增殖减慢, 表明反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达对胃癌细胞SGC7901的生长增殖有影响.结果还显示, 反义封闭pp-GalNAc-T2基因表达可使TGF-β1、MMP2基因在mRNA与蛋白质表达水平均增加, 提示pp-GalNAc-T2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响.以上结果表明, pp-GalNAc-T2基因在肿瘤细胞中广泛表达, 并可能与肿瘤的增殖及浸润转移相关.

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乙型肝炎病毒蛋白对纤维介素基因的激活作用

韩梅芳;习东;罗小平;宁琴

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 49-54.

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纤维介素基因（fgl2）在人和小鼠的重型肝炎的发病机制中发挥重要作用.为探讨乙型肝炎病毒（HBV）编码蛋白对人纤维介素基因（hfgl2）的激活作用, 构建了HBV编码蛋白C、 S和X的真核表达质粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx, 分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因质粒（βGal ）共转染到CHO细胞和HepG2 细胞, 采用免疫组织化学和免疫印记方法(Western blotting)鉴定病毒蛋白的表达.通过检测报告基因荧光素酶（LUC）及β半乳糖苷酶的表达活性, 反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用.结果显示, 转染了真核表达质粒的细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白, 在CHO细胞, 转染pcDNA-HB组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的5.4和6倍, 在hepG2细胞, 转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的8.7和11倍.研究表明, CHO和HepG2细胞中表达的HBV C蛋白和X蛋白均具有激活hfgl2的功能, 而S蛋白则不能激活.进一步揭示了HBV病毒蛋白与宿主基因的相互作用机制.

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小鼠短暂前脑缺血海马中半胱天冬酶-３酶原表达的变化

刘天会;陈瑞;杜艳玲

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 55-58.

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通过测定脑缺血再灌注时海马中半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)的表达变化, 从细胞凋亡的角度探讨脑缺血再灌注损伤的分子生物学机制及procaspase-3的活化机制.将C57BL/6N小鼠随机分为假手术组(正常对照组)、缺血再灌注组(I/R组), 后者夹闭双侧颈总动脉20 min后再通血流, 建立前脑缺血再灌注模型, 分别于再灌注6 h、12 h、24 h和48 h取海马.采用蛋白免疫印迹(Western blotting)方法检测海马中procaspase-3的表达变化.结果显示, 12 h I/R及24hI/R组海马中总procaspase-3水平与假手术组相比有明显升高, 且差异有统计学意义(P<0.05),24 h I/R组海马中去磷酸化水平与假手术组相比有明显升高, 且差异有统计学意义(P<0.05),而各组procaspase-3磷酸化水平与假手术组相比差异无统计学意义.结果提示, 脑缺血再灌注损伤诱发procaspase-3表达增加,其中procaspase-3去磷酸化水平高明显, 提示脑缺血再灌注损伤可能诱发procaspase-3去磷酸化, 继而促进procaspase-3转化为活性形式.

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锤头状核酶对转化生长因子β1 RNA的体外剪切作用

刘芳;邹萍;吴耀辉;易雪

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 59-62.

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为研究转化生长因子β1（TGFβ1）在造血调控中的关键作用, 构建针对抗转化生长因子β1的锤头状核酶, 并对它的体外剪切活性进行探讨. TGFβ1 cDNA部分基因片段其克隆入T载体中, ３２Ｐ标记TGFβ1体外转录物, 变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化获得靶RNA.计算机设计抗TGFβ1的锤头状核酶, 并把合成的核酶基因片段克隆入pGEM-9Zf(-)中T7启动子的下游, 凝胶电泳纯化回收３２Ｐ标记核酶的体外转录物.在不同条件下进行核酶的剪切反应, 变性PAGE, 放射自显影.活性的Rz445在37℃时具有良好活性, Km为29.55 nmol/L, Kcat为0.1533 min－1, 突变型核酶Rz445m没有剪切活性.制备的Rz445在体外具有良好的特异催化剪切活性, 并有望胞内抑制TGFβ1表达, 从而在干细胞移植中应用.

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猫爪草提取物对结核分枝杆菌临床分离株的可能作用靶标

谢建平,;何颖;乐军;胡昌华;王洪海

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 63-69.

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利用双向电泳技术, 对猫爪草提取物作用前后的结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析, 发现其中22个蛋白质斑点的浓度具有差异,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术, 对其中4个表达明显下调和1个明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定, 获得5个明确的肽质量指纹图谱.通过数据库检索, 确定这5个蛋白质分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、吲哚-3-甘油磷酸合酶、烯酰-CoA水合酶、琥珀酰辅酶A合成酶和60 kD的分子伴侣2.其中前4个分子是首次报道参与结核分枝杆菌的重要生理活动.该结果有助于了解猫爪草提取物对结核分枝杆菌生理的影响, 为进一步确定中药猫爪草提取物对结核分枝杆菌的作用靶标和机理提供了基础.

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JAK-STAT参与血管平滑肌细胞血管紧张素原和心钠素基因的转录激活

聂磊;韩梅;温进坤

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 70-76.

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为探讨Janus蛋白酪氨酸激酶2-转导及转录激活因子5（JAK2-STAT5）途径在介导血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）血管舒-缩肽表达调节的作用及分子机制, 以Ang Ⅱ为诱发因素刺激培养的大鼠VSMC, 用免疫共沉淀、Western印迹分析和激光共聚焦显微镜观察STAT5磷酸化及其核转位, 用电泳迁移率改变分析（EMSA）确定STAT5与血管活性肽基因调控区顺式调控元件的结合活性. 结果显示, STAT5磷酸化水平分别于Ang Ⅱ刺激10 min和12 h出现两个高峰, 增加的磷酸化STAT5主要分布在细胞核内. Ang Ⅱ诱导的STAT5活化与核转位可被JAK2的特异抑制剂AG490所抑制. EMSA结果显示, 用Ang Ⅱ刺激VSMC后, 核蛋白与含有血管紧张素原基因启动子STAT5识别序列的探针结合活性显著升高,而核蛋白与含有心钠素（ANF）基因启动子STAT5识别序列的探针结合活性则呈下降趋势, 核蛋白与两种探针的结合活性均可被JAK2抑制剂AG490所消除, 并且加入抗STAT5抗体后均可出现滞后的超迁移带. 结果提示, Ang Ⅱ通过激活JAK2-STAT5介导信号向胞核内传递, STAT5与相应的顺式元件结合是启动血管紧张素原和心钠素基因表达所必需的转录调控机制之一.

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棉花纤维蛋白质3种提取及二维电泳方法的比较

徐子剑;舒骁;杨亦玮;刘进元

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 77-80.

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高质量的蛋白样品制备是进行二维电泳的先决条件.棉花纤维中含有纤维素、多酚、多糖等严重干扰二维电泳的物质, 增加了蛋白提取和二维电泳的难度.分别采用3种提取植物组织蛋白的方法(水法、酚法和尿素法), 提取棉纤维总蛋白, 进而进行了二维电泳分析.在蛋白产量、蛋白纯度和电泳图谱等方面对3种方法进行了比较, 结果采用酚法提取的样品取得了较好的电泳图谱, 有望成为从棉纤维样品中提取总蛋白的可选方法.

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六个中国固有绵羊品种遗传关系的微卫星标记分析

雷雪芹,;徐廷生;陈玉林;陈宏,;袁志发

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 81-85.

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用5对微卫星引物对哈萨克羊、蒙古羊、兰州大尾羊、同羊、大尾寒羊、小尾寒羊共6个中国固有绵羊品种基因组进行了扩增, 对扩增结果用7种聚类方法(欧氏距离、欧氏平方距离、夹角余弦、皮尔逊相关、车贝雪夫距离、街区距离、明考夫斯基距离)进行了分析.结果表明, 分布在我国西北部的绵羊品种哈萨克羊、蒙古羊、兰州大尾羊在大多数情况下总是先聚在一起, 相对分布于中原地带的同羊、小尾寒羊和西北部的3个品种间距离较远,同羊和小尾寒羊之间距离也很远,大尾寒羊和小尾寒羊之间没有明显的遗传关系, 此结果与《中国绵羊品种志》中记载的情况基本一致.同时, 本研究结果也说明7种聚类方法均适用于微卫星标记资料的遗传分析.

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菜心中SDS-PAGE向负极泳动的富含苯丙氨酸的蛋白的发现

曾秋莲,;黄美意;徐杰;;王再花;叶庆生;梁秀文;罗宇华;苏燕琼;尹汉萍;刘灿;韩雪;董宇亮;郭晋雅;扬净;陆满芳;杨赞和;黄丽君

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(01): 86-90.

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在提取乙醇酸氧化酶同工酶的过程中, 发现了一种在SDS变性下向负极泳动的富含苯丙氨酸的碱性蛋白.在3次重复实验中, 均可以从SDS-PAGE后的负极缓冲液中获得这种蛋白, 其碱性与酸性氨基酸残基的比例分别高达1.46、1.28和0.89,而苯丙氨酸含量分别高达为60.00%、65.62%和62.30%.其余氨基酸残基的含量则和普通蛋白的相近似.由于该富含苯丙氨酸的碱性蛋白是水溶性的, 碱性氨基酸残基应主要分布在蛋白的表面,而苯丙氨酸则组成一个强疏水内核.

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