中国生物化学与分子生物学报

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刘长征;杨克恭;陈松森

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 177-183.

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绵羊callipyge（美臀）是一种可遗传的肌肉肥厚体征,该表型以独特的方式“极化超显性”遗传给子代.绵羊18号染色体的DLK1-GTL2印记化结构域内存在1个远距离调控元件（long-range control element，LRCE），该元件发生单个碱基突变（A→G）.A→G突变顺式作用于印记化结构域内的相关基因，印记化基因的产物包括蛋白质及非编码RNA分子，它们相互作用导致美臀表型产生.美臀表型产生及其独特的遗传方式是绵羊基因组内的蛋白质编码基因、非编码RNA基因以及表观遗传效应等3个信息层相互作用的结果，说明以前被忽略的隐藏信息发挥了极其重要的调控功能.这些现象对经典的中心法则形成了挑战，但是为基因组研究拓展了新的领域.

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糖类的生物信息学资源

周永达;时春娟;张剑波;王克夷;汤杰

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 184-184~189.

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生物信息学在推动遗传学和蛋白质科学的研究领域中，已发挥了举足轻重的作用.相比较而言，糖科学产生的信息还比较有限，随着人们对糖类分子的关注，糖生物学的发展也出现新的契机，其信息正在飞速地增长.对已经获得的糖类相关知识进行系统整合就显得越来越有必要，许多研究型数据库和免费工具已应运而生，并且数目在不断扩大，正成为科学工作者非常便利的工具.但到目前为止，许多数据库或者网络预测工具在文献中很少提及或难以找到，给研究者带来了不少的麻烦.部分原因是数据库资源本身数据不断在更新，人机界面也变得越方便和人性化，另外就是人们对于这些新型的研究工具了解较少.这篇综述介绍了目前网络上最常用的糖类生物信息学资源，包括糖的一级结构，分析测试数据、构象，酶，凝集素，糖蛋白等方面的各种数据库.

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转化生长因子β激活性激酶在胶质细胞信号转导中的作用机制

沈勤;张然;施建华;殷冬梅;顾建兰

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 190-190~196.

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丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和 NFκB介导了炎症细胞转录活性的信号转导过程.转化生长因子β激活性激酶（TGFβ-activated kinase 1，TAK1）是这些转导通路的上游激酶.通过在胶质细胞株中瞬时转染TAK1和它的结合蛋白因子（TAK1-binding protein1 TAB1）基因，或与iNOS(可诱导型氧化氮合酶基因)启动子报告基因（iNOS-Luc）质粒共转染，探讨中枢两类胶质细胞在炎症反应过程中TAK1诱导iNOS 和细胞因子表达的作用机制.结果显示，TAK1明显激活iNOS 和细胞因子（TNFα、IL-1、IL-6）的表达活性. 而且当使用它的下游激酶p38 MAPK、JNK和NFκB的抑制剂（SB203580、SP620125和CAPE）后，这些表达活性明显被抑制.用IκBα的磷酸化突变体质粒(IκBαM)共转染胶质细胞株，能完全抑制iNOS的表达活性.研究结果提示：在胶质细胞内的p38 MAPK、JNK和NFκB信号介导的iNOS和细胞因子的转录表达过程中，TAK1起着非常重要的调节作用.

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草苷膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构预测

刘光全;;刘柱;陆伟;徐玉泉;梁爱敏;平淑珍;张维;陈明;林敏

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 197-203.

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利用错误倾向PCR（error-prone PCR）突变技术，以可变盐单胞菌（Halomonas variabilis）HTG7的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶基因为模板进行随机PCR扩增，得到目的基因片段（约1.35 kb）.将该基因片段与pACYC184载体连接后转化EPSP合酶缺陷型菌株大肠杆菌ER2799.利用功能互补筛选法得到了2株不具有草苷膦抗性的EPSP合酶阳性克隆突变株，记为Pmu1和Pmu2.序列分析表明，突变体Pum1的EPSP合酶编码区与突变前基因相比，核苷酸有2处发生突变，导致氨基酸残基1处发生了改变；突变体Pmu2的EPSP合酶编码区与突变前基因相比，核苷酸有5处发生突变，导致氨基酸残基2处发生了改变.对突变前后EPSP合酶进行比较预测发现，其三级结构及蛋白中心骨架是大致相同的，但突变前后氨基酸位点肽平面和Cα相连的N键之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明，酶的功能主要由蛋白的构象决定，二肽链形成后肽平面和N键之间角度的变化，造成高级结构构象细微的差别，致使草苷膦抗性功能丢失.

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木聚糖酶XYNB的N46D突变、表达及酶学性质变化

杨浩萌;柏映国;李江;罗会颖;王亚茹;伍宁丰;范云六;姚斌

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 204-211.

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对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点，该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.将突变酶XYNBN46D在毕赤酵母中表达,表达的XYNBN46D经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明, XYNBN46D的最适pH值由5.2下降到4.2，pH稳定性也向酸性pH偏移，同时，热稳定性和最适温度也有一定的提高, 但酶的比活性显著下降.结果证实，木聚糖酶XYNB的第46位Asn与其最适pH值相关.对导致酶学性质改变的可能因素进行了分析，结果为进一步的结构与功能研究提供了资料.

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肌钙蛋白I2与“孤儿”核受体ERRα1相互作用位点的鉴定

李渝萍;陈敏;陈彬;陈健;李强;娄桂予;周度金

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 212-212~216.

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为深入研究肌钙蛋白I2（TNNI2）作为核受体相互作用蛋白参与核受体基因表达调控的分子机制，采用缺失突变联合酵母双杂交技术证明了TNNI2与ERRα1的相互作用位于TNNI2的1～128位氨基酸残基区域.该区域包括TNNI2蛋白的N末端、抑制肽段（96～116位氨基酸残基）和一个核受体结合位点LXXLL模序（即NR盒）.哺乳细胞瞬时共转染实验证实，TNNI21-128缺失突变体不具备辅助活化功能，并能作为负显性突变体完全抑制野生型TNNI2的辅活化作用.研究充分证明TNNI2与核受体的相互作用定位于TNNI2蛋白1～128氨基酸残基，并从侧面进一步证实了TNNI2能辅助核受体反式激活作用的功能.

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Sim2基因对PC12细胞周期的影响

孟宪芳;陈昊;韦琼;甘露;施静;彭彬

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 217-217~221.

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观察Sim2基因对PC12细胞周期及细胞周期调控蛋白表达水平影响，初步阐明Sim2基因在Down综合征发病机制中的作用.以脂质体法将pcDNA3-mSim2真核表达载体瞬时转染PC12细胞；以RT-PCR方法检测mSim2基因在PC12细胞的表达；流式细胞仪观察细胞周期分布的变化；RT-PCR和免疫组织化学方法分别检测细胞周期调节蛋白Ｅ（cyclin E）和p27 mRNA和蛋白水平的表达变化.RT-PCR结果显示，瞬时转染pcDNA3-mSim2的PC12细胞中有明显的mSim2 mRNA表达；流式细胞仪检测发现，与对照组和空载体组相比，转染mSim2后，处于G₀/G₁期的PC12细胞百分比明显升高（Ｐ<0.01），而G₂/M期的细胞百分比明显降低 (Ｐ<0.01)；在mRNA和蛋白水平上，转染mSim2的细胞细胞周期蛋白E表达较对照组明显降低；而p27的表达明显升高(Ｐ<0.01).以上结果表明，mSim2基因可能通过影响神经元前体细胞的增殖在Down综合征发病机制中发挥了重要作用.

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新城疫病毒HN基因诱导人肺癌细胞SPC-A1凋亡的作用机制

连海,;金宁一;李霄;陈立刚;张静敏;管国芳;孙丽丽;李雪梅;郑洪玲;崔英姬

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 222-222~227.

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为了探索新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(HN)基因对人肺癌细胞SPC-A1的作用及机制，将含有HN基因的重组质粒pVHN经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1，通过MTT方法检测细胞活力；采用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色分析肿瘤细胞凋亡；罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位（ΔΨm）和活性氧水平变化；流式细胞仪分析MHCⅠ分子表达；底物染色反应检测caspase-3活性结果重组质粒pVHN转染人肺癌细胞SPCA1 48 h后，细胞活力明显降低； AO/EB染色可见明显的细胞凋亡形态学变化；与空质粒对照相比，线粒体ΔΨm下降(Ｐ<0.01)，活性氧水平升高(Ｐ<0.05)；细胞表面MHC-Ⅰ分子表达上调(P>0.05)；caspase-3活性增强(Ｐ<0.01). 以上结果提示，新城疫病毒HN基因能够上调SPC-A1细胞表面MHC-Ⅰ分子表达，并通过上调ROS水平，下调线粒体ΔΨm，进而激活caspase-3，最终诱导人肺癌细胞凋亡.

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利用人U6 snRNA启动子构建RNA干扰质粒载体

楚莉辉;刘龙丁;马绍辉;王丽春;李琦涵

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 228-228~233.

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RNA干扰技术已经成为基因功能研究等领域的有力工具，构建带有筛选标记的siRNA载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达.为了利用RNAi技术开展生物学研究，在克隆载体pUC19的基础上改造构建了人类细胞小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）表达质粒pUC19NU.该质粒具有新霉素抗性标记和真核细胞复制起点，利用连入的人U6 snRNA启动子起始siRNA的转录.以EGFP 和p53为靶基因的干扰实验证明，所构建的siRNA表达质粒可以显著抑制细胞外源性增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）及细胞内源性p53蛋白的表达，而且抑制效果具有特异性.

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酸提高绿茶提取物对脂肪酸合酶的抑制活性

肖文平;张睿;孙颖慧;田维熙

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 234-234~238.

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脂肪酸合酶和肥胖、癌症等人类重大疾病相关.获取高活性脂肪酸合酶抑制剂有重要应用价值.50％乙醇的绿茶提取物具有抑制脂肪酸合酶和经口服降低大、小鼠体重的功能.该提取物在酸的作用下可明显地提高其抑制脂肪酸合酶的能力.采用1 mol/L硫酸或盐酸在100℃下处理绿茶提取物，发现该提取物对脂肪酸合酶的抑制活性随时间逐步提高.在25℃至120℃温度下，提高处理温度使抑制活性提高的速度加快和程度加大. 用1 mol/L盐酸120℃处理35 min或3 mol/L盐酸100℃处理30 min可使绿茶提取物抑制脂肪酸合酶的半抑制浓度下降20倍左右，达到1 μg/ml以下.用pKa值4.76至1.27的1 mol/L浓度的4种有机酸在100℃作用150 min使绿茶提取物抑制活性分别提高到1.48至5.84倍.提高酸的浓度也使被作用的提取物的抑制活性提高的更多.表现抑制活性提高的速度及程度和氢离子浓度正相关.判断绿茶提取物在酸作用下抑制活性的提高来源于其中所含儿茶素在氢离子作用下发生了化学变化.初步实验表明其变化过程比较复杂，确定其分子机制还需进一步的研究工作.

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不同上样方式对蛋白质组双向电泳图谱质量的影响比较

丁勤学;刘进;胡潇华;李申;赵和平;黄凌云;何大澄

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 239-242.

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蛋白质组技术难点之一是如何获取尽可能多的细胞或组织的蛋白信息.双向电泳蛋白斑点数目直接反映了实验蛋白质组信息的完整性.除样品制备外,蛋白上样方式对双向电泳图谱的质量和完整性有直接的影响.实验论文从以下3个方面考察不同的蛋白上样方式对双向电泳图谱的影响;即：水化上样与杯上样；一次上样与重复上样；以及酸性端加样与碱性端上样.实验结果发现;蛋白上样量较大时,杯上样方式的图谱斑点数目较水化上样方式明显增多；样品蛋白浓度较高时,稀释多次上样明显优于一次性浓缩蛋白上样；蛋白裂解液(MCF7乳腺癌细胞)在酸性端加样对偏碱性蛋白的分离未发现明显优势.相反,在等电聚焦伏小时(Vh) 足够的前提下,碱性端加样对偏碱性端蛋白反而有利,表现为斑点数目较多,而且等电点方向拖尾减轻.实验结果对提高双向电泳的质量以及相关蛋白质组信息的完整性提供了有益的技术参考.

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一种改良的启动子序列克隆的染色体步查法

吴蔼民;刘进元

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 243-246.

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利用染色体步行法，从已知DNA序列克隆侧翼未知序列是非常有效的方法之一，但由于所选用的特定限制性内切酶对目标基因组不能酶解成合适大小的片段，因而受PCR扩增能力的局限,往往扩增不出有效产物. 针对这一点，这里我们介绍一种简单有效的改良方法，它包括以下步骤：首先用不同的限制性内切酶(包括平末端和粘性末端) 酶解目标基因组DNA，接着，选择能将基因组酶切成弥散、分布均匀的限制性内切酶，如DraⅠ和HindⅢ，合成相对应的接头；然后，选择弥散的、分布均匀的限制性内切酶的酶解产物，构建成含相应接头的基因组DNA文库，用作PCR的模板；最后，用接头引物和特异引物，通过巢式PCR扩增目的片段，获得了理想的扩增效果.采用改进后的染色体步查法，有效地从较复杂的棉花核DNA中克隆出6个棉花启动子序列.

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通过生物素化标记分析细胞膜亚蛋白质组

廖翔;朱旭东;党颖;李涛;周晓巍;黄培堂

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 247-251.

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细胞膜在许多基本生物学作用过程中扮演着重要角色，比如细胞-细胞相互作用、信号转导和物质运输.分析不同生理或病理状态细胞的膜蛋白的表达变化，有助于了解这些生物学过程以及发现新的诊断、治疗靶位.成功地进行膜蛋白分析最重要的是获得足够浓度与纯度的膜蛋白.这里报告一种分离高纯度膜蛋白的方法，主要包括三个步骤：（1）生物素化活细胞表面的膜蛋白，（2）链亲和素琼脂糖亲和吸附，（3）强烈的清洗条件去除非特异吸附的胞质蛋白.最后用化学方法洗脱生物素标记的膜蛋白进行双向电泳分离分析.用该方法制备了HeLa细胞的膜蛋白.免疫印迹结果表明，生物素标记的膜蛋白基本上都是低丰度蛋白. 这样制备得到的膜蛋白双向电泳分离出2 400多个蛋白质点，而且大多数点的亮度相近，分布得相对分散没有聚集成群.这种图谱非常便于比较分析找到差异蛋白.多次重复制备膜蛋白、电泳表明该方法的重复性和稳定性很好.

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改良手工显微切割法获取特定细胞提取高质量RNA

周广彪;胡盛平;刘静文;张可浩;官兵;吴名耀;沈忠英;杨捷生

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 252-252~257.

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探讨显微切割过程中有效保持RNA完整性的组织固定方法，建立一种简易的手工显微切割法.应用自制“T形板”辅助冰冻切片，100％无水乙醇一次性脱水固定，“排除切割法”获取目的细胞，用TRIzol提取RNA，琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR分析RNA质量.“一步法”固定可长时间保存RNA的完整性；从食管癌标本5个特定阶段的细胞中提取的RNA，经电泳和RT-PCR分析均具有较高的质量.无水乙醇“一步法”固定，在显微切割的过程中可有效保持RNA的完整性；T形板和“排除切割法”简化了手工显微切割的操作，提取的RNA质、量均可满足后续分子水平研究的需要.

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淀粉样前体蛋白的原核表达、纯化及抗血清的制备和应用

石琦;韩俊;高晨;李锋;张宝云;周玉玲;董小平

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 258-258~261.

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提取SH-SY5Y细胞的总RNA并合成单链cDNA，用PCR方法扩增出APP基因羧基端片段.测序后克隆至表达载体，在大肠杆菌M15中分别表达APP-C100和GST-APP-C100融合蛋白，纯化的GST-APP-C100分子量约为38 kD，APP-C100约为18 kD，此外在APP-C100纯化产物中还存在有超过97 kD 的聚合物.体外蛋白酶消化实验显示纯化的GST-APP-C100和APP-C100单体对蛋白酶K消化敏感，而APP-C100聚合物具有抵抗蛋白酶消化能力.以GST-APP- C100免疫实验用兔后得到的APP抗血清经Western 印迹鉴定可特异性识别重组及细胞内源性APP.

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谈国家自然科学基金项目选题及如何写好申请书

江虎军

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(03): 262-266.

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