中国生物化学与分子生物学报

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张垣,张晓东,叶丽虹

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 519-523.

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端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的重复序列，对维持染色体的稳定性具有重要作用 .端粒酶（telomerase）是维持端粒长度必需的一种逆转录酶，在细胞增殖、衰老、永生化和癌变等方面具有重要的作用.在肿瘤细胞中端粒酶发生明显变化，有较高水平的表达和很强的活性，成为肿瘤细胞的重要特征之一.乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）X蛋白（HBx ）与肝癌的发生密切相关，HBx可以通过多种途径发挥致癌作用，其中一个重要的分子机制，即激活人端粒酶反转录酶hTERT（为端粒酶的催化亚单位）使细胞发生永生化而癌变.因此，详细阐明HBx与hTERT的关系对于揭示乙肝病毒致癌机制具有重要的意义.本文对HBV的分子结构和HBx的分子生物学特性进行了详细的阐述，对HBx与hTERT及其调控因子的关系进行了归纳和总结，有助于进一步阐明HBx的致癌机制.

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人HMGB1酸性尾端对其抗菌活性的影响

龚薇,何凤田,李蓉芬,高会广,张艳,黎松,黄刚

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 524-529.

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为研究人高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box-1HMGB1)酸性尾端对其抗菌活性的影响，提取人外周血单个核细胞总RNA，经RT\|PCR扩增得到编码人HMGB1的cDNA及其缺失酸性尾端的突变体cDNA(mcDNA)，原核表达载体pQE\|80L分别表达重组人HMGB1蛋白(rhHMGB1)及缺失酸性尾端的突变体蛋白(mrhHMGB1)，经Ni^2+_-NTA亲和层析柱纯化两种蛋白.通过试管稀释法、琼脂扩散法两种体外抗菌实验观察，并比较rhHMGB1mrhHMGB1抗菌活性的差异.实验结果显示，rhHMGB1对大肠杆菌JM109、ATCC2592 2、DH5α有明确的抗菌活性，其抗菌活性强弱依次为JM109>ATCC25922>DH5α，而mrhHMGB1 对大肠杆菌JM109、ATCC25922、DH5α则均无抗菌活性.实验结果表明，人HMGB1的酸性尾端对其抗菌活性的发挥至关重要，此研究为进一步探讨人HMGB1抗菌功能的机制奠定了基础.

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人DJ-1蛋白在NIH3T3细胞中的表达与定位

唐靖,刘靖华,蓝兴国,李志杰,刘亚伟,赵明哲,邓鹏,姜勇

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 530-534.

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采用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）示踪的方法，研究人DJ-1蛋白在真核细胞中的定位及其对刺激的反应. 将克隆在pGEX-KG上的DJ-1亚克隆到载体pEGFP-C2上，对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定，用脂质体转染NIH3T3细胞；并用荧光显微镜观察 pEGFP-DJ-1在细胞内的定位以及在血清刺激时的移位；探讨在氧化应激时DJ-1对细胞的保护作用，以及其在细胞内定位的变化. 重组质粒在NIH3T3细胞中得到高效表达，绿色荧光弥散分布于胞质、胞核中，但以胞质居多；血清刺激后，细胞中的绿色荧光从胞质移位到胞核；在200～600 μmol/L H₂O₂刺激下，DJ-1能有效保护细胞抵抗氧化应激，并且也能从胞质移位到胞核.上述研究结果为进一步研究DJ-1蛋白的功能提供了一个重要依据.

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TAT-凋亡素融合蛋白的表达及其抗肿瘤活性

陶站华,刘兴汉,张宇雯,马洪星,刘远莉,栗亚,李丹

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 535-541.

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凋亡素(apoptin)由鸡贫血病毒vp3基因编码，能特异地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有毒性,为了获得可转导入细胞内部的凋亡素，将人工合成的编码TAT蛋白转导结构域的DNA片段与凋亡素编码基因克隆入质粒pET-28a内，构建出表达融合蛋白TAT-apoptin的原核表达载体pET-28a-TAT-apoptin.在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达融合蛋白，利用IDA-Ni2+ 亲和柱纯化，葡聚糖凝胶G 25除去尿素后得到可溶的变性蛋白.纯化后的TATapoptin加入体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人肺癌Anip973细胞，对照组加入TAT-麦芽糖结合蛋白（TAT-MBP）. 经免疫组化检测，转导1 h后TAT-MBP分布于以上两种细胞的胞浆和胞核，TAT-apoptin则主要分布于2种细胞的胞浆内，转导24 h后TAT-MBP的亚细胞定位没有变化，TAT-apoptin分别定位于HUVECs的胞浆和Anip973的胞核中.脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）显示转导48 h后，TAT-MBP处理过的 HUVECs和Anip973细胞、TAT-apoptin处理过的HUVECs没有明显改变，而TAT-apoptin处理过的Anip973细胞大量凋亡.以上结果表明TATapoptin融合蛋白在肿瘤治疗上有潜在的应用价值.

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人Lrp蛋白在细胞中的定位及LPS对其表达的影响

宋庆贺,于欣平,陈苏民,陈南春,代忠明,侯立朝

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 542-546.

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为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究，用镍离子螯合柱(Ni-NT)纯化后的全长Lrp蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.Western 印迹表明，吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合，并有较高免疫印迹滴度，为Lrp功能研究提供了重要的工具.激光共聚焦扫描荧光显微镜检测显示Lrp主要位于细胞核膜周围.Western印迹、RT-PCR以及细胞免疫组化染色结果都表明，用LPS刺激后，lrp在人HEK293 和U937细胞内的表达均有明显的上升.结果提示,Lrp可能与对Lrp介导的反应有关.

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蜡梅Chimonanthus praecox (L.) Link COR413蛋白基因(Cpcor413pm1)的分子特性与表达分析

秦华,眭顺照,李名扬,雷兴华,余国武

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 547-552.

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为研究蜡梅冬季开花过程的抗寒分子机理，在构建蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上，通过随机克隆测序，克隆了1个蜡梅COR413蛋白的cDNA基因，命名为Cpcor413pm1.Cpcor413pm1 cDNA长946　bp，推测的编码蛋白CpCOR413PM1包含201个氨基酸.CpCOR413PM1蛋白N端保守性差，没有信号肽，具有5个保守的跨膜区，1个潜在的GPI锚点，具有可能对蛋白结构或活性十分重要的位置保守的7个Pro、1个Cys, 1个被富Gly区一分为二的α螺旋区域，以及Tyr、Thr、Ser磷酸化位点各1个.序列比较分析表明，Cpcor413pm1是首次从蜡梅中克隆到的COR413蛋白基因.RT-PCR分析表明，该基因在蜡梅的萌动期、蕾期、露瓣期、初开期、盛开期、衰老期均有表达,但在初开期和盛开期表达丰度更高，推测Cpcor413pm1与蜡梅花的抗冻性有密切关系.

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Hsp70蛋白自身磷酸化对其分子伴侣功能的影响

吕元明,陶蕾,张利能

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 553-558.

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近年对分子伴侣蛋白Hsp70作用机制的研究发现，其ATP功能区域X光晶体结构有一个新的钙离子结合区域，这个新的功能区域与Hsp70分子的ADP结合、ATP水解及合成有关.有报道认为Hsp70蛋白的NDP激酶样作用，通过形成酸不稳定性自身磷酸化中间体催化γ磷酸基团在ATP和ADP间传递，组氨酸H89与这个新的区域有密切关系，有可能与Hsp70蛋白形成自身磷酸化中间体有关.本研究运用基因定位诱导突变技术，将89位组氨酸以丝氨酸替代(H89S)，通过比较Hsp70野生型及突变型蛋白的自身磷酸化过程的改变，及其对Hsp70蛋白体外荧光素酶活性影响的不同，初步探讨Hsp70作用机制.结果发现，突变的H89S蛋白自身磷酸化过程及体外变性荧光素酶重折叠受到抑制.野生型蛋白未受到影响，野生型Hsp70可以形成酸不稳定的自身磷酸化中间体，产生CDP依赖性解磷酸反应，而H89S突变型蛋白不能形成这种反应.89位组氨酸点突变能显著降低ATP酶交换反应及体外变性荧光素酶重折叠水平，但它的自身磷酸化可能并非唯一必需的介导位点或只是一个选择性的功能侧链.

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过表达PKCε和PKCη在HCC1806细胞中的抗凋亡作用

苏湘鄂

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 559-564.

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为探讨PKCε、PKCη对乳腺癌细胞中TNFα诱导凋亡的影响，采用PCR技术，从人肌肉cDNA文库中克隆了全长PKCε和PKCη序列，亚克隆至pcDNA3，转化HCC1806细胞，并选择出稳定的转化细胞株.然后用流式细胞仪检测了PKCε、PKCη过表达对DNA断裂的影响，用Western印迹方法检测了PKCε、PKCη过表达对PARP、caspase 3和caspase 8水解的影响，以及对Bcl-2，Bax表达的影响，和对MAPK磷酸化的影响.流式细胞仪分析DNA含量的结果表明：TNFα处理后，HCC1806/PC、HCC1806/ε、HCC1806/η的sub_G1状态的DNA含量分别为：57.7%、23.3%、14.6%.Western印迹结果表明，当用0.01nmol/L TNFα处理，HCC1806/η中PARP、caspase3、caspase8的水解程度最低，HCC1806/ε中次之，HCC1806/PC最严重；与HCC1806/PC比较，无论用不用TNFα处理，HCC1806/ε都表达更高的Bcl_2，而HCC1806/η不影响Bcl_2的表达.过表达PKCη而不是PKCε抑制了由TNFα引起的p38和JNK的磷酸化，并且是JNK的抑制剂SP600125而不是p38的抑制剂SB220025抑制了PARP的裂解.以上结果显示，过表达PKCε、PKCη可能通过不同的信号途径在HCC1806中起抗凋亡作用，PKCε上调了bcl_2的表达，而PKCη抑制了JNK的磷酸化.

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过表达外源性CCN1对人骨肉瘤细胞系143B生长和迁移的影响

司维柯,何通川

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 565-570.

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采用AdEasy系统构建带有标记基因GFP和FC的重组腺病毒AdCCN1，并感染人骨肉瘤细胞，观察外源性CCN1对肿瘤细胞生长和迁移的影响.PCR扩增FC编码序列标记的人CCN1克隆到pAdTrack-TO4中获得重组穿梭载体pAdTrack-CCN1. PmeⅠ线性化该质粒并电转到有腺病毒骨架质粒的BJ/AdEasy1菌中，同源重组获得腺病毒质粒pAd-CCN1，PacⅠ线性化并转染293细胞，包装制备AdCCN1.卡那霉素抗性筛选、XbaⅠ与KpnⅠ酶切鉴定，荧光显微镜和Western印迹检测标记基因GFP和FC表达，鉴定获得的复制缺陷型重组腺病毒AdCCN1.AdCCN1与AdGFP分别感染人骨肉瘤细胞143B，通过MTT实验、胶原集落形成实验、划痕愈合和室移动实验，观察CCN1对143B增殖和迁移的影响.酶切鉴定表明，带有FC标记的CCN1被成功克隆到穿梭载体pAdTrack中.卡那霉素抗性筛选并酶切鉴定，获得重组腺病毒质粒pAd-CCN1.Western 印迹和荧光显微镜观察,确定与CCN1共表达的FC和GFP表达.AdCCN1感染骨肉瘤细胞, 与对照比较细胞数量增多，集落形成增加，细胞划痕逐渐愈合，迁移至膜上的细胞数量明显增加.应用AdEasy系统高效快速构建了带有标记GFP和FC的重组腺病毒AdCCN1，为监控腺病毒转基因的效果提供了便捷的工具.AdCCN1感染骨肉瘤细胞后可促进细胞增殖和迁移，提示CCN1在肿瘤发生和转移中可能起到重要作用.

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细胞衰老过程中JNK、p38和Akt的活性变化

邹平,何涛,陈颢,周艳艳,王羽,毛泽斌

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 571-574.

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研究发现衰老成纤维细胞抗凋亡. 为探明其机制，检测与凋亡相关的信号传导通路JNK、p38和Akt在细胞衰老过程中是否发生改变.在本研究中,UV被用作JNK和p38传导通路的诱导剂,胎牛血清用作Akt通路的诱导剂.结果表明: p38和Akt在年轻和衰老细胞中均能被相应的诱导剂活化;相反, UV照射却不能有效激活衰老细胞中JNK的活性.结果提示:衰老细胞对凋亡诱导不敏感可能与JNK不能被有效活化有关.

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MAT2A基因小干扰RNA诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制

刘权焰,刘志苏,邬开朗,朱应,何跃明,吴建国

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 575-583.

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为探讨甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)小干扰RNA对人肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响及其机制,采用脂质体转染法将MAT2A小干扰RNA质粒表达载体转染人肝癌细胞系Bel7402细胞、HepG 2细胞和 HepG3B细胞.半定量RTPCR检测MAT2A mRNA表达，Western印迹检测MAT2A 蛋白质表达， M TT法观察MAT2A小干扰RNA对肝癌细胞生长的影响，流式细胞仪及DAPI染色检测siRNA对肝癌细胞凋亡的影响.为探讨其作用机制, 进一步检测转染后肝癌细胞MAT的活性、MAT1A mRNA表达及SAM、SAH含量.结果发现, MAT2A小干扰RNA特异性抑制人肝癌细胞MAT2A mRNA和蛋白质的表达，刺激MAT表达由MAT2A向MAT1A转变, 降低了肝癌细胞中MATⅡ活性（P<005），从而诱导肝癌细胞凋亡; MAT2A小干扰RNA诱导Bel－7402细胞、HepG 2细胞、 Hep 3B细胞凋亡指数分别为19．3%±2．8%、22．8%±3．5%、21．8%±4．2%, 较对照组siRNA(凋亡指数为5 2%±19%)具有明显差异(P<005).DAPI染色显示, MAT2A小干扰RNA转染组可见多个细胞核浓缩、碎裂成蓝色的小块状,染色质凝聚,形成典型的凋亡小体, 而对照siRNA转染组未发现典型的凋亡小体.肝癌细胞的生长也受到抑制，MAT2A小干扰RNA转染Bel7402细胞、HepG 2细胞、HepG3B细胞72 h后，细胞生长抑制率达高峰,分别为39．62%、41．27%、38．84%.肝癌细胞中SAM含量明显升高(P<001),而SAH含量改变不明显, SAM/SAH变化伴随SAM含量变化而改变.提示靶向MAT2A基因的siRNA通过升高肝癌细胞中SAM含量,刺激MAT表达由MAT2A向MAT1A转变, 从而诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞生长.

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八氯腺苷诱导SH-SY5Y和SK-N-SH细胞G₂/M期阻滞的分子机制不同

朱玄,安国顺,李淑艳,潘颖,倪菊华,贾弘禔,

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 584-590.

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为探索八氯腺苷的抗肿瘤作用机制，以神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-SH细胞为对象，采用四唑盐比色实验（MTT法）证明，八氯腺苷具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用，这种抑制作用呈剂量-时间依赖性.流式细胞分析显示，10 μmol/L八氯腺苷作用48 h后可导致靶细胞生长停滞于G ^₂/M期；SH-SY5Y细胞发生明显细胞凋亡,但SK-N-SH细胞却未见凋亡.Hoechst 33342染色显示，SK-N-SH细胞发生了核分裂异常.蛋白质免疫印迹分析证明，10 μmol/L 八氯腺苷处理SHSY5Y 48～72 h后，G^₂检验点调节蛋白ATM、Chk1、Cdc25C和Cdc2磷酸化形式明显上调，同时伴有caspase-3的激活，提示SH-SY5Y细胞发生了G^₂检验点通路和细胞凋亡途径的激活.与SH-SY5Y细胞不同，在SK-N-SH细胞中，八氯腺苷处理24～96 h时，磷酸化ATM、磷酸化Chk1/Chk2、磷酸化Cdc25C以及磷酸化Cdc2的水平呈现逐渐降低的趋势.结果提示，SK-N-SH细胞在八氯腺苷处理后发生了G^₂检验点失败.蛋白质免疫印迹分析还显示，八氯腺苷可诱导p53在SH-SY5Y细胞的表达，但却不能影响SK—N-SH细胞的p53组成性表达水平.p21在SK-N-SH的组成性表达随八氯腺苷处理时间延长而逐渐减少，但在处理前后的SH-SY5Y细胞均未检测到p21蛋白的表达.上述实验结果提示，八氯腺苷抑制两种细胞增殖的机制不同：在SH-SY5Y细胞，八氯腺苷可激活ATM-Chk-Cdc25C-Cdc2/cyclin途径和凋亡通路，使细胞发生G_²/M期阻滞和细胞凋亡；在SK-N-SH细胞，八氯腺苷诱导G^₂检验点失败，导致细胞阻滞在有丝分裂期，并发生有丝分裂异常.2种不同的细胞命运可能还与p53和p21表达不同有关.

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利用磺基异硫氰酸苯酯化学辅助方法鉴定磷酸化肽修饰位点

陈平,李水明,刘宇,刘中华,熊继先,孙亚兰,曹锐,梁宋平

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(07): 591-598.

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利用MALDI-OF质谱结合磺基异硫氰酸苯酯(SPITC)化学辅助的从头测序（de novo sequencing）方法,将用固相金属离子亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography,ＩＭＡＣ) 选择性地从混合物中亲和提取的磷酸肽进行磷酸化位点测定,该方法只有肽键断裂产生的带C端的碎片离子系列（y^＋离子系列）出现在质谱图中，图谱背景清晰,信噪比高,单纯的y^＋片段离子系列使得谱图解析变得非常容易,对于多磷酸化肽的磷酸化位点，不需借助于任何软件,只需简单地计算两峰之间的分子量之差即可确定.

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