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• 2020年, 36卷, 第8期
  刊出日期：2020-08-20

    

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特约综述
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  新发现，大用途——慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA检测的应用

  刘明琛，杨兴雯，鲁凤民

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 865-871. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.06.1124

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  乙型肝炎病毒（HBV）在世界范围内流行。每年60余万人死于HBV感染所致的肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌，极大地威胁着人类的生命健康，是一项世界范围内的公共卫生问题。核苷（酸）类和干扰素类药物是现今临床上应用最广泛的两类抗病毒药物，但它们都不能直接靶向肝细胞核内的共价闭合环状DNA（cccDNA），致使慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织内的cccDNA无法彻底清除而久治不愈，且停药后易复发使得患者不得不接受长期甚至终生的抗病毒治疗。cccDNA定量是临床评价治疗效果和预测停药终点的重要指标，但因需要肝组织穿刺活检，具有一定的局限性。血清HBV RNA作为cccDNA的转录产物，是反映cccDNA活性的理想血清学替代指标。对于这一新兴的病毒学指标，本文从其来源和本质与反映cccDNA活性的能力进行梳理，并围绕血清HBV RNA解读核苷（酸）类药物（NAs)对HBV复制的影响，以及病毒颗粒中核酸类型的变化，总结近年来慢性乙肝防治指南及专家共识对HBV RNA作为检测新指标的采纳情况，探讨其在CHB抗病毒治疗和新药研发过程中的指导意义。
综述
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  电压门控钙通道辅助亚基α2δ-1的结构和分子药理

  瞿芳，陈可之，陈金军

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 872-878. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.06.1074

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  电压门控钙通道（voltage-gated calcium channel, VGCC）辅助亚基α2δ-1在神经元兴奋传递中起促进作用，是加巴喷丁(gabapentin)和普瑞巴林(pregabalin)的作用靶点。α2δ-1由高度糖基化的α2亚基和δ亚基以4对二硫键相连，包含4个串联的Cache结构域和1个von Willebrand A结构域，但δ亚基的C-末端结构尚未完全解析。α2δ-1的结构和作用机制研究进展主要聚焦于以下3点：(1) α2δ-1的C-末端，传统观点认为含有跨膜基序（motif）。另一个观点认为是GPI锚定，尚缺乏直接的实验证明；(2) α2δ-1对电压门控钙离子通道的影响，包括直接的和非直接的调控对电压门控钙通道的膜上转运和电流的影响，以及α2δ-1的翻译后修饰对钙电流的影响；(3) α2δ-1不依赖于钙通道，而与其他蛋白质存在相互作用，互作效应表现在兴奋性电流增大或促进神经突触发生。在疾病研究方面，本文主要综述α2δ-1在慢性疼痛中的机制研究。α2δ-1参与的生理活动的分子机制复杂，现已突破传统的局限于电压门控钙通道辅助亚基的角色，并将有可能通过α2δ-1建立跨细胞膜的蛋白质-蛋白质相互作用网络的动态膜微区，以进一步评估其生理、病理和药理的相关性。
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  哺乳动物线粒体蛋白质翻译及其调控机制

  杨娜，余敏，熊伟

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 879-887. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.04.1103

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  线粒体是真核细胞内参与能量生成和物质代谢的重要细胞器。线粒体核糖体(mitochondrial ribosome, MR)作为细胞器中的翻译机器，用于表达线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA) 编码的基因。近年来，随着研究的不断深入，人们对参与哺乳动物线粒体蛋白质翻译的蛋白质因子及其翻译的基本过程有了越来越清晰的认识，这对阐明线粒体蛋白质翻译的调控机制及研究人类线粒体疾病等方面具有重要的意义。线粒体蛋白质的翻译过程分为起始、延伸、终止和回收四个阶段。本文综述哺乳动物线粒体核糖体的结构与功能，以及线粒体蛋白质翻译因子的性质与功能，并进一步探讨翻译激活因子、微小RNA、线粒体COX翻译调控组装中间体(mttranslation regulation assembly intermediate of COX, MITRAC)以及核糖体的翻译后修饰对线粒体蛋白质翻译的调控及其机制，展望其对人类线粒体相关疾病研究的应用前景。
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  肠道菌群在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的生物学机制

  简捷，朱萱

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 888-894. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.05.1061

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  肠道菌群是机体不可或缺的组成部分，也是维持机体内环境动态平衡的健康保证。当某些因素导致机体内外环境紊乱时，机体肠道菌群动态平衡被打破，导致机体肠道菌群紊乱，从而促进非酒精性脂肪性肝病（单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝纤维化以及肝硬化）的发生及发展。肠道菌群紊乱能够影响肠道胆汁酸代谢，胆碱及其代谢产物产生，短链脂肪酸形成，肠道内源性乙醇产生，肠道通透性增加及肠道蠕动改变等多种生物学机制的改变，导致非酒精性脂肪性肝病的发病及进程。
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  非编码RNA作为ceRNA在人癌症中的功能及机制

  麦尔哈巴·阿不都热依木，潘燕

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 895-902. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.06.1065

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  非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA），即无编码蛋白质潜力的RNA，包括短非编码RNA,例如微RNA（microRNA, miRNA），长非编码RNA（long coding RNA, lncRNA）和环状RNA（circular RNA, circRNA）等，已被证明可以在RNA水平上调节细胞中多种生理及病理过程。miRNA是约18～22个核苷酸大小的内源性非编码RNA分子，可以通过MRE与靶基因的3′非翻译区（untranslated region,UTR）中的互补序列结合，抑制蛋白质编码基因的表达，并导致mRNA转录物的更新、转换或降解。2011年，Salmena等提出，非编码RNA与具有编码蛋白质能力的RNA（mRNA）之间存在一种被称为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）的相互作用机制假说，即含有miRNA反应元件(MRE）的ncRNA通过与miRNA结合，解除miRNA对靶基因的抑制作用。这一假说对基因表达调控的传统认知进行了补充，在RNA水平上将多种ncRNA的作用补充到经典的miRNA调控mRNA翻译的过程，将其延伸为ceRNAmiRNAmRNA的网络调控模式。近年来研究发现，ceRNA机制广泛存在于胃癌、结肠癌和膀胱癌等各类癌症中，并且在肿瘤的基因调控及肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡、细胞周期等生物过程中发挥作用。本文将介绍ceRNA及其网络的机制与分子基础，并且结合两类非编码RNA——lncRNA及circRNA作为ceRNA分别在人类不同癌症类型中的近期研究进展作一综述，讨论该机制在肿瘤中的角色及作用，以期拓宽对肿瘤发生发展机制的视野，为癌症治疗提供新思路。
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  microRNA在精子发生中的作用

  唐玉莲，倪安妮，李根亮

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 903-908. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.06.1082

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  微RNA（microRNAs, miRNAs）是一类广泛存在于真核细胞内起调控作用的小非编码RNA，物种间保守性强。miRNAs通过靶向mRNA，介导mRNA降解或翻译抑制，在各种细胞中广泛参与包括蛋白质翻译调控在内的基因表达的转录后调控。精子发生是精原干细胞（SSCs）增殖分化为成熟精子的复杂过程，包括SSCs有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞变形分化三个主要阶段。精子生成很大程度上取决于转录后调控，miRNAs是这个事件的重要调控因子。目前已发现大量miRNAs在生精细胞中表达，其中许多还高度表达、特异性表达或优先表达，并对生精细胞的增殖、分化和发育发挥至关重要的作用。本文主要就miRNAs的发现和功能、精子发生过程、miRNAs调节精子发生的重要性以及精子发生三个不同发育阶段中miRNAs的具体调控作用进行简要综述，以期为探索雄性不育等疾病的预防和精准化治疗提供理论依据，并在此基础上展望了未来本领域可能的研究方向。
研究论文
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  RBM6通过GSK-3β/β-catenin调节途径对膀胱尿路上皮癌细胞发挥抗增殖和促进凋亡作用

  杨展，瞿长宝，张勇，王亚轩，黎玮，温进坤，刘凯隆

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 909-916. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.05.1119

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  RNA结合模体蛋白（RBM）家族几乎在所有细胞中均有表达，而且在进化上高度保守。以前的研究表明，RBM5在膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BUC）组织中表达下调，由此引起的细胞凋亡减少，进而促进肿瘤的进展。然而，RBM5氨基酸序列与其同源的RBM6在膀胱尿路上皮癌中的作用及相关机制尚不清楚。本研究检测RBM6在膀胱尿路上皮癌中的表达，探索其在膀胱癌细胞系中过表达对细胞增殖和凋亡的影响。利用qRT-PCR和Western印迹等技术，研究发现，RBM6在人膀胱尿路上皮癌组织和所检测的2个膀胱癌细胞系中表达均显著下调，并且其下调程度与患者的预后不良呈正相关。MTS检测细胞增殖的结果显示，RBM6过表达导致细胞增殖活性下降。细胞克隆形成实验结果也表明，RBM6过表达抑制细胞克隆形成能力（P<0.01）。原位末端转移酶标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL染色）检测细胞凋亡表明，在RBM6过表达的细胞中，TUNEL阳性细胞数由对照组的17.17±3.27增加到44.00±8.04（P<0.05）。RBM6抗增殖及促凋亡的作用机制研究发现，在T24细胞中过表达RBM6后，β-联蛋白（β-catenin）和G₁/S-特异性细胞周期蛋白-D1（G₁/S-specific cyclin-D1，cyclin D1）mRNA表达水平分别降低65%和79%，对应的蛋白质水平分别降低60%和73%；反之，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A/p21）mRNA表达水平升高约1.9 倍，对应蛋白质水平升高约1.8倍。重要的是，糖原合酶激酶3 beta（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3β）磷酸化水平升高约2.4倍。细胞过表达β-联蛋白促进细胞增殖（P<0.05），而利用小分子化合物LY294002促进GSK-3β磷酸化后，抑制细胞增殖（P<0.05）。综上所述，RBM6通过GSK-3β/β-catenin调节途径对膀胱尿路上皮癌细胞发挥抗增殖和促进凋亡作用。干预该调节途径可能是治疗膀胱尿路上皮癌的潜在靶点。
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  MiR-324-5p可能通过靶向淀粉样前体蛋白抑制棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡

  王杰，周小敏，杜天宁，刘捷明，史新娥

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 917-923. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.03.1526

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  miRNAs是一种非编码的小RNA，通过靶向mRNA的3′UTR调控基因的转录后翻译。为明确miR-324-5p对棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡的作用和机制，体外培养3T3-L1脂肪细胞，利用棕榈酸诱导细胞凋亡的同时过表达或抑制miR-324-5p，通过Annexin-V/FITC染色、RT-qPCR等方法检测miR-324-5p对3T3-L1脂肪细胞凋亡的作用。通过在线软件预测miR-324-5p的靶基因并进行验证。结果显示，过表达miR-324-5p能够显著抑制凋亡相关基因BCL-2相关X蛋白（BCL2-associated X protein, Bax）和胱天蛋白酶3（caspase3）的表达水平（P<0.05）；而抑制miR-324-5p后能够显著促进这些基因的表达（P<0.05）；靶基因预测及验证结果表明，miR-324-5p能够显著降低淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）的表达水平（P<0.05）。本研究认为，miR-324-5p可能通过靶定APP抑制棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡。
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  DKK4通过负调控Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

  王思思，何三秀，田绍蓉，彭溦雁，易发平

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 924-933. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.07.1336

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  Wnt信号通路在机体多种生理过程中均具有重要作用，已证明有多种蛋白质参与其调节，包括DKK（Dickkopf）家族成员。然而，DKK4在乳腺癌中的生物学功能和分子机制尚不清楚。本研究通过在线数据库TCGA(the cancer genome atlas)和UALCAN（ualcan.path.uab.edu/）分析发现，DKK4在乳腺癌中的表达与其甲基化程度负相关，并影响其肿瘤分期和患者生存率。MethHC数据库分析显示，DKK4在多数乳腺癌组织中的表达低于癌旁组织。RT-PCR检测发现，DKK4在8种人乳腺癌细胞株中不表达或低表达， 在2种人正常乳腺细胞中表达；qPCR分析发现，13对组织标本中有11对癌组织的表达低于癌旁组织（P<0.0001）。构建过表达DKK4的人乳腺癌细胞株MCF7和YCCB1，克隆形成的结果显示，MCF7和YCCB1稳定细胞株形成的细胞集落数量分别为对照组的28.66%和37.26%，增殖能力明显低于对照组细胞（P<0.001）；Transwell实验结果显示，细胞迁移能力减弱（590 vs. 2 052；1 310 vs. 5 137，P<0.001）；侵袭能力也明显减弱（220 vs. 872；2 532 vs. 5 089；P<0.001）。流式细胞仪分析发现，DKK4可将乳腺癌细胞周期阻滞于G₀/G₁期（（57.06 ± 0.64）% vs.（50.13 ± 1.08）%；（51.94 ± 0.93）% vs.（31.00 ± 1.03）%，P<0.001），细胞凋亡率明显增高（（31.55 ± 0.77）% vs.（9.85 ± 0.58）%；（28.19 ± 0.99）% vs.（17.92 ± 0.58）%，P<0.001）。进一步采用Western 印迹检测结果显示，DKK4能够使细胞周期调控蛋白P53、P27、P21和细胞凋亡因子胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶9表达上调。Western 印迹检测过表达DKK4对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果表明，细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）、C-Myc蛋白、环氧合酶2 (cyclooxygenase 2,Cox 2)、C-Jun蛋白、磷酸化应激活化蛋白激酶（p-JNK）和活化的β-联蛋白（active β-catenin）等的表达下调，而上皮型钙黏着蛋白（E-Cadherin）表达上调。综上所述，DKK4通过负调控Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，阻滞细胞周期，并促进其凋亡。
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  MiR-16-5p靶向TXNIP调控脂多糖诱导的心肌细胞的氧化应激和凋亡

  安玉成，仝识非，王端，张琴，苏海龙

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 934-944. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.05.1452

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  心肌细胞损伤与多种心血管疾病的发生发展有关，而氧化应激和细胞凋亡是造成心肌损伤的重要原因。硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）可调控细胞氧化还原状态，并诱导氧化应激的产生，最终可诱导炎症或细胞凋亡。miR-16-5p能抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症反应和A549细胞损伤。但TXNIP是否受miR-16-5p的调控还鲜有报道。本实验旨在研究miR-16-5p与TXNIP的关系，以及miR-16-5p是否通过结合TXNIP影响心肌细胞氧化应激和凋亡。通过TargetScan数据库预测到TXNIP与miR-16-5p存在结合位点。双荧光素酶报告结果验证miR-16-5p靶向调控TXNIP。转染miR-16-5p过表达载体和TXNIP抑制表达载体后，用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示，细胞凋亡率（10.44±1.13 vs 29.65±2.87, P<0.01）、（13.54±1.33 vs 29.14±2.76, P<0.01）均降低。采用丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒分别检测丙二醛含量和SOD、GSH-Px 活力。结果显示，miR-16-5p组丙二醛含量降低（13.58±1.55 vs 42.18±4.69, P<0.01），SOD活力（79.68±7.65 vs 34.87±3.49, P<0.01）、GSH-Px活力（687.99±35.42 vs 376.48±29.87, P<0.01）升高；si-TXNIP组丙二醛含量（18.69±1.84 vs 45.21±4.33, P<0.01）降低，SOD活力（71.65±7.32 vs 31.69±4.05, P<0.01）、GSH-Px活力（654.12±34.57 vs 367.43±33.54, P<0.01）升高。以上结果表明，过表达miR-16-5p或可抑制TXNIP表达，均可抑制脂多糖诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激反应。综上所述，miR-16-5p可通过抑制TXNIP表达抑制脂多糖诱导的心肌细胞损伤。
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  沉默HRH3减少伪足形成抑制结肠癌细胞迁移

  朱剑军，石丽洪

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 945-951. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.06.1059

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  组胺受体H3（histamine receptor H3, HRH3）的异常高表达与肝癌、胰腺癌、和肝内胆管癌的发生发展有关，但其在结肠癌中的作用尚不清楚。本文以结肠癌细胞系为细胞模型，探索HRH3对细胞迁移的影响。通过化学合成特异性靶向沉默HRH3基因的siRNA序列。实时荧光定量PCR和免疫印迹技术检测siRNA沉默效率。结果发现，沉默HRH3，结肠癌Ls174T和Lovo细胞侧向迁移能力分别降低62.50%和73.70%；Transwell小室实验结果显示，沉默HRH3，结肠癌Ls174T和Lovo细胞穿过Transwell小室膜的细胞数目分别降低62.49%和66.67%。鬼笔环肽染色细胞骨架显示，沉默HRH3，结肠癌Ls174T和Lovo细胞伪足数量显著减少。酶联免疫吸附检测细胞内蛋白激酶A活性发现，沉默HRH3，结肠癌Ls174T和Lovo细胞蛋白激酶A活性分别降低54.33%和63.67%。以上研究结果表明，HRH3可能通过调控PKA活性影响伪足形成在结肠癌细胞迁移过程中发挥关键作用。
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  shRNA沉默HuR抑制肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移及侵袭能力

  湛钊，周莉莉，高义沙，余畅，陈相屹，胡桐，孙达权

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 952-960. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.07.1544

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  人抗原R (human antigen R，HuR)基因在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达。推测HuR基因也参与肝癌的发展过程。为探索HuR对肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭的作用，本研究通过蛋白质印迹实验，检测HuR在肝细胞癌细胞系和正常肝细胞中蛋白质的表达水平。结果显示，肝细胞癌细胞系SMMC-7721 HuR的表达量显著高于正常肝细胞HL-7702。合成特异性靶向HuR基因的shRNA，转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721，检测结果发现，HuR基因表达量下调90%。沉默HuR，实时细胞分析技术(real time cell analysis，RTCA)结果显示，细胞增殖能力降低55％，侵袭能力下降75％；细胞划痕实验结果显示，迁移能力下降80％；克隆形成实验中细胞克隆数减少85％；此外，在HuR敲低稳转肝细胞癌细胞系SMMC-7721细胞中过表达Bcl-2，其细胞学现象部分获得逆转。激光共聚焦扫描系统检测结果显示，Bcl-2主要定位于肝细胞癌细胞系SMMC-7721的核膜及胞质。蛋白质印迹法检测结果显示，沉默HuR，Bcl-2下调92％，Survivin下调55％，Twinst1下调69％，N-钙黏着蛋白(N-cadherin)下调48％，E-钙黏着蛋白(E-cadherin)上调1.5倍。以上结果表明，HuR可能通过调控定位于核膜及胞质上的Bcl-2来参与肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移、侵袭及克隆形成过程，HuR基因有望成为临床上治疗肝癌的一个新的潜在靶点。
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  MiR-186-5p对绵羊黑色素细胞黑色素生成的调控

  许冬梅，唐中伟，朱芷葳，李鹏飞，董常生，赵宇军

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 961-969. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.06.1057

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  黑色素合成是极其复杂的过程，其中涉及多种基因和miRNAs的参与。miR-186-5p在绵羊不同毛色皮肤中差异表达，说明其可能与毛色形成有关，生物信息学预测和绵羊不同毛色皮肤中miR-186-5p和Mitf的差异表达间接说明二者可能存在靶向关系，双荧光报告直接证实了二者的靶向关系。为了证实miR-186-5p在黑色素形成中的作用，本研究构建miR-186-5p真核表达载体，并转染绵羊黑素细胞。结果显示，miR-186-5p通过与Mitf mRNAs的3′ UTR结合抑制Mitf的表达和翻译。MITF是Tyr基因家族的调节因子。实时荧光聚合酶链反应 (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和Western免疫印迹结果表明，过表达miR-186-5p引起的MITF下调抑制了TYR、TYRP1和TYRP2 的表达。其中，mRNA表达水平分别下降34%、66%和52%；蛋白质表达水平分别下降32%、6%和46%。分光光度检测结果显示，黑色素含量下降59%。上述结果表明，miR-186-5p通过抑制靶基因Mitf的表达，抑制了绵羊黑素细胞内黑色素的生成。
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  高三尖杉酯碱通过下调IRS4蛋白质的表达抑制黑色素瘤维罗非尼耐药细胞周期和增殖

  黄世莹，曾娣，张滔，唐加峰，杜玉梅，连瑞，李静，陈地龙

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 970-976. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.05.1078

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  黑色素瘤是一种死亡率极高的恶性肿瘤。近年来，其发病率逐年上升且耐药问题日渐突出。因此，如何克服耐药提高治疗效果是目前急需解决的问题。本文对高三尖杉酯碱对黑色素瘤维罗非尼耐药细胞A375R的作用及其机制进行初步探究。采用CCK-8法检测发现，维罗非尼对黑色素瘤细胞A375和A375R的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.94 μmol/L和49.09 μmol/L，其耐药倍数为52.22倍，证明A375R具有耐药性，可进行后续实验；高三尖杉酯碱作用于A375R细胞24、48、72 h后的IC50分别为18.57 ng/mL、9.88 ng/mL、9.23 ng/mL，说明高三尖杉酯碱能有效抑制A375R细胞的增殖，且呈时间和浓度依赖性。克隆形成实验显示与对照组相比，给予高三尖杉酯碱5、10、20 ng/mL，作用24 h，克隆形成率分别为52.18%、29.72%、2.36%，表明高三尖杉酯碱能有效抑制A375R细胞的克隆形成。流式细胞术检测显示，G₀/G₁期细胞由正常对照组的38.94%增加至55.05%，细胞阻滞在G₀/G₁期。蛋白质印迹结果显示，与A375细胞相比，A375R细胞中胰岛素受体底物4(IRS4)、p-Akt蛋白质表达水平上调，使用高三尖杉酯碱能下调A375R中IRS4、p-Akt、细胞周期蛋白E1、CDK2蛋白质的表达水平。以上结果表明，高三尖杉酯碱可能通过下调IRS4蛋白表达抑制PI3K/Akt通路的激活，使细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制黑色素瘤耐药细胞的增殖。
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  CRISPR/Cas9介导的水稻OsRhoGAP2基因的敲除

  安文静，王凯婕，刘亚菲，刘迪，冯连杰，王高华，黄俊骏，刘肖飞，王俊杰，梁卫红

  中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(8): 977-986. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.06.1053

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  OsRhoGAP2是通过酵母双杂交从水稻幼穗组织分离的一种Rho GTP酶激活蛋白质编码基因，其功能尚不明确。为鉴定该基因的功能，本研究采用CRISPR/Cas9技术构建了OsRhoGAP2基因单靶标敲除载体，并转化日本晴水稻。对转基因水稻的筛选以及编辑靶点扩增和测序结果表明，在T0代获得3种杂合突变体，在T1代获得2种纯合突变体，命名为株系1和株系16。2个纯合敲除株系在OsRhoGAP2编辑靶点分别缺失2个和1个碱基，均导致该基因的移码突变并最终造成无义突变。序列分析显示，突变体中预期生成的OsRhoGAP2截短蛋白质丧失了保守的RhoGAP结构域及CRIB基序。抽穗期水稻的叶片扫描电镜观察结果显示，株系1的叶片表皮毛大量缺失；对抽穗期水稻的剑叶进行光合指标测量，发现突变体与野生型在净光合速率与气孔导度上存在显著差异。其中，株系1和株系16的净光合速率分别上升17.79%和7.70%，气孔导度分别上升113.10%和64.50%，提示OsRhoGAP2基因的功能可能涉及这些生物学过程。