中国生物化学与分子生物学报

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人类疾病研究的新焦点：中性肽链内切酶（NEP）——NEP生理功能及其潜在调控因子研究之进展

洪玥，AntonyJ.TURNER

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 85-92.

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Neprilysin（ NEP）是M13锌金属蛋白酶家族的一种Ⅱ型整合细胞膜糖蛋白.自从1974年首次被定义以来，NEP作为一种神经肽的降解酶，已经被发现广泛地存在于中枢神经系统以及外周各种组织中，并具有众多组织特异性功能.其中, NEP具有两大重要生理功能：一是NEP通过抑制细胞迁移增殖并诱导细胞程序性死亡具有抗肿瘤作用，这依赖它的酶学特性以及与涉及细胞信号转导通路的关键分子直接的蛋白-蛋白间相互作用；另外, NEP具有神经保护作用，这主要通过阻止神经毒物——淀粉样蛋白Aβ在大脑中的聚集来实现.通过研究各种人类疾病的进展，目前发现这些疾病经常伴随有NEP表达的削弱和活性下降.基于这些发现，调控NEP在病理细胞中的不同水平正在逐渐被认可为具有治疗应用前景的一种策略，从而达到恢复正常的细胞功能并缓解病症的目的.现阶段的研究重点,主要在于揭示涉及NEP的表达以及活性的一些调控机制，并且获得了大量鼓舞人心的研究成果.例如，男性荷尔蒙已知是前列腺中NEP的转录调节因子.除它之外，最新研究结果还发现,女性雌激素，柳栎的水合萃取物，绿茶的一些组分，各种神经肽比如韩蛙皮素和生长激素抑制素以及淀粉样前体蛋白的胞内区，也都对NEP的表达和活性有刺激作用.

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翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略

刘金凤,王京兰,钱小红,蔡耘

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 93-100.

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蛋白质组学早期研究的绝大部分工作是在关注细胞不同生长时期或是疾病、分裂素刺激下的蛋白质表达水平变化.然而，许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相对丰度控制，更重要的是被那些时空特异分布的可逆翻译后修饰控制的，揭示翻译后修饰发生规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提.由于翻译后修饰蛋白质在样本中含量低且动态范围广，其相关研究极具挑战性，亲和富集、多维分离等技术与生物质谱的结合为翻译后修饰蛋白质组学的发展提供了契机，目前，已进行规模化研究的蛋白质翻译后修饰主要有四大类，其中磷酸化和糖基化研究较多.本文针对大规模翻译后的修饰蛋白质的分析策略和技术路线,如蛋白质的磷酸化修饰, 糖基化修饰, 泛素化修饰,基于蛋白质氧化还原状态进行的氧化还原修饰和其它修饰像乙酰化、甲基化、脂基化修饰等进行了综述.

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WD-重复蛋白

段红英，丁笑生，孙富丛

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 101-105.

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WD基元又称Trp-ASP或WD40，由40个左右的氨基酸残基组成，具有保守的GH和WD序列.WD基元存在于很多具有调控功能的蛋白质中，介导蛋白质之间的相互作用,在信号转导、蛋白运输、染色体修饰、转录或RNA加工等过程中具有重要作用.WD重复蛋白(WD-repeat protein)是含有多个保守的WD基元的蛋白质.近年发现，WD-repeat基因突变与人的几种疾病相关.本文对真核生物WD-重复蛋白的研究进展进行了综述，阐明了WD重复蛋白的β-propeller结构特征及其作用机制，并对WD-重复蛋白的未来研究方向进行展望.

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核酶与AIDS治疗

张丽娜，姜凤超

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 106-115.

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艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染并破坏人体免疫功能所导致的一种综合症. 作为具有核酸内切酶活性的RNA小分子，核酶能特异性结合及切割HIV病毒靶分子，并促进靶分子mRNA的裂解，且能相继与多个靶分子RNA作用，同时又不影响宿主细胞RNA. 利用核酶治疗艾滋病不仅没有化疗药物常见的副作用，而且由于核酶本身具有RNA剪切酶活性，可同时剪切HIV mRNA和HIV生命过程中重要的调节蛋白mRNA.因此,较其它基因疗法如RNAi、DNA decoy等,更能有效地抑制HIV复制，并且对由HIV变异而导致的耐药病毒株同样有效，同时对病毒突变的诱导作用也较其它抗病毒药物低.因此,在抗AIDS基因治疗研究中具有潜在的应用价值. 本文在对核酶的结构、催化作用机制及其对HIV-1的作用机制进行概述的基础上，重点讨论了近年来核酶作用于HIV的研究进展以及对AIDS治疗的应用前景.

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重组人磷脂酶D2在体内能明显抑制慢性哮喘豚鼠血清中GPI-PLD的表达

朱玲;余传星;邹伟斌;何小丽;林俊锦

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 116-121.

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通过建立慢性豚鼠哮喘模型,研究重组人磷脂酶D2(rhPLD2)干预慢性哮喘豚鼠血清中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)含量的变化，探寻可能的机制. 以rhPLD2干预慢性哮喘豚鼠，用TX-114分相法检测豚鼠血清中GPI-PLD酶活性.与正常状态豚鼠相比较，慢性哮喘状态豚鼠其血清中GPI-PLD酶活性显著升高.但以rhPLD2及地塞米松干预慢性哮喘豚鼠后，该指标显著下降. rhPLD2可通过抑制其血清中GPI-PLD酶活性表达,来抑制哮喘发生过程中的炎症反应.

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应用AFLP标记对江西省猕猴桃种质资源的鉴别及其分类意义

陈华;易干军;徐小彪

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 122-129.

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对江西省猕猴桃种质资源进行扩增片段长度多态性(AFLP)标记来鉴定分析.首先从64对引物筛选出4对引物,对31份种质材料的DNA进行检测，得到190个扩增基因位点，其中多态性位点179个，多态性比例为94.2%，对31份种质材料的区分率达到100%.然后,对扩增结果进行UPGMA聚类分析，谱系图显示,31份种质材料之间的相似系数在0.50～0.85之间，表明猕猴桃种质之间遗传关系相对来说不是很近.在相似系数0.56的水平上，可以将31份种质大致分为4个类群：净果组和斑果组为一类群；糙毛组为一类群；星毛组为一类群；中华猕猴桃和美味猕猴桃为一类群.从树状图中看，原为中华猕猴桃的一个变种的“赣猕5号”，现与中华猕猴桃并列，有对其作进一步分类方面深入研究的必要.本研究从分子角度鉴定分析了江西省猕猴桃种质资源及其遗传关系，其结果在很大程度上与传统分类是一致的，同时也为江西省猕猴桃种质资源分类学研究提供了新的证据.

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纤维介素基因hfgl2启动子的SARS冠状病毒核心蛋白反应元件初步分析

姚华宁，韩梅芳，严伟明，习东，罗小平，宁琴

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 130-135.

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SARS冠状病毒核心蛋白对hfgl2纤维介素基因有激活作用，采用实时荧光定量PCR和Western印迹已验证了hfgl2基因在mRNA和蛋白水平的表达.为进一步明确在SARS冠状病毒核心蛋白刺激下,hfgl2纤维介素基因5′端非编码区对转录激活起重要作用的转录调控序列，构建了一系列hfgl2 基因启动子荧光素酶报告基因质粒,将其与SARS冠状病毒核心蛋白真核表达质粒共转染CHO细胞.结果表明,转染前3个质粒hfgl2p(－1334)LUC、hfgl2p(－997)LUC、hfgl2p(－816)LUC的细胞的相对荧光素酶活性无显著改变;但转染hfgl2p(468)LUC 质粒的细胞荧光素酶的活性较前明显降低，说明在hfgl2 基因启动子－816位至－468位（相对于转录起始点）之间存在着激活该基因的调控序列.本研究在一定程度上从分子水平揭示了SARS冠状病毒蛋白与宿主纤维介素基因之间的关系.

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Angioarrestin（hARP1）C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定

孙铭娟,王梁华,董晓毅,宗英,高云,焦炳华

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 136-140.

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Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestin C端 hFD cDNA 和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒 pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,经0.3 mmol/LIPTG 在37℃条件下诱导表达4h，SDS-PAGE 检测，融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实，目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干，以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET22b（+）表达系统获得的 hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明：通过基因重组可获得angioarrestin C端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白，且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.

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环酰亚胺水解酶C末端区为该酶活性所必需

石亚伟,陈云霞,崔丽方,袁静明

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 141-146.

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为了研究一个新环酰亚胺水解酶（CIH）C端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C末端缺失1～4个氨基酸残基以及C末端2个Lys替代为2个Glu或2个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE-cih₂₉₃为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩增获得突变的CIH基因片段.经克隆、表达与纯化,得到不同的突变酶蛋白.酶活性测定、荧光光谱与CD谱分析表明，随着C末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，但酶分子的聚合状态未发生变化；当CIH的C末端2个Lys替代为2个Glu时，酶活性及分子结构变化均不明显，但当替代为2个Leu时，酶活性丧失殆尽，分子结构变得松散而不再保持寡聚态.pH及热稳定性实验也表明，酶的稳定性与其分子的完整性密切相关.结果证实,CIH的C末端电荷残基对该酶活性与分子状态具有重要作用.

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蚯蚓纤溶酶组分的抗原性分析

赵晓瑜，侯艳，高珊，李晓霞

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 147-153.

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用热变性蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolitic enzyme，EFE)组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1, 以及重组蛋白EfP-Ⅲ-2为抗原，免疫家兔获得了抗血清，利用获得的抗血清对部分组分的免疫学同一性进行了验证.EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ的免疫双扩散反应表明，EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性. 利用DNAMAN软件对获得的EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ、EfP-Ⅲ的蛋白质序列进行了初步分析，包括整个序列相似性比对、氨基酸组成、蛋白酶消化、抗原肽、疏水性和亲水性轮廓等，并对N端氨基酸序列进行了分析.结果表明，EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性是由它们蛋白质序列的组成和结构决定的.

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短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖

岳华,汤承,李定霏,傅安静,马丽

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 154-159.

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以新城疫病毒（NDV）NP基因为标靶，构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA（shRNA）的质粒载体，在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡胚上进行了RNAi试验，筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1.用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect 将ndv1转染CEF，以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照，4 h后接种NDV，与对照相比，干涉组在病毒感染后3 h NP基因的表达量降低2.3倍，6 h 降低21.1倍，9 h降低9.8倍；ndv1能在48 h内完全阻断NDV在CEF中的增殖，延缓病变出现时间，减轻病变程度.将Silent-fect-ndv1混合物与NDV同时注入10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔，能使10⁵ ELD₅₀NDV感染后17 h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少94.4%，使10⁶ ELD₅₀NDV感染后17　h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少62.5%.实验结果证实，在CEF中存在RNAi机制，抑制NDV NP基因的表达能有效阻断该病毒增殖，说明NP基因在NDV复制过程中起重要作用.实验结果为进一步利用RNAi技术在CEF和鸡胚中研究病毒基因组功能及筛选抗病毒小分子奠定了基础.

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一个中国雄性激素不敏感综合征大家系中AR-Arg⁸⁴⁰Cys突变的生物学效应

王明华;叶璐夷;蒋东;吴士良;赵志民;王久存

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(02): 160-166.

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雄性激素不敏感综合征在中国有一个患者大家系.遗传分析表明，雄性激素受体(AR)的Arg⁸⁴⁰Cys突变是引起本家系疾病的原因.家系中的患者个体呈现高度变异的表型特征.选择具有显著代表性的3个患者个体，成功建立了这些个体的生殖器皮肤成纤维细胞系（GSF），并研究了各细胞系的生长动力曲线和生长周期的分布，发现这些指标和个体病症的严重程度呈一定的正相关性.通过比较野生型与突变性AR的空间结构变化以及转激活能力的变化，结合个体表型的差异性，推测由于个体的基因背景差异，相关AR辅调控因子的表达也会存在着差异，可能最终导致该家系患者显著的表型变化.目前，已利用蛋白质双向电泳，观察到个体间差异表达的蛋白，并在其中寻找AR的辅调控因子，以期进一步阐明AR-Arg⁸⁴⁰Cys突变一因多效性的机制.

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