中国生物化学与分子生物学报

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彭淑平，李小玲，刘华英，王理，周鸣，周后德，李征，钟慧，向波，李桂源

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 0.

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NGX6 基因是我室利用定位候选克隆策略，在鼻咽癌的高频杂合性缺失区9p21-22克隆的新基因.前期研究结果提示，它与鼻咽癌细胞的侵袭转移密切相关.为了进一步阐明其作用的结构基础，本研究成功构建了含NGX6基因及突变体的pCMV-myc瞬时和pcDNA3.1-his-myc(-)B稳定表达载体.通过脂质体转染技术，构建了NGX6及突变体的稳定表达细胞系5-8F.用免疫荧光试验和免疫电镜观察了NGX6在5-8F细胞中的亚细胞定位主要位于胞膜、核膜以及胞浆中的膜质结构，缺失突变的功能域对其定位没有明显的影响.基质胶侵袭试验和划痕试验研究了NGX6及突变体对细胞运动的影响.NGX6能抑制高转移潜能的鼻咽癌细胞5-8F的运动和侵袭能力，缺失胞内区（CYTO）后NGX6不能抑制5-8F细胞的运动和侵袭，提示CYTO可能是其发挥作用的重要功能域.

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线粒体通透性增高过程中新的参与者

邵海军,李敬远,吴长毅,曾因明

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 249-255.

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应激时，线粒体通透性增高可导致位于线粒体膜间的致凋亡因子释放入细胞质，胱天蛋白酶 (caspase)激活，以及细胞死亡.但线粒体通透性增高的确切机制尚不清楚.许多研究表明,线粒体通透性增高过程需要Bcl-2家族蛋白中促凋亡Bax亚家族蛋白，主要是Bax和Bak的激活；该家族中其它蛋白可对Bax和Bak进行调节.但最近的研究表明,其它非Bcl-2家庭蛋白的蛋白质包括抑制因子和激活因子，也可对线粒体通透性增高过程进行调节.此外，应激时线粒体脂质重新分布，对于线粒体膜通透性增高过程也起重要作用.

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.液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用

杨洋，汤华

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 256-261.

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液相芯片技术是以100种不同荧光编码的微球作为探针的载体，生物分子间的反应在悬浮液态体系中进行的一类新的生物芯片技术.在这个灵活和开放的平台中可进行蛋白质、核酸等生物大分子的检测.液相芯片较传统的固相芯片的优势在于检测准确、信息质量稳定、可重复性好.液相芯片以其易于操作、高通量、高灵敏度、高准确度、高精密度以及宽的线性测定范围的特点，逐渐进入了临床诊断领域.

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彩叶草叶片衰老相关新基因Cbcbs的分子特征和功能分析

祝钦泷，李名扬，刘光德，李艳冬，眭顺照，郭铁英

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 262-270.

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叶片衰老是观叶植物观赏性降低的重要因素之一.为研究彩叶草叶片衰老变化的分子机理，在构建彩叶草衰老叶片cDNA文库及小型EST库的基础上，以1条新的具有胱硫醚β 合酶(cystathionine beta synthase, CBS)结构域的EST序列为探针，通过RACE与文库结合的方法，克隆了1个具有1对完整CBS结构域的全长cDNA，Cbcbs.Cbcbs cDNA 全长859 bp，包含1个609 bp的ORF框，编码202个氨基酸.其5′UTR区含有1个终止子TAA，3′UTR区含有推测的加尾信号AATAAA和ATTTA元件.CbCBS N端含有线粒体转运肽，具有2个保守的CBS结构域，4个酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ，CKⅡ)磷酸化位点，3个蛋白激酶C(protein kinase c，PKC)磷酸化位点和1个酪氨酸硫化(tyrosine sulfation，TS)位点.序列比较和进化分析表明，CbCBS是与衰老或应急相关的蛋白.二级结构和三级结构预测表明，CbCBS的功能主要由CBS结构域决定.RT-PCR分析表明，该基因在叶的各个时期均有表达，但随叶片衰老进程的加快而表达增加，是一个叶衰老相关基因（SAG），推测在线粒体中成熟的CbCBS可能作为细胞能量传感器，在叶衰老引起的能量应急中参与细胞能量水平的调节.

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南极耐冷 Pseudomonas sp. 7323低温脂肪酶的性质及基因克隆

王水琦;曾润颖;张金伟

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 271-277.

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南极微生物是筛选低温酶的良好来源,但尚未得到充分的研究与开发.低温脂肪酶具有广阔的应用前景,其基因结构特征也具有重要的研究意义. 本文对南极微生物开展了低温脂肪酶产生菌的筛选、基因克隆及特征分析.采用功能筛选的方法,从南极普里兹湾深海沉积物中获得一株产低温脂肪酶的菌株7323,其最适温度和最高生长温度分别为20℃和30℃,属于耐冷菌.16S rDNA序列分析表明,该菌属于假单胞菌属（Pseudomonas）.通过设计引物扩增出的脂肪酶基因全长为1854　bp,该基因编码一个由617氨基酸、分子量预计为64466的蛋白质.氨基酸序列分析表明,该酶与Pseudomonas sp. UB48 的脂肪酶有89%的相似性,在催化区和C末端信号肽中存在高度保守的序列.纯化后的酶学性质研究表明,该脂肪酶的最适温度为35℃,最适pH值为9.0,为碱性低温酶.

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人PNRC基因启动子的初步鉴定

张艳，陈彬，陈敏，李渝萍，陈健，娄桂予，周度金

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 278.

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PNRC (praline-rich nuclear receptor coactivator) 是最近发现的一种新的核受体辅活化子，它是以牛类固醇生成因子-1(SF1)作诱饵，利用酵母双杂系统从人乳腺cDNA表达文库中筛选得到的.为了研究人PNRC基因的表达调控机制，在对人PNRC基因的生物信息分析的基础上，采用5′RACE法确定了PNRC基因的转录起始位点，克隆了人PNRC基因的5′侧翼区，并对该区进行功能分析.分别构建了11种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒，将它们瞬时转染HepG2细胞，检测其荧光素酶活性.结果发现,PNRC的5′侧翼区的-323～+27、-323～+57-123～+57、-123～+27区域的启动子活性显著升高，其中-323～+27区域的启动子活性最高.研究表明，人PNRC基因启动子的最小区域位于PNRC的5′侧翼区的-123～+27区域.
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水稻minE基因的克隆及分析

胡勇;周伟巍;张江丽;雷启义;何奕昆

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 285-291.

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植物叶绿体与原核生物分裂机制相似，其中MinE蛋白在细菌分裂过程中具有重要作用. 为了研究植物MinE蛋白在叶绿体分裂过程中的功能及其进化，利用RTPCR技术克隆了水稻叶绿体分裂相关基因OsMinE，并在GenBank登录（No. AY496951）.OsMinE基因cDNA全长1 035 bp，其ORF为711 bp，编码236个氨基酸.与原核生物MinE蛋白相比，水稻OsMinE具有明显延伸的N端与C端.其N端102个氨基酸残基为预测的叶绿体导肽序列,C端延伸保守，推测赋予植物MinE蛋白新的功能.植物minE基因结构分析显示，水稻、拟南芥、杨树都仅含有1个内含子，且插入位置及相位相同.这表明,该内含子可能在单子叶、双子叶植物分化前产生.水稻OsMinE基因在大肠杆菌细胞中的表达严重影响了细胞的分裂，初步证明了水稻MinE蛋白与原核细胞MinE蛋白功能类似.水稻OsMinE基因的克隆为进一步研究叶绿体的分裂机制奠定了基础.

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人微丝相关蛋白hHBRK1突变体的亚细胞定位

徐勤枝;丁新民;颜贤忠;霍艳英;隋建丽白贝;吴德昌;周平坤

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 292-297.

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hHBrk1是本研究室利用抑制性消减杂交手段，从人支气管上皮细胞恶性转化株BERP3 5中克隆到的差异高表达基因.hHBRK1蛋白家族序列在动、植物界高度保守，含有一个7重复 (heptad repeat, HR) 结构域.利用绿色荧光蛋白(GFP)报告系统，发现野生型hHBRK1蛋白在胞浆中弥散分布，在细胞运动前沿富集，与细胞片状伪足的微丝共定位.hHBRK1-R54和hHBRK1-S56 G57蛋白在胞浆弥散分布，但失去了在细胞运动前沿富集的特征.hHBRK1ΔN(1-45)在细胞内弥散分布，而hHBRK1ΔC(46-75)选择性地在高尔基体富集.研究提示,hHBRK1蛋白为微丝相关蛋白，结构的完整性是其发挥功能的前提.hHBRK1蛋白可能通过HR结构域调控微丝聚合，从而参与微丝依赖性的细胞运动或物质运输.

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Bcl-2/C-Raf双基因“敲低”抑制人结肠癌细胞增殖

杜柏权;于源华;赵然;牛灵

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 298-303.

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RNA干扰是一种具有序列特异性的基因沉默，能够触发具有相应序列的mRNA的降解.构建具有双靶点的RNAi质粒表达载体，与单靶点表达载体比较，探讨其对结肠癌细胞增殖的抑
制作用.本研究分别构建了针对Bcl-2、C-Raf 和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体，通过Lipofectamine TM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后，检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量，测定各组细胞活性，研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制率.结果表明，分别转染3种质粒表达载体后，3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低；转染双靶点干扰质粒的试验组；其细胞活性低于单靶点组；对于针对Bcl-2, C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验，RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%,40.64% 和63.85%.RNAi是结肠癌细胞中的一种功能途径，以质粒作为表达载体，同时具备Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体,对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体，双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中是有潜力的.

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Bcl-2/C-Raf双基因“敲低”抑制人结肠癌细胞增殖

杜柏权;于源华;赵然;牛灵

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 298-303.

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RNA干扰是一种具有序列特异性的基因沉默，能够触发具有相应序列的mRNA的降解.构建具有双靶点的RNAi质粒表达载体，与单靶点表达载体比较，探讨其对结肠癌细胞增殖的抑
制作用.本研究分别构建了针对Bcl-2、C-Raf 和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体，通过Lipofectamine TM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后，检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量，测定各组细胞活性，研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制率.结果表明，分别转染3种质粒表达载体后，3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低；转染双靶点干扰质粒的试验组；其细胞活性低于单靶点组；对于针对Bcl-2, C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验，RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%,40.64% 和63.85%.RNAi是结肠癌细胞中的一种功能途径，以质粒作为表达载体，同时具备Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体,对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体，双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中是有潜力的.

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过氧化氢以PTEN依赖方式介导细胞凋亡

霍艳英;付春玲;苟巧;胡迎春;李刚;吴德昌

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 304-308.

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PTEN是一个重要的抑癌基因.为了调查PTEN在H２Ｏ2对细胞凋亡诱导过程中的作用及机制，采用Western 印迹方法，检测了在PTEN缺失细胞及对照细胞中H２Ｏ2对PI3K/AKT通路的影响；采用Annexin Ⅴ-FITC标记结合流式检测H２Ｏ2对PTEN缺失细胞及对照细胞凋亡的诱导.结果表明，在PTEN功能正常的对照细胞中，H２Ｏ2短时间活化，长时间抑制PI3K/AKT通路，但PTEN缺失后，H２Ｏ2对PI3K/AKT通路的介导被阻断；0.1mmol/L H２Ｏ2处理12　h及24　h可以诱导对照细胞的凋亡，但对PTEN缺失细胞没有明显影响.这一结果证明，PTEN通过参与H２Ｏ2对PI3K/AKT通路活性的调控影响H２Ｏ2介导的凋亡.

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失血性休克大鼠肝脏蛋白质的差异分析

郑伟，黄灵芝，赵莲，王波，王广义，王字玲，周虹

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 316-322.

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应用蛋白质双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-DE) 技术,分析在急性重度失血性休克 (refractory hemorrhagic shock, RHS) 条件下,大鼠肝脏蛋白质组表达的差异.16 只雄性 Wistar 大鼠随机分成正常对照组 (sham hemorrhage shock, SHS) 和 RHS 模型组，每组 8 只.采用股动脉放血的方法制备模型，在规定时间内处死大鼠并分离肝脏，提取肝脏总蛋白质后进行 2-DE.运用 Image Master 2D Platinum v 5.0 凝胶图像分析软件对 2-DE 凝胶图像进行差异表达分析.有意义的差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行肽质量指纹图谱分析，借助 Swiss-prot 数据库进行蛋白质搜索和鉴定.SHS 组和 RHS 组肝脏的 2-DE 图谱,分别平均识别到 698±11 和 700±13 个蛋白质点，SHS 组和 RHS 组肝脏间平均匹配率达88%～92 %.共发现 10 个差异有意义的蛋白质点，鉴定出了肿瘤抑制性抗原gp96、葡萄糖调节蛋白58、过氧还蛋白Ⅰ、细胞色素b5、谷胱甘肽转移酶、ATP合酶β亚单位、二磷酸果糖酶 B、三磷酸甘油醛脱氢酶等8种蛋白质.结果表明,以 2-DE 技术得到重复性和分辨率都较好的 2-DE图谱，并初步鉴定急性重度失血性休克后大鼠肝脏的差异表达蛋白质，为深入研究失血性休克的生理病理机制及寻找失血性休克预防和治疗的生物标志物提供了依据.

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蛋白质空间结构属性与全基因组微生物耐热性的关系

丁彦蕊;蔡宇杰,;须文波

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(04): 323-330.

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溶剂接触表面积、空腔个数和体积、紧密度、疏水性以及温度因子是影响蛋白质耐热的主要三维结构参数.挑选NCBI COG数据库中具有全基因组的单细胞微生物，选择其中三维结构已知的蛋白质作为研究对象，分析这些因素对细菌类和古细菌类微生物耐热性的影响.结果表明：（1）古细菌类蛋白质的空腔个数和体积与耐热性无关，极性面积和表面残基个数随耐热性增加而降低;（2）超高温细菌类蛋白质的分子量比较小，空腔个数和体积都小于常温蛋白质，而且空腔个数对稳定性的贡献大于空腔体积;（3）无论是古细菌还是细菌类蛋白质，疏水性和紧密度都不随耐热性变化，但暴露残基个数越多，蛋白质的耐热性越差;（4）两类蛋白质侧链的温度因子都高于主链，这与侧链的运动性（柔性）一般比主链高的实验结果一致；另外，超高温细菌类蛋白质的温度因子明显高于常温蛋白质.

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