硫化氢（H2S）一直被认为是一种有毒气体，作为第三种气体信号分子，H2S在生物体中的生理功能逐渐被揭示。植物中H2S信号研究在不到10年时间已取得了长足进步。植物体内H2S的生成酶比动物细胞丰富，定位于细胞质、线粒体和叶绿体等多个亚细胞部位，表达具有时空性。目前，植物领域H2S的功能研究主要采用药理学方法。随着研究的深入，遗传学证据不断加强。内源H2S的研究手段也在不断进步，从亚甲基蓝间接测定，发展到气/液相色谱、荧光探针、活体电极等直接检测手段。植物中H2S的生理功能研究主要集中在对干旱、重金属等环境非生物胁迫的缓解作用及机理，也有一些植物生长发育调控方面的报道。目前了解到，H2S可通过与植物激素、其它气体信号分子、活性氧等相互作用以及蛋白质巯基化修饰等方式发挥生理功能。虽然植物气体信号的研究有其特殊性，也遇到很多困难，但是H2S信号的广泛而特殊的生理功能是一个具有重要科学意义和应用前景的研究领域。
驱动蛋白是一类能够利用ATP水解释放的化学能驱动其所携带的“货物”分子沿着微管（microtubule，MT）定向运动的分子马达，在细胞器运输、有丝分裂、轴突运输等方面有着重要的生理作用。随着驱动蛋白结合ADP、ATP和未结合核苷酸（APO）三种特征状态的晶体结构的解析，驱动蛋白构象变化的研究得到了进一步发展，而在力产生机制和运动模型方面仍然存在较大争议。本文以kinesin-1家族为例，分析了驱动蛋白三种特征状态结构的特点、状态结构间的构象转变，论述了驱动蛋白的力产生机制和整个迈步过程。并探讨了驱动蛋白的运动模型，同时采用分子动力学模拟比较了驱动蛋白的两种迈步方式，为深入研究驱动蛋白提供了一定的理论计算。最后，基于本课题组对复杂体系的研究，对驱动蛋白体系的控制机制提出了新的假设，并对未来的研究方向进行了展望。
聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate）PHA 纳米微球是很多微生物在营养失衡的情况下，在体内合成的一种可生物降解的细胞内聚酯，主要作为微生物的碳源及能量储备。天然 PHA 微球的内部是由疏水的聚酯链构成的疏水核心，其外层是由磷脂界膜及膜上嵌入或附着的包括 PHA合酶 PhaC 和 PHA 颗粒相关蛋白 PhaP 等蛋白构成的边界层。PhaC 通过共价键连接在PHA微球表面，而 PhaP 通过疏水相互作用吸附在 PHA 微球表面。通过将外源性功能蛋白与 PhaC 或 PhaP 进行融合表达，在重组微生物体内就能直接合成表面带有功能蛋白的纳米微球复合体。由于该纳米微球在微生物细胞内是以独立的包涵体形式存在，因此通过细胞破碎及离心等方法就能简便、有效地使其从细胞中分离并得以纯化。鉴于 PHA 微球这种表面易被修饰改造的特性，越来越多的功能蛋白通过与 PHA 微球表面蛋白（PhaC 或 PhaP）的融合表达，呈递在了 PHA 微球表面，使其成为一种廉价、高效的蛋白固定化及呈递的新技术。本文在介绍了 PHA 微球的结构特性及生物合成的基础上，着重综述了目前关于功能化 PHA 微球在蛋白纯化、固定化酶、生物分离、靶向递药、疾病诊断、成像技术及新型疫苗开发方面的研究现状及其未来在生物医药等领域的广泛应用前景。
蛋白激酶C-δ（protein kinase C-δ, PKC-δ）是细胞内重要的信号转导分子，在动物体内广泛表达，具有多种重要的细胞功能，如细胞增殖、死亡和免疫等，尤其在细胞凋亡中扮演重要的角色。在细胞凋亡过程中，PKC-δ可通过构象变化或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）剪切等过程被激活。激活的PKC-δ由细胞质向线粒体或细胞核进行转位。被caspase-3切割的PKC-δ，产生具有激酶活性的催化片段（PKC-δ-catalytic fragment, PKC-δ-CF），作用于下游底物蛋白质，活化促凋亡相关的调控因子，促进细胞凋亡；同时PKC-δ还具有抗凋亡的调控功能。本文对PKC-δ在细胞凋亡中的作用与分子机制及在肿瘤发生与治疗中的作用进行综述，以期为进一步明确PKC-δ在细胞凋亡中的作用机制提供资料。
内膜增生是血管损伤后动脉重塑过程中普遍存在的现象。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的增殖、迁移、表型转换是血管损伤性疾病高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等的共同病理生理学过程。干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRFs）是一类能对干扰素基因表达起到免疫调节作用的转录因子。近来研究发现，其在血管损伤病理过程具有调节作用，其中IRF1与细胞生长、分化和损伤密切相关，IRF3与IRF7可以抑制新生内膜的形成，而IRF8和IRF9则促进VSMCs增殖、迁移及血管内膜增生。本文重点介绍了IRFs的结构特征、信号途径及在血管重塑过程中作为新型调控因子的功能。
分选连接蛋白（sorting nexins，SNXs）是一类包含PX（phox homology）结构域的高度保守真核生物蛋白，其功能主要是参与负载蛋白的内吞、分选和降解过程，以维持细胞信号的稳态和平衡。SNXs参与调控与肿瘤等疾病相关的重要信号通路，如SNX3介导分泌型糖蛋白Wnt受体Wntless的胞内循环|SNX1、SNX5等众多SNXs介导表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和转化因子β受体（TGFβ）等的内吞、分选和降解等过程。其中，对EGFR降解的调控研究最多，尤其是在肿瘤方面的进展令人鼓舞，可也较为复杂，仍有许多未解之谜。随着SNXs的深入研究，将对疾病的发生机制产生新的认识。
BLM解旋酶是人RecQ DNA解旋酶家族重要成员之一，在机体的DNA复制、重组、损伤修复以及维护基因组稳定性等方面发挥重要作用。早期研究表明，BLM解旋酶通过自身携带的核定位信号（nuclear localization signal, NLS）进入细胞核，但是介导其细胞核定位的关键氨基酸位点尚不清楚。本研究构建了BLM解旋酶C端(aa6421417)截短体克隆，首先通过截短表达的方法确证其NLS结构域。在此基础上，构建重组真核表达载体pEGFPNLS/BLMNES/Rev，通过观察BLM NLS碱性氨基酸位点突变对EGFPNLS/ BLMNES/Rev融合蛋白细胞核定位的影响，以此快速鉴定NLS中介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点。结果表明，BLM(aa6421417) C端截短体具有与全长BLM解旋酶相同的细胞核定位，同时确证1344RSKRRK1349是BLM解旋酶NLS结构域的活性位点，且具有与SV40 NLS相同的核输入能力。氨基酸位点突变试验结果表明，R1344A、K1346A、R1348A和K1349A点突变均减少了EGFPNLS/BLMNES/Rev和EGFPBLM(6421417)融合蛋白的细胞核定位。因此，这4个位点是介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点。此结果为后续研究BLM解旋酶细胞核定位的分子机制奠定了基础。
膜周蛋白PICK1(protein interactingC-kinase-1)参与多种膜受体与膜上蛋白的运输并影响细胞的功能。本研究旨在探索小胶质细胞PICK1与P2Y6受体之间的相互作用是否可改变P2Y6受体在细胞膜上的表达，以及对小胶质细胞吞噬功能的影响。采用小鼠脑内皮层原代培养的小胶质细胞进行免疫共沉淀实验揭示，与PICK1敲除小鼠比较，野生小鼠皮层小胶质细胞内存在PICK1-P2Y6受体相互作用。生物素化、密度梯度离心结合蛋白质印迹实验证明，PICK1基因敲除小鼠的小胶质细胞膜表面P2Y6受体表达水平降低。荧光胶珠吞噬实验结合免疫组织化学染色显示，PICK1基因敲除小鼠的小胶质细胞对UDP（刺激）引起的荧光胶珠吞噬作用减弱。蛋白质印迹实验显示，与野生型小鼠比较，PICK1基因敲除小鼠小胶质细胞中的Akt308T磷酸化水平明显降低|使用Akt抑制剂API-2能有效抑制Akt 在小胶质细胞内的（磷酸化）激活及UDP刺激引起的吞噬作用。上述结果表明，敲除PICK1能下调小胶质细胞膜上P2Y6受体的表达，并降低小胶质细胞的吞噬功能，且这一过程依赖Akt磷酸化修饰。总之，PICK1可促进P2Y6受体在细胞膜上的表达，是小胶质细胞吞噬功能的重要调节子|敲除PICK1可下调P2Y6膜受体表达，并降低小胶质细胞的吞噬功能。这一结果可加深对小胶质细胞的吞噬功能及机制的认识。
瞬时受体电位(TRP)通道是一类钙离子透过性的阳离子通道蛋白家族，参与了视觉、味觉、温度感受等重要的生物学过程。之前的研究表明，钙离子既能够正反馈也能够负反馈地调节瞬时受体电位通道的活性，而这种调节可能是通过钙调蛋白（calmodulin，CaM）与TRP通道的相互作用来进行的。为了阐明这一调控机制，我们首先需要对钙调蛋白与瞬时受体电位通道之间的相互作用进行详细的生化研究。在此项研究中，通过大肠杆菌表达系统，表达和纯化了果蝇瞬时受体电位通道羧基末端不同长短的蛋白片段，并发现了一个新的钙调蛋白结合位点。通过快速蛋白液相色谱、静态光散射以及等温量热滴定技术，鉴定了这一钙调蛋白结合位点与果蝇瞬时受体电位通道之间的相互作用，发现它们在钙离子依赖的条件下，可以形成亲和力非常强的稳定的蛋白复合物（解离常数在01～1微摩尔范围）。此外，通过合成多肽的方法，鉴定了果蝇瞬时受体电位通道913～939片段为该钙调蛋白结合位点的核心区域。最后，通过突变实验，进一步明确了果蝇瞬时受体电位通道922位的酪氨酸以及923位的缬氨酸为其钙调蛋白结合位点的关键氨基酸。总而言之，本研究发现和鉴定了果蝇瞬时受体电位通道上一个新的钙依赖的钙调蛋白结合位点，这一发现将为研究瞬时受体电位通道的体内功能提供生化基础，为阐明钙离子通过钙调蛋白调节瞬时受体电位通道的分子机制做出贡献。
果蝇的视觉信号转导途径是已知的最快的G蛋白偶联信号通路。这其中涉及到TRP/TRPL通道的开放以及钙离子的内流等一系列反应的形成。NINAC（neither inactivation nor afterpotential C）是一种特异性存在于果蝇感光细胞中的第3类肌球蛋白（Myosin III），其在终止果蝇的视觉信号转导通路中起着非常重要的作用。NINAC蛋白具有两种亚型：一种是132 kD的蛋白亚型 (p132)，另一种则是174 kD的蛋白亚型(p174)。这两种不同的蛋白亚型都具有相同的激酶催化结构域(kinase domain)，以及与肌球蛋白相似的马达结构域(motor domain)。但是，它们在C末端却存在着非常大的差异，这其中包括了钙调蛋白结合基序(IQ motif)。NINAC的这两种蛋白亚型在果蝇的感光细胞中的定位以及作用有很大不同，尤其是在与钙调蛋白的相互作用方面。钙调蛋白结合基序与钙调蛋白（CaM）之间的相互作用对于果蝇的视觉信号通路具有重要的意义：NINAC结合钙调蛋白能力的缺失将导致果蝇的视觉传导缺陷。本文通过蛋白共表达的方法，成功表达并纯化得到了不同版本的NINAC与钙调蛋白的蛋白复合物。静态光散射的结果表明，在Ca2+存在情况下，p174蛋白可以结合2个Ca2+-CaM，而p132只结合1个Ca2+-CaM。通过分析型凝胶过滤以及等温量热滴定技术，进一步鉴定了p174及p132的IQ2（第2个钙调蛋白结合基序）序列与Ca2+CaM的相互作用。通过序列分析及进一步的突变实验发现，p174 IQ2中的3个疏水氨基酸（F1083，F1086 和 L1092）对于钙调蛋白的结合非常重要，并导致了p174与p132蛋白和Ca2+CaM结合能力的差异。本文的研究提供了NINAC与Ca2+-CaM相互作用的生化机制，将为进一步在果蝇视觉信号通路中深入研究CaM是如何调节NINAC的体内功能实验打下基础。
已知源于枯草芽孢杆菌内生孢子的CotA蛋白具有漆酶和胆红素氧化酶活性。然而，其分离纯化极为困难。本研究对表达与纯化的重组CotA蛋白的胆红素氧化酶特性及氧化还原功能进行鉴定。基因转染及筛选获得了表达CotA的P. pastoris菌株|继而，表达的重组CotA蛋白经DEAE-Sepharose FF 及Sephadex G-75层析分离与纯化，产物得率为25%，纯化产物的酶比活性为 4 U/mg。经SDS-PAGE 和 MALDI-TOF MS 分析显示，其分子质量为65 kD。纯化的CotA蛋白能够催化胆红素氧化，生成胆绿素，且催化反应速率受反应溶液中溶解氧含量的影响，提示纯化的重组CotA具有胆红素氧化酶活性。酶反应进一步证明，CotA的胆红素氧化酶反应最适pH值为pH 8.0，最适温度为60℃。该酶在90℃条件下的半衰期为7 h，提示CotA胆红素氧化酶具有高度的热稳定性。CotA修饰的摄谱仪石墨电极可直接电催化分子氧（O2）还原，具有很好的电流响应。我们的结果表明，重组的CotA蛋白具有耐高温胆红素氧化酶活性。更重要的是，我们的结果还提示重组的CotA蛋白在酶生物燃料电池阴极的制备上具有较好的应用潜能。
主要嗅觉表皮(main olfactory epithelium, MOE)是哺乳动物感知气味分子的主要嗅觉器官。在MOE组织内，大多数嗅觉神经元通过cAMP信号传导通路感知气味信息。作为嗅觉cAMP信号通路的主要成员之一，腺苷酸环化酶3（adenylyl cyclase 3, ac3）基因敲除小鼠嗅觉探测功能丧失。除cAMP信号传导通路外，MOE内AC3相关因子AC2和AC4，以及肌醇1,4,5-三磷酸（inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3）信号通路和Sonic Hedgehog（Shh）信号通路均有表达。然而，敲除ac3是否会对ac2和ac4以及IP3和Shh信号通路成员产生影响，尚不清楚。本文以AC3缺失（AC3-/-）及其野生型小鼠（AC3+/+）MOE为材料，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和免疫荧光组织化学方法，发现AC3缺失后，MOE内的ac2和ac4，以及IP3信号通路中的IP3受体ip3r1及钙调蛋白calm1和calm2表达水平均明显降低。Shh信号通路中的受体patched(ptch)与smoothened(smo)、以及核转录因子gli1与gli2的表达也受到了影响。总之，AC3基因缺失不但导致小鼠MOE组织中cAMP信号通路受损，同时AC3相关因子，IP3信号通路和Shh信号通路的传导也受到抑制。本文对于阐明AC3基因敲除小鼠嗅觉丧失的原因及其嗅觉探测机制具有重要启示作用。
富含鸟嘌呤的DNA序列在金属离子（通常是钠、钾离子）存在的条件下，可以形成稳定的G-四链体（G-quadruplex）。该G四链体能够结合hemin（氯高铁血红素）形成具有过氧化物酶的活性的G四链体-hemin复合物DNAzyme。将这一原理联合滚环扩增技术可以对核酸进行可视化的检测。本研究旨在探索G-四链体-hemin复合物中，G-四链体结构以及两个G-四链体之间的链接长度与DNAzyme过氧化物酶活性之间的关系。实验分别选取了平行、反平行和混合结构的G-四链体，通过热差异光谱、紫外光谱、圆二色光谱对结构进行分析，不断加长链接序列并测定3种结构形成的DNAzyme活性，发现正平行结构的G-四链体具有更高的DNAzyme活性和更明显的可视化效果。综上所述，平行G-四链体结构可以用来满足裸眼可视化检测的需求，为无需复杂仪器的核酸检测奠定了方法基础。
岩藻糖基转移酶（fucosyltransferases，FUTs）是一类催化糖蛋白和糖脂发生岩藻糖基化（修饰）酶，主要包括FUT1~FUT9。已有研究证明，很多癌组织中都有不同FUT基因表达升高的现象。本研究证明，表皮鳞癌细胞的增殖能力与几种FUT基因表达水平有关。本文比较研究了人表皮鳞癌A431和SCC12细胞的增殖速度和几种FUT的表达状况，以揭示鳞癌细胞增殖能力与几种FUT基因表达水平的关系。细胞倍增时间结合MTT法揭示，鳞癌A431细胞的倍增时间约为26 h，而鳞癌SCC12细胞的倍增时间约为33 h（P < 0.05），提示A431细胞增殖速度比SCC12细胞明显加快。与增殖速度一致的是，Western 印迹显示，A431细胞中与DNA合成相关的增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白表达水平比SCC12细胞高。实时定量PCR（qPCR）检测FUT1-9基因 mRNA转录本，揭示A431细胞中几种FUT基因的mRNA水平均显著高于SCC12细胞。凝集素免疫印迹法和Western 印迹法进一步证明，A431细胞中总蛋白的岩藻糖基化水平比SCC12细胞中的明显升高。敲低FUT4基因表达后，A431细胞中LeY寡糖的表达水平下调，细胞增殖被明显抑制。这些结果证明，较强的表皮鳞癌细胞增殖能力可能与几种FUT基因的高表达，以及糖蛋白的岩藻糖基化（修饰）相关。岩藻糖基转移酶表达水平与临床表皮鳞癌的恶性增生的相关性有待进一步证明。
转录因子Tbx18在胚胎心脏发育过程中起重要调控作用，是心外膜祖细胞标记之一|故以Tbx18为标记的阳性祖细胞群被称为：Tbx18+心外膜祖细胞(epicardial progenitor cells, EPCs)。小鼠胚胎、新生和成年期心脏组织细胞的特性区别较大，成年小鼠的心脏属于终末分化组织。但是，Tbx18+EPCs对成年小鼠心脏组织的贡献大小尚存争议。本研究拟定量分析Tbx18+EPCs对成年小鼠心脏组织的贡献大小。采用整体和组织切片X-gal染色检测成年心脏组织LacZ的表达|荧光激活细胞分选法(fluorescence activated cell sorting，FACS)分离成年Tbx18Cre/R26EYFP小鼠心脏组织EYFP+细胞。结果显示，在Tbx18+EPCs遗传谱系示踪小鼠，报告基因LacZ和EYFP在成年小鼠心脏的心室、心房、冠状动脉、室间隔等处表达|成年Tbx18Cre/R26EYFP小鼠心脏组织细胞用FACS分离，分选的EYFP+细胞比例平均约为33.94%。由此可见，成年小鼠心脏的心室、心房、冠状动脉、室间隔等心脏组织均可来源于Tbx18+EPCs|约1/3成年小鼠心脏组织细胞来源于Tbx18+EPCs。故Tbx18+EPCs参与成年小鼠心脏组织的部分形成。
CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而，该系统在提供靶向性基因修饰的同时，会产生一些不需要的突变，即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性，我们将野生型FokI核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas9蛋白(dCas9)进行融合，形成融合蛋白用于降低脱靶效应。FokⅠ是一种依赖于二聚化才能行使内切酶活性的核酸酶，在本研究中，通过将FokⅠ功能结构融合到dCas9的N端，构建表达质粒pST1374-dCas9-FokⅠ。我们前期研究中，发现一个sgRNA在介导Cas9编辑Dnmt1基因建立条件敲除大鼠时，存在显著的脱靶现象。以此为基础，我们利用dCas9-FokⅠ/sgRNA系统编辑大鼠Dnmt1基因，研究该系统是否能够进行基因编辑以及是否能够提高基因编辑特异性。将转录好的dCas9-FokⅠ mRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠的受精卵中，用于产生基因编辑大鼠。通过显微注射以及胚胎移植，最终获得43只F0代大鼠，其中两只在靶点位置包含突变，突变效率达4.5%。对脱靶情况进行分析，结果显示，无脱靶现象存在。综上，表明dCas9-FokⅠ/sgRNA可以应用于编辑大鼠基因，并能显著提高特异性。尽管dCas9-FokⅠ/sgRNA系统相比于Cas9/sgRNA系统，基因编辑效率有所下降，但是该技术的发展为基因治疗提供了可供选择的潜在工具。
