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    综述
  • 韩晓曦;王继红;李庆伟
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 331-337.
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    凝溶胶蛋白(gelsolin)是凝溶胶蛋白超家族的成员之一,是一种重要的肌动蛋白结合蛋白,其通过切断、封端肌动蛋白丝,或使肌动蛋白聚集成核等方式来控制肌动蛋白的结构.凝溶胶蛋白除了在重组肌动蛋白丝中发挥作用以外,还在细胞运动、控制细胞程序性死亡等细胞活动中发挥重要的作用.此外,肿瘤细胞中凝溶胶蛋白的表达量也发生变化.凝溶胶蛋白的变异还是某些遗传疾病的基础.最近的研究发现,凝溶胶蛋白可以作为转录辅激活蛋白,促进雄激素受体的转录活性.本文对凝溶胶蛋白的结构特点、参与调节细胞的功能和机制及其研究现状进行概述.

  • 研究论文
  • 黄丽君,;李慧;刘晗;郭黎媛;高利波;刘新华;蔡望伟;李刚
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 338-343.
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    探讨FⅩⅢ A基因表达的分子机制.凝胶阻滞实验(EMSA)结果证明,FⅩⅢ A基因第1内含子5′区的前12碱基与转录因子结合并由此调控基因表达.FⅩⅢ A基因第1内含子第12位碱基由C突变为A(内含子1 (+12)C→A)导致与转录因子结合能力降低.构建不同的荧光素酶表达质粒Luc 1、Luc 2、Luc 3、Luc 4、Luc 5、Luc 6,并转染U937细胞和HepG2细胞.结果显示,如果Luc 5(具有最高表达活性)的内含子1(+12)由C突变为A,启动子活性显著降低.与Luc 5相比,突变后的Luc 5的活性分别下降了52.9%(U937, P<0.01)和47.6%(HepG2, P<0.01).将Luc 5与PN3 Sp1共同转染U937细胞和HepG2细胞后,Luc 5的荧光素酶活性分别提高了42.4%(U937,与Luc 5单独转染比较P<0.01)和54.9%(HepG2, 与Luc 5单独转染比较P<0.01),而突变后的Luc 5(Mut)与PN3 Sp1共同转染则没有明显的改变.表明转录因子Sp1在FⅩⅢ A基因表达的重要性.这些结果也表明,内含子在FⅩⅢ A基因表达过程中起重要作用,为遗传性凝血因子发病机理的研究提供了新的证据.

  • 黄耿青;许文亮;王秀兰;杜曼丽;李学宝
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 344-350.
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    从棉花cDNA文库中分离了3个编码富含甘氨酸蛋白(glycine-rich proteins, GRPs)的基因,分别命名为GhGRP1、GhGRP2、GhGRP3.推断的编码蛋白质的氨基酸序列都富含甘氨酸,甘氨酸含量超过40%.而且GhGRP1和GhGRP2蛋白质序列同源性高达99%,仅在C末端有1个氨基酸残基(Arg/Pro)的差别.这3个蛋白在富含甘氨酸区相互显示较高的同源性,GhGRP1与GhGRP2达到100%,而GhGRP2与GhGRP3达到45.1%,但它们与基因数据库中其它蛋白质的同源性很低.根据结构域的组织特点,将GhGRP1和GhGRP2归为C端富含半胱氨酸结构域(C-cysteine-rich )类GRP,将GhGRP3归为N端有信号肽的GRP. GhGRP1和GhGRP2都含有12个GGX (此处X代表P/W/F)重复,GhGRP3含有22个GGX(此处X代表A/F/V/L/T/P)重复.此外,它们还含有不同数量GX, GGGX等的重复.实时RT-PCR分析表明,GhGRP1在花药中优势表达.GhGRP2在10 dpa(day post anthesis)胚珠中表达最强,10 dpa纤维和下胚轴次之,而在花药、根和花瓣中表达量相对较低.GhGRP3在花药,根和下胚轴中表达量较高,而在子叶,花瓣、纤维和胚珠中表达较低.上述结果表明, GhPRP基因家族的不同成员可能分别在棉花不同组织细胞的发育过程中发挥作用.

  • 霍艳英;胡迎春;周乔丹;杨柳;张博;李刚;吴德昌
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 351-356.
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    多效生长因子(pleiotrophin,PTN指蛋白,Ptn指基因)是一种可同肝素结合的分泌性的生长/分化因子,具有刺激细胞粘附、迁移、存活、生长和分化等功能.我们前期研究发现,Ptn稳定沉默可以显著降低细胞的生长及成瘤能力.为进一步了解Ptn表达沉默后小鼠基因转录谱的变化,用小鼠表达谱芯片比较了对照及Ptn沉默细胞的基因表达差异.在检测的24 000个基因中,Ptn沉默后上调2倍以上的基因有240个,下调2倍以上的基因有129个.值得引起注意的是,在Ptn沉默的MEFs细胞中,同DDK综合症相关的基因家族,schlafen(Slfn)家族的Slfn 2、Slfn 3、Slfn 4以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族的Mmp 3、Mmp 10、Mmp 13表达均显著上调;而可促进内皮细胞运动,参与血管发生的基因angiomotin(Amot)表达显著下调.通过研究,获得了一系列Ptn沉默后表达变化的基因信息.

  • 朱应葆;韩云;孙艳
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 357-362.
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    用PCR介导的基因重组法敲除酵母RAD16基因, 用羟胺处理酵母RAD16基因表达质粒, 获得RAD16基因突变库,并将其转化RAD16基因敲除的酵母细胞. 用平皿复制法获得温度敏感突变株 rad16-ts2,经互补试验证实,该突变表型为RAD16基因突变所致.将人cDNA表达文库转化rad16-ts2后筛选温度敏感拯救(rescue)表型, 回收拯救表型酵母细胞中的质粒. 测序结果表明,所获得的人cDNA克隆为HLTF/Zbu1/SMACA3基因.比较分析显示,人类该基因编码蛋白质氨基酸序列与酵母Rad16的同一性为32%,相似性则达50%.人HLTF/Zbu1/MACA3基因在HeLa细胞中过表达,可显著抑制过氧化氢损伤和UV照射诱导的细胞凋亡.

  • 叶湘漓;李大力;钟志宏;雷立芳
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 363-369.
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    Netrins是与层粘连蛋白相关的、高度保守的小分子分泌蛋白家族成员,在细胞迁移和轴突导向活动中具有重要的作用,其同源物在多种模式动物中均已发现.Netrins分为2个亚家族:netrins和netrin-Gs;其中的netrin-G亚家族各成员之间具有高度的相似性.目前,在人类中得到确证的只有netrin-G1,推测在人类中应该还有其它的netrin-G亚家族成员以及编码它的基因.从20周龄人胚中提取脑组织的总RNA,用PCR cDNA文库试剂盒制备脑组织cDNA文库,再用特异性引物进行PCR扩增,得到1条人netrin-G的全长cDNA,命名为人netrin-G2,用Northern杂交研究其表达,用进化树分析其与netrin家族各成员间的关系;证实人netrin-G2确实为netrin-G亚家族的1个新成员,该基因位于染色体的9q34,大小为2 428 bp,含有1个1 593 bp的假定开放阅读框,起始密码子为86位的甲硫氨酸,终止密码子为1 678位的TGA,可编码1个大小为530个氨基酸的蛋白质;Northern杂交显示,人netrin-G2在脑组织中特异性表达,而在其它组织中却很少发现,推测人netrin-G2可能在中枢神经系统的发育过程中具有重要的作用,可能与刺激性神经冲动的传递以及神经调节有关.

  • 李积凤,;熊英;李延华;杨晓梅;陈鹏;江琪;安云庆;贺俊崎
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 370-374.
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    经过对蛋白质MAS的氨基酸序列进行分析、比对发现,其羧基末端含有一段高度保守的PDZ结合模序.据此推测,MAS通过此模序可能会与某些PDZ蛋白质发生相互作用.将MAS羧基末端27个氨基酸所对应的DNA序列,克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-MAS-CT.将重组质粒转入大肠杆菌BL21内,经IPTG诱导,并用glutathione-Sepharose 4B纯化,得到纯化的融合蛋白GST-MAS-CT.以GST-MAS-CT为饵蛋白,利用GST pull down方法,在兔脑组织中筛选与MAS特异结合的蛋白质.结果表明,在兔脑组织中有多种蛋白质可以与MAS-CT特异结合,经Western印迹检验其中之一为突触后致密物质-95 (postsynaptic density protein 95, PSD-95).PSD-95与MAS的相互作用的研究结果,为研究完整的MAS与PSD-95的相互作用以及这种相互作用对MAS受体的功能的影响奠定了基础.

  • 崔颖;李晓丽;梁明丽;陈海波;高颖;
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 375-381.
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    肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6-5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western 印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段(F6.5和F6-5/D),经谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B 纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段(F6.5)使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.
  • 秦永伟,,程纯,王海波,高永静,邵晓轶,沈爱国
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 382-387.
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    应用免疫荧光标记、基因转染等方法,观察脂多糖(LPS)刺激对单核细胞系Raw264.7细胞骨架的影响,探讨p38家族不同亚型对LPS诱导的细胞骨架蛋白微管蛋白与肌动蛋白变化的调控作用结果显示,未受LPS刺激的细胞富含微管蛋白,微管蛋白交联形成辐射状的交联丝网,丝网在细胞中分布均匀;LPS刺激后,微管蛋白募集在细胞膜、核膜周围;p38α、p38β、p38γ亚型的特异性抑制剂FHPI对LPS诱导的微管蛋白募集无影响,而p38无活性突变体p38δ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞骨架微管蛋白的募集;肌动蛋白在静息的细胞内主要存在于细胞膜周围,LPS作用后,肌动蛋白在细胞中形成广泛分布的辐射状应激纤维;p38上游激酶活性诱变体MKK6b基因转染可诱导Raw细胞形成类似的应激纤维,而p38γ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞应激纤维的形成.上述结果表明,p38δ可能参与了LPS诱导的微管蛋白的重构;而LPS诱导Raw细胞应激纤维的形成,可能是通过p38γ蛋白激酶而发挥作用.

  • 李素萍,,张惠,王健,施庆国;黄翠芬,陈亮,夏令,郭迟鸣,周建光
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 388-393.
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    建立稳定表达外源PC-1基因的人前列腺癌骨转移C4-2B细胞模型,初步探讨PC-1基因表达对前列腺癌发展的影响.通过脂质体介导的方法,将融合PC-1基因的真核表达载体pcDNA3.1PC-1稳定转染C4-2B细胞,Western 印迹和RT-PCR技术,分别从蛋白水平和RNA水平确定外源PC-1基因表达. MTT和软琼脂集落形成能力等一系列方法,研究PC-1基因的功能,RT-PCR和实时定量PCR检测前列腺癌发生发展相关基因表达的变化. 结果表明,PC-1基因的高表达能够诱导雄激素受体(AR)调控基因和一系列重要的信号通路成员基因PSA、PSMA、NKX31、Jagged1、EphA3、SGEF和 NOTCH3等表达发生变化. 实验结果初步证明,PC-1基因表达在晚期前列腺癌中,以及在雄激素非依赖的转变中可以发挥作用,PC-1基因表达可调控一些重要信号通路.对PC-1基因功能深入研究将有可能为发现新的前列腺癌的诊断治疗分子靶标提供线索.

  • 刘冠群,孔祥平,佟明华,李茹冰,陈文吟,游松
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 394-399.
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    心肌营养素是一种具有心肌保护功能的细胞因子.为鉴定人心肌营养素在体外具有促进受损大鼠心肌细胞存活的生物学活性,构建pQE-huCT-1表达载体,在大肠杆菌中表达重组人心肌营养素(rhCT-1);利用含有还原型及氧化型谷胱甘肽的复性体系,恢复变性蛋白的天然构象;通过MTT 法鉴定rhCT-1的促进受损大鼠心肌细胞存活的生物学活性.pQE-huCT-1在M15菌中得到高效表达,但95%的目的蛋白以包涵体形式存在;通过变性、复性及Ni-NTA纯化,得到纯度为90%的可溶性重组蛋白.利用无血清培养基培养新生大鼠心肌细胞,造成缺血损伤;利用低浓度阿霉素损伤大鼠心肌细胞,构建阿霉素损伤模型;通过加入rhCT-1治疗,发现rhCT-1具有明显的促进受损心肌细胞存活的作用;心肌细胞琥珀酸脱氢酶(SDH)活性随rhCT-1浓度的升高而增强,且呈显著的剂量依赖性关系;通过测定预防组和治疗组心肌细胞SDH和乳酸脱氢酶(LDH)活性,发现预防组较治疗组在促进细胞线粒体产生SDH和降低培养液上清LDH活性方面效果更加显著,说明rhCT1可能是在心肌细胞损伤早期通过抑制细胞凋亡而达到心肌保护作用的.本研究通过复性获得了可溶性rhCT-1,它在体外具有显著的促进受损心肌细胞存活的生物学活性.

  • 张琳,刘怒云,姜勇,李庆林,张璐
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 400-404.
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    应用免疫荧光标记、基因转染等方法,观察脂多糖(LPS)刺激对单核细胞系Raw264.7细胞骨架的影响,探讨p38家族不同亚型对LPS诱导的细胞骨架蛋白微管蛋白与肌动蛋白变化的调控作用结果显示,未受LPS刺激的细胞富含微管蛋白,微管蛋白交联形成辐射状的交联丝网,丝网在细胞中分布均匀;LPS刺激后,微管蛋白募集在细胞膜、核膜周围;p38α、p38β、p38γ亚型的特异性抑制剂FHPI对LPS诱导的微管蛋白募集无影响,而p38无活性突变体p38δ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞骨架微管蛋白的募集;肌动蛋白在静息的细胞内主要存在于细胞膜周围,LPS作用后,肌动蛋白在细胞中形成广泛分布的辐射状应激纤维;p38上游激酶活性诱变体MKK6b基因转染可诱导Raw细胞形成类似的应激纤维,而p38γ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞应激纤维的形成.上述结果表明,p38δ可能参与了LPS诱导的微管蛋白的重构;而LPS诱导Raw细胞应激纤维的形成,可能是通过p38γ蛋白激酶而发挥作用.

  • 何飞,吴书林,孙明,郭荣
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 405-409.
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    探讨抗MHC-Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)的核糖核酸酶P对Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用.M1-RNA 是核糖核酸酶P的催化活性单位.以pTK117质粒为模板,PCR扩增带有抗CⅡTA第452及629位点的引导序列的M1-RNA (M1-452-GS 及M1-629-GS),再分别插入pUC19载体(pUC19-M1-452-GS和pUC19-M1-629-GS).从Raji细胞中克隆CⅡTA基因DNA片段 (114~800)后插入pGEM-7zf(+)质粒.将重组M1-RNA与靶基因的mRNA进行细胞外共孵育,显示仅pUC19-M1-629-GS可特异性地切割靶基因mRNA.再将M1-629-GS克隆入psNAV载体(pA629)并稳定转染Daudi细胞株,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平,流式细胞术检测其HLADR、DP、DQ抗原表达.与对照组比较,M1-629-GS阳性Daudi细胞的CⅡTA mRNA含量减少90.19%(P<0.05),其HLADR、DP、DQ抗原表达分别降低91.97%、90.19%、92.36%(P<0.05).研究表明,抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通过抑制CⅡTA 的转录而降低Daudi细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的表达.

  • 邢伟,王彪,郝凤进,许金华,赵岩,刘素媛,时利德
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 410-414.
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    通过研究慢性铝暴露对大鼠学习记忆和海马长时程增强 (long-term potentiation, LTP) 的影响,并检测海马神经元蛋白激酶C(protein kinase c, PKC) 活性及Ca2+钙调蛋白激酶Ⅱ(Ca2+calmodulin dependent protein kinase Ⅱ, CaMK Ⅱ) 和神经颗粒素(neurogranin, Ng) 蛋白表达的变化,探讨铝暴露损害学习记忆的作用机制.选用断乳后 Wistar 大鼠,以含有不同浓度 AlCl3 的蒸馏水进行饲养.3 个月后,测定铝暴露组大鼠脑内和血中的铝含量;测量记录大鼠海马群体峰电位(population spike,PS)LTP;用改良 Takai 法测定海马神经元 PKC 活性变化;Western 印迹法检测 CaMK Ⅱ和Ng的蛋白表达.结果显示,与对照组相比,铝暴露组的 PKC 活性降低,差异有统计学意义 (P<0.01);与对照组相比,铝暴露组的CaM Ⅱ蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,铝暴露组的 Ng 蛋白表达降低,且差异有统计学意义(P<0.05).实验结果说明:慢性铝暴露可以降低大鼠海马神经元 PKC 的活性及 Ng 和 CaMKⅡ 的蛋白表达,可能影响 Ng 磷酸化水平,从而影响 CaM 与 Ng 之间的亲和性,也影响 Ca2+CaM 对 CaMKⅡ 的调节,抑制 LTP 的形成,损害学习记忆的功能.

  • 刘欣毅,张惠展,袁勤生
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 415-418.
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    为了发展基因突变技术,介绍一种新型的基因定点突变方法.该方法巧妙利用了基因序列中广泛存在的不完整的平端酶切位点.与传统方法相比,可以迅速地在全基因的任何部位替换核苷酸,并可以在突变实验过程中直接将目的基因克隆到T载体上,便于测序及进一步克隆.利用该方法成功地获得了DdsA(decaprenyl diphosphate synthase,十聚异戊二烯焦磷酸合成酶)在4个氨基酸位点上的19个变体酶.这些位点分布在基因的不同区域内.证明这种新方法的高效性.

  • 技术与方法
  • 陈琦,曹慧,张海燕,高晓飞,李厚达
    中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(05): 419-422.
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    为鉴定MNSs血型单克隆细胞株6D7C9分泌的抗体类型,通过克隆、亚克隆、细胞转染等分子生物学技术建立了血型糖蛋白GPA、GPB的异源表达系统,并将其作为抗原,通过ELISA、Western 印迹法确定6D7C9分泌的McAb.结果显示,RT-PCR技术成功克隆获得了GPA、GPB血型糖蛋白编码基因,通过分别构建其重组逆转录病毒表达载体pEGZ/GPA及pEGZ/GPB,转染包装细胞293T,再感染L929细胞,经zeocin筛选2周后,RTPCR及流式细胞仪分析证实,L929/GPA和L929/GPB转基因细胞中分别有GPA、GPB目的基因的转录和蛋白表达.用稳定高表达GPA、GPB的转基因细胞通过ELISA和Western 印迹法证实单克隆细胞株6D7C9分泌的是抗GPA/GPB McAb.本研究成功地建立了血型糖蛋白GPA、GPB的异源表达系统,为MNSs血型McAb的检测及GPA、GPB蛋白的功能学研究奠定了基础.