中国生物化学与分子生物学报

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朱颖，于文功，路新枝*

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 597-603.

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核酸适体（nucleic acid aptamer）是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出的特异性与靶物质高度亲和的核酸分子,包括DNA适体和RNA适体. 体外获得核酸适体的方法称为指数富集配体系统进化技术，即SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）. 在SELEX技术获得的核酸适体中，RNA适体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点. 同时，相比传统抗体，RNA适体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性. 因此，RNA适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景. 本文综述了RNA适体的产生、特点、作用方式、优势与局限性，并详细介绍了其在医药研究领域的应用.

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组蛋白去乙酰化酶抑制剂对DNA双链断裂修复路径的作用

孙有湘，周克元，李莉萍

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 604-611.

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DNA双链断裂(double strand breaks, DSBs)对细胞生存是致命的.细胞内非同源末端连接(NHEJ)、重组修复(HDR)、单链退火修复(SSA)和微同源序列末端连接(MMEJ)等通路可竞争性修复DNA双链断裂损伤.在肿瘤细胞DNA中制造难以修复的基因损伤,诱导肿瘤细胞周期中止、坏死和凋亡是临床放、化疗的主要策略.组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase）作为抗肿瘤治疗的新靶标，其抑制剂(histonedeacetylase inhibitors, HDACi)可显著降低肿瘤细胞DSBs修复能力，增强肿瘤细胞的放、化疗敏感性.研究显示，HDACi抑制了肿瘤细胞中具有正确修复倾向的HDR和经典NHEJ通路，具有错误修复倾向的SSA和MMEJ路径也可能牵涉其中.目前，HDACi作用于DSBs修复通路的分子机制已取得较大进展，但仍有许多问题有待阐明.

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非核糖体肽合成酶的末端硫酯酶与多肽环化

方剑，朱鹏，严小军

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 612-618.

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非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）能以多载体巯基化模板机制合成各种结构复杂、种类繁多的次生代谢非核糖体环肽.根据环肽末端环化的方式，可分为两大类：大环内酯型和内酰胺型.负责非核糖体环肽最终环化的硫酯酶（thioesterase，TE）属于α/β水解酶超家族.该家族包括：脂酶、蛋白酶、酯酶等，其共有特征是含有保守的催化三元件（Ser-His-Asp），起到终止反应和释放产物的功能. TE具有区域定向性（regiospecific）、化学定向性（chemospecific）及立体定向性（stereospecific）的特点，在非核糖体肽（nonribosomal peptide，NRP）的合成反应中具有决定性作用，直接影响到最终环肽的生成. 同时，TE由于其特有的环化和水解的双重活性，在体外的线性多肽环化中越来越受到众多学者的关注. 综合国内外相关文献，本文着重从TE介导下的产物释放机制和影响因素两个方面综述非核糖体末端硫酯酶的研究进展及其应用.

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Rho小G蛋白介导的细胞周期调控

范丽菲, 闫慧娟, 莫日根

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 619-628.

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Rho小G蛋白作为一个信号分子家族具有多样化的功能, 可以调节细胞骨架重排、细胞迁移、细胞极性、基因表达、细胞周期调控等. Rho小G蛋白家族对细胞周期调控的研究主要集中在其对于有丝分裂期细胞的调节作用，包括调节有丝分裂期前期细胞趋圆化、后期染色体排列及收缩环的收缩作用.近期的研究显示,Rho小G蛋白及其效应分子对于细胞周期G1、S、G2期的调控主要是通过影响细胞周期的正调控因子细胞周期蛋白D1 (cyclin D1) 和负调控因子细胞周期蛋白依赖型激酶相互作用蛋白1及细胞周期蛋白依赖型激酶抑制蛋白27 (p21cip1/p27kip1) 进行的.本文总结了Rho小G蛋白及其效应分子在细胞周期调控,尤其是对G1/S期调控的研究进展，并简要阐述了Rho小G蛋白介导的细胞周期调控异常与癌症发生的关系.

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单羧酸转运体在肿瘤中的功能

杨德志, 张学娇, 阿拉坦高勒

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 629-635.

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单羧酸转运体 (Monocarboxylte Transporters，MCTs)属于溶质运载蛋白家族（Solute carrier family，SLC）SLC16A亚家族成员.目前已发现该家族有14个成员；研究表明，MCTs具有偶联转运细胞新陈代谢中产生的单羧酸与质子的功能. MCTs在肿瘤组织中表达普遍增高，肿瘤细胞是以糖酵解代谢方式获取能量，该过程中产生的大量乳酸被MCTs运出胞外，以保护细胞免因酸中毒诱发细胞凋亡;细胞外乳酸也能被肿瘤细胞摄取和利用.由于肿瘤组织的血管不发达，使肿瘤细胞内外的乳酸堆积，导致肿瘤细胞存活在缺氧和酸性微环境中，MCTs对此种环境中肿瘤细胞的存活与转移发挥重要作用.因此，研究肿瘤细胞和正常组织中MCTs的差异性表达及其机制，以及MCTs活性的调控机制，对于认识肿瘤细胞在缺氧和酸性微环境中存活与转移规律具有重要意义，并为肿瘤的治疗提供新的分子靶标.本文将对肿瘤中MCTs的功能研究的最新进展进行综述. 同时，结合我们的研究，提出了一些见解.

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ASPP2以p53非依赖形式促进自噬引起Hep3B细胞凋亡

刘凯, 王安娜 ,姜涛, 温韬, 殷继明, 刘道洁, 乔录新, 石英, 李莉, 李宁 ,陈德喜

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 636-642.

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p53凋亡刺激蛋白2（apoptosis stimulating protein 2 of p53, ASPP2）能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡的功能，进而发挥抗肿瘤作用. 本室前期研究发现，ASPP2可以通过p53-DRAM自噬途径诱导细胞凋亡. 在本研究中，利用ASPP2 腺病毒感染Hep3B细胞(p53缺陷型肝癌细胞系)并用甲基磺酸(MMS)处理后; Calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡;GFP-LC3质粒转染细胞后检测自噬; 荧光定量PCR和免疫印迹检测自噬基因表达. 结果表明,ASPP2在p53缺陷的Hep3B细胞内可诱导发生凋亡;在MMS存在和缺失条件下, Adr-ASPP2均引起自噬体水平升高及自噬基因的表达增加,且MMS协同Adr-ASPP2能使自噬水平增加; 进一步用VPS34 siRNA和DRAM siRNA抑制自噬发现，细胞凋亡水平下降, 说明由Adr-ASPP2诱发经损伤相关自噬调节蛋白（ DRAM）介导的自噬参与了肝癌细胞系凋亡的发生. 综上结果表明，ASPP2可以通过非p53依赖的DRAM介导自噬，并促进肝癌细胞凋亡. 该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.

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组蛋白激活拟南芥CDPK催化CaMBP10的体外磷酸化反应

王立强, 田晓龙, 赵静 ,胖铁良, 李翠凤

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 643-648.

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植物转脂蛋白 (plant lipid transfer proteins, LTPs) 是高等植物中广泛存在的多基因编码的小分子碱性蛋白. 本研究室已经证明白菜和豌豆LTPs可分别被内源胞浆可溶性和膜结合钙依赖性蛋白激酶 (calcium-dependent protein kinase, CDPK) 磷酸化. 为深入研究CDPK对白菜钙调素结合蛋白10 (calmodulin-binding protein-10, CaMBP10) 的磷酸化性质及特征, 本文从拟南芥可溶性蛋白粗提物中检测到1个分子量约为54 kD的CDPK对CaMBP10有磷酸化作用. 研究表明, 组蛋白可增强 CDPK对CaMBP10的磷酸化活性, 促进磷酸化进程. 而且组蛋白和Ca2+对CDPK具有协同调节效应, 二者共同作用时比Ca2+单独作用时, 激酶的活力增强约12倍. 此外, 不同组蛋白对CDPK的激活能力不同, 组蛋白1对该激酶活性的激活能力要比组蛋白3高约8倍.

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转脂蛋白CaMBP10的胶体金标记及对白菜中CaMBP10结合蛋白的鉴定

胖铁良, 赵静, 田晓龙, 王立强, 李翠凤

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 649-654.

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植物转脂蛋白 (LTP)是一类广泛存在于高等植物中的空间结构高度保守的碱性小分子蛋白，其确切功能和调节机制至今仍不清楚.本室从白菜中分离的钙调素结合蛋白10 (CaMBP10)，经序列分析被鉴定为植物转脂蛋白家族成员.近期研究结果表明，CaMBP10 参与了植物的生物与非生物胁迫反应.为了深入探讨CaMBP10的抗性机制，确定植物中与其相互作用的蛋白质，本文拟建立胶体金标记CaMBP10 的方法，通过凝胶覆盖分析，检测植物样品中的CaMBP10 结合蛋白为此，对标记反应的最适条件进行了优化，确定最佳条件为：交联剂戊二醛用量为0.034%，交联反应pH值为7 .0，交联反应时间为40 min，胶体金颗粒度为10 nm，胶体金溶液的pH为7.0. 本文确定建立了植物样品中CaMBP10结合蛋白的分析与鉴定方法.

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β-甘露聚糖酶末端残基变体对其酶学特性的影响

唐存多, 李剑芳, 邬敏辰, 魏喜换, 赵梅

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 655-660.

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本研究用宇佐美曲霉Aspergillus usamii的5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A为母本，借助同源建模、分子对接及分子动力学模拟等理性设计方法，将AuMan5A的N-末端和C-末端分别截去3个无规则的氨基酸残基，构建出截短的β-甘露聚糖酶 AuMan5A^N3C3.将AuMan5A和AuMan5A^N3C3的编码基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达，对表达产物进行了初步纯化并分析比较了其酶学特性及各自的表达水平. 结果表明，reAuMan5A和reAuMan5A^N3C3的最适温度Topt均为70 ℃，reAuMan5A^N3C3在60 ℃的半衰期t_1/2⁶⁰为38 min，较reAuMan5A（t_1/2⁶⁰=40 min）略有降低；在相同表达条件下，reAuMan5A^N3C3上清液的β-甘露聚糖酶活性为73.4 U/mL，较reAuMan5A 的52.8 U/mL提高了39.0%；纯化的reAuMan5A^N3C3酶比活性为182.7 U/mg protein，较reAuMan5A的126.3 U/mg protein提高了44.7%. 与reAuMan5A相比，reAuMan5A^N3C3对角豆胶的Km值下降不明显，Vmax值有显著提高.

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Rho激酶抑制剂Y-27632对C3H10T1/2细胞增殖与成脂分化的作用

王新鲁1),2), 姬云涛2), 屈长青2)*

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 661-666.

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探究Rho激酶抑制剂Y-27632对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）C3H10T1/2增殖和成脂分化的影响.实验分为对照组、成脂诱导组和Y-27632处理组（Y-27632+成脂诱导）. 利用MTT检测细胞增殖情况，油红O染色,异丙醇萃取法检测细胞成脂分化情况，半定量RT-PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activiated receptor γ, PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白α (CCAAT enhancer binding protein α, C/EBPα)基因表达. 结果表明，Y-27632能够显著抑制C3H10T1/2细胞的增殖(P<0.05)，并呈一定的浓度依赖性；高浓度Y-27632对C3H10T1/2细胞成脂分化具有显著抑制作用（P<0.05）；半定量RT-PCR结果显示，成脂诱导处理组PPARγ和C/EBPα表达量在第3 d、5 d和7 d显著低于成脂诱导组（P<0.05）. 综上所述，Y-27632能够抑制C3H10T1/2细胞增殖与成脂分化.

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淫羊藿苷促进体外培养骨髓间充质细胞成骨性分化活性强于蛇床子素

周建，葛宝丰，陈克明*，马小妮，郭晓宇，成魁，高玉海，闫娟丽，石文贵

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 667-673.

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比较研究蛇床子素与淫羊藿苷处理对体外培养的大鼠骨髓间充质细胞(rat bone marrow stromal cell, rBMSC)成骨性分化的影响.从体外分离培养的大鼠骨髓间充质细胞，筛选出最佳的蛇床子素和淫羊藿苷处理的浓度为1×10-5 mol/L, 然后用最佳的浓度对体外培养的大鼠骨髓间充质细胞进行药物干预；在药物干预后的第3、6、9、12和15 d后测定碱性磷酸酶活性（alkaline phosphatase，ALP）和钙含量；第12 d 进行钙化结节茜素红染色；第12 h、24 h、48 h、72 h和96 h 对OXS、Runx-2、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP-2)和collagen-I mRNA 表达水平进行real-time RT-PCR检测.结果显示，浓度为1×10-5 mol/L蛇床子素和淫羊藿苷干预均可提高体外培养的骨髓间充质细胞ALP活性，增加Ca含量，提高Runx、OXS、BMP-2和collagen-1 mRNA的表达水平.同时,淫羊藿苷在促进体外培养骨髓间充质细胞成骨性分化活性强于蛇床子素.

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NK4拮抗HGF促进肿瘤细胞凋亡的生物学效应

郑筱娇, 高洲, 沈蓉蓉, 岑东, 裴仁治, 罗建平, 吕建新

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 674-681.

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观察NK4通过拮抗肝细胞生长因子（HGF）诱导不同肿瘤细胞凋亡，研究其生物学作用及分子机制.以足叶乙甙（VP-16）诱导凋亡，分别或经HGF蛋白、NK4蛋白处理5种肿瘤细胞（B细胞淋巴瘤细胞系Raji、人急性粒细胞白血病细胞系HL-60、宫颈癌细胞系HeLa、前列腺癌细胞系PC-3、非小细胞肺癌细胞系A549），采用流式细胞术（FCM）、吖啶橙 (AO) 染色法、苏木素伊红（HE）染色法定量观察5种肿瘤细胞的凋亡情况，并进行相关分析. FCM发现，经VP-16处理5种肿瘤细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.001)，而HGF+VP-16组凋亡率明显下降(P<0.01)，HGF+NK4+VP-16组细胞凋亡率均明显高于HGF+VP-16组(P<0.05). AO染色和HE染色结果也证实，5种肿瘤细胞经VP-16处理后凋亡率均显著增高 (P<0.001，P<0.001)，而HGF+VP-16组细胞凋亡率均明显低于VP-16组(P<0.001,P<0.01)， HGF+NK4+VP-16组细胞凋亡率均明显高于HGF+VP-16组(P<0.001，P<0.05).此外，发现NK4+VP-16组、HGF+ NK4+VP-16组、VP-16组等3组间凋亡率无统计学差异(P>0.05). 以上结果提示，HGF蛋白可抵抗凋亡诱导剂VP-16的作用, 明显降低细胞凋亡；NK4通过竞争性抑制HGF从而促进肿瘤细胞的凋亡，具有潜在的肿瘤治疗价值.

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利用RT-LAMP技术鉴别伤寒沙门菌

樊粉霞, 阚飙，闫梅英*

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 682-689.

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分子生物学诊断技术是用于检测伤寒沙门菌的重要辅助手段，但由于需要较好的实验设备和条件使其应用与发展受到限制, 所以建立简捷的检测平台显得尤为重要.逆转录环介导等温核酸扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）方法目前用于病原微生物的检测发展迅速，此方法相对简单、快速. 本研究针对伤寒沙门菌 STY3671 基因设计6条特异性引物，通过优化反应条件，建立了检测该靶基因的RT-LAMP方法. 利用伤寒标准菌株CT-18及其血模拟标本，研究了该方法的特异性及灵敏性，并与rRT-PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)方法的敏感性进行比较. 结果显示：等温65 ℃条件下，30～60 min内可完成RT-LAMP检测反应，利用该方法检测134株伤寒沙门菌均为阳性，其余47种检测菌株均扩增阴性.在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中，敏感性达7 cfu/mL，比rRT-PCR检测低限高10倍. 本研究结果表明：我们建立的敏感性高、特异性好的RT-LAMP检测血液中伤寒沙门菌的方法，为伤寒沙门菌感染的快速诊断提供了简便的手段，可用于对伤寒的早期诊断、预防控制及临床治疗.

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小麦旗叶高纯度质膜的提取及蛋白质组学双向电泳体系的建立

宋齐鲁**, 王书平**, 张改生*, 陈征 ,郭佳林 ,车会学

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(7): 690-697.

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以生长到Feekes 8.5时期小麦旗叶为试验材料，通过差速离心结合两相法提取并纯化质膜蛋白，进而在裂解液选择、SDS-PAGE胶浓度及蛋白质上样量等方面对质膜蛋白质双向电泳体系进行了优化.结果表明，采用6.4% PEG 3 350/Dextran T-500 (W/W)两相体系可以获得纯度高达87.9%质膜微囊. 经TCA-丙酮法裂解蛋白，以12% SDS-PAGE分离胶对900 μg质膜蛋白进行双向电泳，在2-DE图谱上可分辨出173个蛋白点. 建立了一套用于小麦旗叶高纯度质膜的提取方法及其蛋白质组学双向电泳体系.

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