中国生物化学与分子生物学报

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王志芳安建梅孔建强

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 197-206.

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自从绿色荧光蛋白(GFP)被发现以来，荧光蛋白在生物医学领域已经成为一种重要的荧光成像工具．随着红色荧光蛋白DsRed的出现，各种优化的DsRed突变体和远红荧光蛋白也不断涌现．其中荧光蛋白生色团的形成机制对改建更优的荧光蛋白变种影响很大，对于红色荧光蛋白而言，大多数的红色荧光蛋白的生色团类型为DsRed类似生色团，在此基础上又出现了Far-red DsRed类似生色团．目前，含DsRed类似生色团的荧光蛋白主要有单体红色荧光蛋白、光转换荧光蛋白、斯托克斯红移蛋白、荧光计时器等．这些优化的荧光蛋白作为分子探针可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪，已经在生物工程学、细胞生物学、基础医学领域得到广泛应用．本文综述了含DsRed类似生色团的荧光蛋白的研究进展及其应用，以及由此发展起来的远红荧光蛋白在活体显微成像技术中的应用，并展望了荧光探针技术研究的新方向．

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MicroRNA靶基因的高通量鉴定方法

陈灵锋张钧平王明席

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 207-212.

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MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码小RNA，可在转录后水平调节基因的表达, 在细胞生长、发育、疾病发生等过程中发挥着重要作用. 明确miRNAs所调控的靶基因对阐明miRNAs的功能及在各种生命过程和疾病发生机制的角色非常关键.目前，鉴定miRNAs的靶基因的方法主要计算机预测方法和生物学实验方法.前者对miRNA靶基因的寻找作出巨大贡献，但常存在很多假阳性，必须通过生物学实验方法加以验证.后者涉及单靶基因鉴定技术和高通量多靶基因鉴定技术，高通量技术又包括基因芯片分析技术、蛋白质组学分析技术、RNA连接酶介导的cDNA末端扩增技术和生物化学法等.本文主要对这些高通量技术的应用、优劣进行归纳，并对其改进方向予以讨论.

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脂氧素——抗组织纤维化的新药物

余忠建周晓燕闵卫平

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 213-217.

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组织纤维化是器官组织内纤维结缔组织增多而实质细胞减少的一类疾病，组织损伤导致的慢性炎症反应是纤维化形成的根本原因. 脂氧素是体内重要的内源性促炎症消退介质，兼具抗炎和促炎症消退双重作用，对多种炎症细胞和炎症相关基因有显著的负性调节作用，为炎症反应的重要“刹车信号”. 脂氧素可以促进炎症及时消退而防止其蔓延为慢性炎症，因此，它极有可能在抑制纤维化的形成中起到至关重要的作用.近年来，随着对脂氧素研究的不断深入，其抗纤维化作用日益凸显，成为极有价值的抗纤维化潜在药物.

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植物叶绿体分裂的分子机制

谌志伟胡勇

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 218-225.

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叶绿体是植物细胞内一种重要的细胞器．它不仅是光合作用的场所，还是其它多种中间代谢的场所．叶绿体起源于蓝细菌，与其原核祖先类似，通过二分裂方式进行增殖．最近的研究表明，叶绿体的分裂装置包含原核起源和真核起源的蛋白质，它们在叶绿体的内膜内侧和外膜外侧协同作用以完成叶绿体的分裂．在过去十几年里，包括丝状温度敏感蛋白Z（FtsZ）、Min系统蛋白、质体分裂蛋白（PDV）和ARC蛋白等在内的多个叶绿体分裂相关组分被分离鉴定．本文简要介绍了叶绿体分裂装置各成员的发现、叶绿体被膜的收缩和叶绿体分裂位点的选择机制．另外，植物发育过程中叶绿体分裂可能受到细胞的控制，但目前对细胞如何调控叶绿体分裂知之甚少．本文对该领域的最新研究进展也进行了综述．

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立枯丝核菌遗传多样性研究方法介绍

王利红姜华王艳丽孙国昌

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 226-233.

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立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）是一个集合种，遗传多样性丰富.关于遗传多样性的研究一直是R. solani研究的热点.本文就用于R. solani遗传多样性研究的方法进行了综述.分别解释并阐述了各种方法的优缺点，其中菌丝融合法是研究R. solani遗传多样性的传统方法，该法需借助显微镜且耗时耗力；同工酶法简便、高效、低廉，但常需要与其它方法联用；脂肪酸法操作难度小，价格相对较低，但该法受菌株生长状况和脂肪酸脂化方法的限制；分子标记法方法众多，各有利弊，通过比较发现rDNA-ITS是研究R. solani遗传多样性比较合适的方法.本文还介绍了不同方法在R. solani遗传多样性研究中的具体应用.

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人mRNA输出因子Gle1与肽链释放因子相互作用上调HeLa细胞中蛋白质翻译终止活性

刘欢欢张志云王软林梁爱华

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 234-241.

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Gle1蛋白是一种mRNA核输出因子. 最近有研究报道Gle1蛋白参与了酿酒酵母的蛋白质翻译终止过程. 为了探讨Gle1蛋白是否在其它生物中也具有同样的功能, 本研究利用酵母双杂交、免疫共沉淀以及免疫共定位等方法证实了人Gle1蛋白与参与蛋白质合成终止的两类肽链释放因子均能够相互作用, 提示hGle1蛋白可能在人细胞中参与了蛋白质的翻译终止过程. 进一步在HeLa细胞中利用双荧光素酶报告系统分析人Gle1蛋白对蛋白质翻译终止的影响,结果显示, hGle1的过表达能促进细胞内蛋白质的翻译终止. 为进一步探讨hGle1蛋白在蛋白质合成中的作用机制奠定了基础.

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Rhodococcus sp. R04 BphD催化C-C断裂的动力学分析

杨秀清高冲沈翀李鹏丽

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 242-249.

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2-羟基-6-氧-6-苯基己-2，4-二烯酸水解酶（BphD）是一种多氯联苯微生物降解途径中的关键酶. 本文通过紫外-可见光光谱分别对突变酶S110A和H265A催化过程中酶-底物复合物进行检测，同时利用停流光谱技术对BphD及其突变酶（S110A、H265A和W266A）催化底物2-羟基-6-氧-6-苯基己-2，4-二烯酸（HOPDA）前稳态动力学进行了研究.结果表明，在BphD催化C-C断裂过程中，产物2-羟基戊-2，4-二烯酸（HPD）迅速生成，其速率常数为22 S-1. 底物的消耗（速率常数，22022 S-1和803 S-1）及酶-底物复合物的变化（速率常数，55556 S-1和664 S-1）表明该酶催化过程包括2个动力学阶段：快速底物酮基化作用和C-C键断裂过程.紫外-可见光光谱扫描结果显示，在突变酶S110A的催化过程中，酶-底物复合物在492 nm及510 nm处有最大光吸收，而在突变酶H265A催化中，却没有相似的光吸收，只是在480 nm产生1个新肩峰. BphD及其突变酶S110A、H265A和W266A动力学分析表明，Ser-110主要负责底物C-C键断裂；His-265负责底物由烯醇式向酮式转变，并且与Ser-110和Trp-266共同参与了随后的C-C键断裂过程. 结果揭示，除了传统的催化三联体（Ser-110，Asp-237，His-265）外，Trp-266在该水解酶催化反应中也发挥非常重要的作用，这一发现丰富了C-C水解酶的反应动力学机制.

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早期胃腺癌原代细胞适配子的筛选与鉴定

郭鹏习静张雪燕姚海燕马驰马鑫杨敏冯慧婷侯纯荣徐先云韩跃武

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 250-256.

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胃腺癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，由于没有针对早期胃腺癌有效的诊断方法，目前胃腺癌手术治疗还主要针对中晚期患者，预后差. 本文应用cell-SELEX技术，筛选早期胃腺癌原代细胞的适配子，为早期胃腺癌的诊断提供新的思路. 从早期胃腺癌组织中分离得到早期胃腺癌原代细胞，应用体外合成全长88 bp中间含52 bp随机序列的单链DNA文库，通过对PCR扩增条件的优化，借助生物素-链霉亲和素磁珠系统，经cell-SELEX反复筛选，可获得针对早期胃腺癌原代细胞的特异性适配子.经12轮cell-SELEX筛选，ssDNA文库与早期胃腺癌原代细胞的亲和力由1 560上升到4 336，表明亲和力较高的适配子得到逐步富集. 经克隆和测序，应用软件分析可知，30个克隆子中编号为C17和C27的2个序列完全一致，具同源性，二级结构预测可知单链DNA形成不同的茎环结构可能是适配子与早期胃腺癌原代细胞作用的结构基础. 特异性分析显示，胃腺癌原代细胞组与正常胃粘膜上皮细胞、空白对照组之间荧光强度值差异非常显著（P＜001）；正常胃粘膜上皮细胞组与空白对照组之间差异不显著（P＞005）. 经亲和力测定，各适配子与早期胃腺癌原代细胞的解离系数达到nmol/L，具有很高的亲和力.利用cell-SELEX技术成功筛选到早期胃腺癌原代细胞的适配子，为胃腺癌的早期诊断与治疗药物靶点方面的研究奠定了实验基础.

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酪氨酸磷酸酶PRL-3增加胃癌细胞BGC823的SP细胞比例并提高其对化疗药物的耐受性

宋倩孟麟曲立科廉沈沂寿成超

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 257-263.

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蛋白酪氨酸磷酸酶PRL-3是近年发现的蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员，能促进肿瘤细胞的侵袭、转移及上皮细胞间质转型，提示PRL-3可能在肿瘤发生发展及诱导肿瘤干细胞生成中发挥重要作用.由于侧群(SP)细胞具有许多干细胞的性质，SP细胞分选是目前筛选和分离获得干细胞或前体细胞常用的有效方法.为探讨PRL-3在诱导干细胞生成中的潜在作用，本文在建立过表达PRL-3的人胃癌细胞BGC823的基础上，通过SP分选和CCK-8的方法分析PRL-3对BGC823细胞中SP细胞的比例以及对化疗药物耐受性的影响.结果提示，高表达PRL-3提高BGC823中SP细胞的比例（2.5% vs 9.4%），同时增加BGC823对化疗药物紫杉醇和顺铂的耐受性（相对于对照细胞，其耐药指数分别为1.75和1.29）.由于SP细胞的产生和细胞耐药性的提高与ABC家族基因表达水平上调密切相关,通过定量 RT-PCR和Western印迹检测发现，PRL-3能上调ABCB1和ABCG2的表达.上述研究结果表明，PRL-3有可能通过上调ABCB1和ABCG2的表达，增加胃癌细胞BGC823的SP细胞比例并增加其对化疗药物的耐受性.

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槲皮素诱导Hep G2自噬与胞内游离Ca2+浓度的变化相关

罗亚男崔晓东白崇志李玉英王转花

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 264-269.

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槲皮素具有诱导细胞自噬、抑制肿瘤细胞增殖等抗癌功能，但其诱导细胞自噬的分子机制还不太清楚. 本文通过激光共聚焦显微镜观察槲皮素对Hep G2细胞自噬的影响; Fluo-3 AM和Cyto-IDTM Green Detection Reagent染色标记, 流式细胞术测定了槲皮素对Hep G2细胞内游离钙离子浓度［Ca2+］_i及Ca2＋螯合剂BAPTA-AM对自噬水平的影响. 探讨了槲皮素诱导人肝癌细胞 Hep G2自噬过程中［Ca2+］i的变化. 结果表明, 在槲皮素较低浓度范围内(0 ～ 50 μg/mL), 可明显抑制Hep G2细胞增殖, 并以剂量依赖方式诱导细胞自噬. 同时发现,槲皮素刺激Hep G2细胞可使［Ca2+］i明显增加, 进而促进自噬. 而当胞内Ca2＋螯合剂 BAPTA-AM存在时, 细胞的自噬水平受到一定的抑制. 这些结果表明，细胞内［Ca2+］i的升高可促进自噬, ［Ca2+］_i 的降低可能会抑制自噬. Hep G2细胞自噬与细胞内游离钙离子浓度的变化有关系.

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Wnt-5a抑制上皮性卵巢癌中β-catenin和MMP-26的表达及肿瘤细胞的迁移

刘伟，谯时文，杨文利，扈清云

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 270-275.

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Wnt-5a是Wnt信号转导途径中一个重要的成员，可影响Tcf/Lef转录因子，调控特定基因的表达．令人费解的是，它在不同肿瘤中具有截然不同的促进或抑制肿瘤作用．目前关于Wnt-5a在卵巢癌中的表达与功能尚不十分清楚．免疫组织化学检测显示，Wnt-5a在卵巢癌组织中的表达低于正常卵巢组织．蛋白质免疫印迹法检测揭示，Wnt-5a在卵巢癌细胞株A2780中表达低于正常卵巢细胞株TC-1，不同浓度Wnt-5a作用下 A2780细胞内β-catenin表达降低．实时荧光定量PCR检测mRNA揭示，不同浓度Wnt-5a作用下A2780细胞内β-catenin和MMP-26表达降低．细胞划痕、Tanswell法显示，Wnt-5a可抑制A2780细胞迁移．本研究结果提示，Wnt-5a在卵巢癌中扮演抑制肿瘤的角色，与抑制β-catenin和MMP-26表达、肿瘤的细胞运动能力有关．

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不同数量的2kDa富苯丙氨酸的碱性短肽（BOP）和乙醇酸氧化酶结合

徐杰陈雪敏

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 276-284.

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乙醇酸氧化酶（GO）只含40 kD亚基却具有多个等电点（pI）.我们曾报告GO含40 kD酸性亚基和68 kD碱性亚基，组成3种GO同工酶［1~6］.后来证实，68 kD亚基由14个2 kD富苯丙氨酸的碱性短肽（BOP）和40 kD亚基组成［7］.现在进一步证实，不同数量的BOP和乙醇酸氧化酶结合，组成多种GO-BOP复合体GC.这些复合体具有不同的pI、乙醇酸氧化酶活性和吸收曲线，但SDS-PAGE和免疫反应相同.在低电压和短时间的醋酸薄膜电泳中，GO和BOP不会解离，GC呈现强碱性（pI>10.0）；在高电压的毛细管等电聚焦电泳(cIEF)中，GO和BOP发生不同程度解离，导致GC不聚焦，或聚焦为不同带，pI为7.4/6.8/6.2/5.3.BOP存在于各种动植物和微生物以及血纤维蛋白原中.

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HBV DNA环化结构在体外的复制表达水平优于HBV线性结构的表达质粒

马其欢杜茜龚旭阳胡接力黄爱龙蔡雪飞

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 285-289.

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为了研究乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA环化结构与HBV线性结构的表达质粒在体外复制表达水平的差异，采用3种含有HBV全长DNA的表达质粒与自连环化的HBV DNA分别转染Huh7细胞. 5 d后收集转染处理过的Huh7细胞和细胞上清，从感染细胞中抽提纯化HBV复制中间体进行Southern印迹分析，并将细胞培养上清进行ELISA分析.结果显示，HBV DNA通过环化后转染Huh7细胞，可高效地进行转录和复制表达，且优于质粒转染的效果.证明在细胞中，HBV DNA环状结构的复制表达能力优于HBV线性结构的表达质粒.

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检测瓜氨酸和非对称二甲基精氨酸的化学发光方法

张明赵志敬屠慧惠沈文婷王学忠胡广

中国生物化学与分子生物学报. 2013, 29(3): 290-297.

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非对称二甲基精氨酸（ADMA）是内源性一氧化氮合酶抑制剂，被公认是一种与心血管疾病、糖尿病、性功能障碍和肾功能衰竭等多种疾病密切相关的危险因子. 本文通过化学发光法检测瓜氨酸或ADMA经鸟氨酸氨基甲酰转移酶（ArcB）和氨基甲酰磷酸激酶（ArcC）偶联生成的ATP，并对该方法检测的灵敏度和动态范围进行了初步评价.1）从绿脓杆菌中克隆了鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰磷酸激酶，转化大肠杆菌实现高效可溶性表达，用镍柱亲和纯化得到融合蛋白，TLC薄层层析法定性和测氨法定量验证了融合蛋白活性.2）用化学发光法检测了瓜氨酸或ADMA经相应酶偶联反应后的产物ATP，并且对实验进行了优化，结果表明两者都能在偶联酶作用下催化释放ATP，相应的底物浓度检测下限为01 μmol/L，检测结果接近正常生理血清中ADMA的浓度，且远低于正常生理血清中瓜氨酸浓度. 用正常尿液样品检测结果表明,该方法可行，为下一步血清和血浆样品的检测奠定了基础.

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