中国生物化学与分子生物学报

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陈思伊, 庄贞静, 许瑞安

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 197-202.

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Kallistatin是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂.早期研究发现,它能与组织激肽释放酶结合并抑制其活性，随后kallistatin的抗血管生成、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等功能也逐步被发现. Kallistatin有2个主要功能结构域：反应中心环和肝素结合结构域，各自发挥不同的作用. Kallistatin通过肝素结合结构域竞争性抑制血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子与它们的受体结合，进而起到抗血管生成和抗炎作用. 近年研究发现，kallistatin的多种功能由不同信号通路介导，主要为PI3KAkt信号通路和TNF-α-NF-κB信号通路.此外,kallistatin还通过丝裂原活化激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）等信号通路发挥作用.本文就目前研究的kallistatin的结构功能及其在PI3KAkt、TNFα等多种信号通路中的调节功能和作用机制进行阐述.

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长链非编码RNA的功能与疾病

武志娟, 钟金城

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 203-210.

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长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一类长度大于200 nt且不表现出任何蛋白质编码潜能的RNAs,在总非编码RNAs(ncRNA)中占有相当大的比例.对lncRNAs的研究将有助于理解生命体多层次的表达调控网络，并有望为复杂疾病的预测、诊断、和治疗提供新的分子依据.本文在简要介绍lncRNAs的基础上，综合分析了lncRNAs与表观遗传、基因表达调控和疾病发生的关系，以期为进一步的研究提供参考.

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TALE核酸酶介导的基因组定点修饰技术

王昕, 张志强, 张智英

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 211-216.

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TALE核酸酶（TALE nucleases，TALENs）是继锌指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFNs）技术以来的另一种能够对基因组进行高效定点修饰的新技术. TALENs技术是基于植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）分泌的一种转录激活子样效应因子（transcription activator–like effectors，TALEs）而设计和构建的. TALEs蛋白是由N端分泌信号、中央DNA结合域、1个核定位信号和C端激活域构成；TALE核酸酶是将TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，设计和构建的能在特定位点产生双链断裂的TALENs. 研究结果显示,人工构建的TALENs能够对动植物细胞的基因组进行高度特异和高效的修饰. TALENs的活性在酵母、植物和哺乳动物包括人的细胞中已经相继得到验证. 本文介绍了TALENs的结构特点、作用原理、构建方法和双链断裂的修复机制及其在动植物细胞基因组定点修饰中的应用，剖析了该技术可能存在的问题，展望了TALENs应用前景.

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微RNA-375的抑癌机制

吴一波, 余星, 郭俊明

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 217-221.

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微RNA-375（microRNA-375，miR-375）是最早在胰腺组织中发现的微RNA，参与胰岛的形成和发展，具有调节胰岛素分泌的功能. 新近研究发现，miR-375在多种肿瘤组织（包括呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、皮肤和妇科肿瘤组织）中和食管鳞状细胞癌、肝癌和胰腺癌患者外周血中明显表达异常. miR375可通过调控多个靶基因（如：3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1、14-3-3ζ、Janus激酶2、p53、丝裂原活化蛋白激酶、Wnt、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1受体、星形胶质细胞升高基因1/异黏蛋白、地塞米松诱导的Ras相关蛋白1和特异蛋白1等相关基因），参与肿瘤的发生和发展过程. 提高细胞内miR375的水平能够抑制肿瘤细胞（如：头颈鳞癌、胃癌、食管鳞癌、黑色素瘤和乳腺癌等肿瘤细胞）的增殖和迁移. 因此，具有抑癌活性的miR375是一种有临床价值的新型肿瘤分子标志物和肿瘤靶向治疗的新靶点.

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TXNIP基因与肿瘤发生及转移

李立夫, 梁莉

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 222-226.

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硫氧还蛋白结合蛋白（thioredoxininteracting protein, TXNIP）在细胞增殖、凋亡、分化的过程以及肿瘤、应激性疾病的发生中具有重要功能. 作为一个氧还反应的调节子，TXNIP能与硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)相结合，下调Trx的表达，而Trx则在DNA的损伤及细胞凋亡机制中有着关键的作用. 本文阐述了TXNIP基因的特征及其蛋白的生物学功能, 并简要总结TXNIP在人类肿瘤中低表达的研究成果. TXNIP基因是一个新的抑癌基因，它在人类乳腺癌、肝癌、肺癌等癌组织细胞中均表达下降, 并且与肿瘤的转移相关. TXNIP的缺失可以促使肿瘤细胞的增殖和抑制细胞凋亡的进程. 而在抗肿瘤机制中, TXNIP可通过参与细胞周期阻滞、低氧调节、影响NK细胞(natural killer cell, NK cell)发育等过程介导肿瘤的发生发展.

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α-硫辛酸对H9c2细胞在H₂O₂导致的氧化应激损伤中的保护作用

刘羿男, 王卫平, 贾竹青, 陈苹, 马康涛, 周春燕

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 227-233.

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缺血再灌注产生的氧自由基会导致心肌细胞凋亡. 近年研究发现, α-硫辛酸（α-lipoic acid, LA）具有抗氧化作用, 但LA是否能够对抗心肌细胞凋亡, 保护心脏功能的作用尚未明确. 本研究利用H2O2诱导的心肌细胞H9c2氧化应激模型, 分别用CCK8方法检测细胞存活率、Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化、流式细胞术检测细胞凋亡率、realtime PCR法检测Bcl2/Bax基因表达变化, 评价LA是否具有对抗氧化损伤引起的心肌细胞凋亡能力. 结果显示, LA能提高H2O2损伤的H9c2细胞存活率, 降低心肌细胞凋亡, 而且LA通过上调Bcl2的表达而发挥抑制细胞凋亡的作用. 研究结果证实, LA对氧化应激损伤的心肌细胞具有较好的保护作用. 该研究为LA在临床上用于治疗氧化应激引起的心肌细胞凋亡提供了实验依据.

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Met662和Asp1828的Cys突变增强蛋白内含子对共表达的BDD-FVIII因子重链和轻链的剪接

朱甫祥, 刘泽隆, 缪静, 屈慧鸽, 迟晓艳

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 234-239.

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本文旨在通过B区缺失型凝血因子8(BDD-FVⅢ)重、轻链间二硫键形成，改善蛋白质反式剪接效率，提高双载体转BDDFVⅢ基因功效. 将BDD-FVⅢ重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys，用蛋白内含子融合的重链和轻链基因共转染HEK293细胞，Western印迹检测到细胞内BDD-FVⅢ剪接量的提高以及重、轻链间二硫键的形成，用ELISA和Coatest测得细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FVⅢ的量(119±14 ng/mL)和活性(1.06±0.08 IU/mL)，明显高于野生型BDDFVⅢ重链和轻链基因共转染细胞的量(81±12 ng/mL)和活性(0.70±0.15 IU/mL)；混合培养的转突变重链和轻链基因细胞培养基中剪接BDDFVⅢ的量(17±5 ng/mL)和活性(0.15±0.03 IU/mL)，与混合培养的转野生型重链和轻链基因细胞 (分别为21±9 ng/mL和0.18±0.05 IU/mL)相近，反映不依赖细胞机制的蛋白质反式剪接. 结果表明，重、轻链间二硫键形成通过增强蛋白质反式剪接提高双载体转BDDFVⅢ基因的功效. 为进一步运用双AAV载体动物体内转BDD-FVⅢ基因提供了实验依据.

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Figla基因过表达促进小鼠胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化

胡玥, 褚志礼, 白耀富, 王龙, 王一然, 彭莎, 华进联

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 240-247.

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生殖系a因子(Figla）是最早表达的生殖细胞特异性转录因子之一，对卵泡的发育、Zp基因的表达和透明带的形成具有调节作用. Figla基因异常会引起卵巢早衰的发生. 本研究通过 PCR自小鼠基因组中扩增出Figla基因，将其克隆到真核报告载体pDsRed1N1，构建了携带609 bp 的Figla重组载体pDsRed1N1Figla. 用该载体转染小鼠胚胎干细胞（mESCs）系J1、小鼠成纤维细胞系NIH3T3、小鼠畸胎瘤细胞P19和小鼠精原细胞系GC1，在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(RFP)在细胞中的表达，同时检测转染细胞中Figla基因及其它生殖细胞特异性基因的表达. 结果显示，转染2 d，mESCs内Figla总表达量明显增加，且内源性表达量亦有所提高，即转入的外源性Figla基因可以促进内源性Figla的启动和表达. 免疫荧光染色显示，表达RFP 的细胞同时表达生殖特异性基因Vasa，减数分裂特异性基因Stra8、Scp3及卵母细胞标志基因Zp3. 通过QRTPCR检测发现，在转染3 d的细胞中，Vasa、Scp3和Zp1的表达较对照组均有明显上调，而Oct4和Stra8的表达量下降. 研究表明，Figla基因对生殖特异性基因的表达具有调控作用，可以激活雌性生殖基因表达，为更清楚地了解Figla基因在生殖细胞生长发育过程中的调控机制，以及发现该基因在生殖细胞中的新功能奠定了基础.

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D－半乳糖致衰老小鼠与幼龄小鼠的垂体差异蛋白质分析

曹锐, 银兴峰, 李江林, 谢纯良, 王迎, 王贤纯, 陈平, 梁宋平

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 248-254.

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脑垂体是控制动物生长发育衰老死亡非常重要的一个器官.随着机体的衰老，垂体功能退化是必然趋势.D半乳糖致衰老模型已被广泛用于研究衰老机制和筛选药物靶标，然而其分子机制尚未清楚.本研究采用差异蛋白质组学方法,以寻找D半乳糖致衰老小鼠和幼龄小鼠垂体的差异蛋白质，为弄清其功能障碍的分子机制提供新的研究方法和线索.基于双相电泳和质谱结合的方法，本研究发现了46个大于2倍的差异蛋白质,其中32个得到可靠的鉴定（P <005）. 对差异蛋白质功能分析发现, 这些显著差异蛋白质主要分布于糖代谢通路，可能与线粒体功能紊乱有关.我们的研究数据为更好地理解D半乳糖致衰老小鼠垂体功能障碍的内在机制提供了线索.

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日本七鳃鳗RGD毒素肽Lj-RGD2的克隆、表达及其抗血管新生活性

王继红, 刘洋, 吕莉, 宁淑香, 刘欣, 李庆伟

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 254-260.

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日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白Lj-RGD2毒素肽分子质量为8 kD，是含有2个RGD（Arg-Gly-Asp）模体序列的多肽.为了探讨其是否具有RGD毒素蛋白的功能，对其基因进行了克隆和表达，并对其重组蛋白进行了抗血管新生活性研究.从日本七鳃鳗口腔腺中提取mRNA，以自行设计的引物进行RT-PCR扩增，以获得Lj-RGD2基因；将获取的目的基因与pET23b载体连接，经转化、克隆、阳性转化子的筛选鉴定；将含组氨酸标签的pET23b-Lj-RGD2转化BL21菌中诱导表达；经亲和层析纯化，获得可溶性重组rLj-RGD2蛋白，并对重组rLj-RGD2蛋白的抗血管新生功能进行了研究.结果显示，rLj-RGD2蛋白的IC50为1.77μmol/L，并以剂量依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖；rLj-RGD2蛋白还能抑制ECV304细胞对人工基质膜Matrigel的黏附、以BFGF（basic fibroblast growth factor）为趋化剂的迁移及侵袭.鸡胚绒毛尿囊膜CAM（chick chorioallantoic membrane）血管新生实验结果表明，rLj-RGD2蛋白能以剂量依赖方式抑制BFGF诱导的CAM血管新生.由此可见，rLjRGD2蛋白具有RGD毒素肽的活性特征，其有望成为一种抗血管新生基因工程新药. 关键词日本七鳃鳗; RGD毒素蛋白; 细胞黏附; 迁移及侵袭; 血管新生

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极端耐盐植物盐穗木编码未知多肽基因HcUKPP的克隆与表达

姚曼红, 曾幼玲

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 261-266.

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采用RACE技术从新疆极端耐盐植物盐穗木中克隆获得1个耐盐相关的转录子，命名为HcUKPP (unknown polypeptide, UKPP)，其cDNA全长为569 bp，含有1个243 bp 的完整可阅读框，预测其编码1条含80个氨基酸的多肽，分子质量为8 671.6，等电点pI为7.71实时定量PCR结果显示,该基因在600 mmol/L NaCl胁迫下呈现表达上调趋势．结果提示，HcUKPP可能是耐盐相关基因. 目前该基因在NCBI 核苷酸及蛋白数据库中未发现其相似序列，文献中也未见报道．

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大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒（WDSV）逆转录病毒周期蛋白（OrfA）相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

徐坤, 王亮亮, 张婷婷, 周罡, 张志强, 张智英

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 267-275.

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大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤(WDS)在秋季发生春季萎缩的季节性生长特点与大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒 (WDSV) 辅助基因的表达有关. 其中辅助基因orfA的表达产物OrfA蛋白可能是1个潜在的肿瘤相关因子, OrfA与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D同源，也被称为逆转录病毒周期蛋白（retroviral-cyclin）.为了深入研究OrfA的作用和功能，我们构建了诱饵表达载体pGBKT7-orfA，采用酵母双杂交技术，从HeLa cDNA文库中筛选与其相互的蛋白因子. 通过2轮高强度压力的筛选、β-半乳糖苷酶活性验证、回转验证以及测序分析，最终获得了1个与OrfA相互作用的转录因子E2F5. OrfA C端78个氨基酸的多肽或者缺失C端78个氨基酸的OrfA突变体均不能在酵母双杂交系统中与E2F5相互作用. 这些发现为进一步研究OrfA在肿瘤萎缩中的功能奠定了基础.

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一种新的分化心肌细胞筛选策略：稳定表达αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo融合基因的人胚胎干细胞系的建立及其向心肌细胞定向分化的鉴定

魏晋, 牟晓宁, 马跃, 蒋曹德

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 276-282.

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心肌梗死是威胁人类健康的重要疾病之一，胚胎干细胞来源的心肌细胞移植是目前治疗心肌梗死的研究热点. 但是由于受到分化的心肌细胞纯度的影响，限制了心肌分化的机理研究以及临床应用. 本实验构建含有心肌特异性启动子αMHC启动的灭瘟素（Blasticidin，简称Blar）抗性基因及增强绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒表达载体αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo. 应用慢病毒转染技术将慢病毒转染到人胚胎干细胞（hESCs），胚胎干细胞特异性启动子Rex启动mCherry和neo抗性蛋白的表达. 经过G418药物筛选，建立G418和mCherry阳性的细胞系. 通过PCR及流式细胞术，进一步鉴定稳定转染的hESCs细胞系；核型分析表明，该细胞系在建立过程中仍保持细胞核型的稳定. 在诱导稳定转染的hESCs向心肌细胞分化的实验中，分化的心肌细胞表达心肌细胞特异的肌钙蛋白(cTnT)，同时具有EGFP和Blasticidin药物筛选的双标记.本实验建立的这一细胞系可用于心肌细胞的纯化，为深入研究心肌发生发育的关键调控机制及临床应用奠定基础.

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PCR片段测序和基因分型两种方法对Kennedy遗传病的诊断

何其华, 张小燕, 陆爱丽, 兰峰, 洪天配, 沈丽

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 283-288.

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X连锁脊延髓肌萎缩症（SBMA）或肯尼迪病是一种成年人发病的神经变性疾病，以肌无力与慢性、进行性肌萎缩为特征. 通过PCR片段测序和基因分型法准确检测雄激素受体（AR）基因CAG复制数目，兄弟俩（来自同一个中国家庭）被确诊为隐性遗传性SBMA. 为了得到该中国家庭SMBA家系人员AR基因的CAG复制数目，我们采用了PCR片段测序和基因分型两种方法. 在该SMBA家系中有两个已发病的成年男性、未发病的年轻男性，及女性基因携带者. 两个已发病男性患者AR基因中CAG三核苷酸串重复数目分别是48和45. 以前的研究表明特定三核苷酸串重复数目的扩增可导致人类遗传性神经障碍疾病发病。我们的研究结果完全支持这一观点，SMBA中国家系的三核苷酸CAG拷贝数目检测结果表明，AR基因CAG扩增数目与SMBA发病相关. 关键词雄性激素受体; CAG多重三核苷酸重复; 肯尼迪病; 脊延髓肌萎缩症; X连锁

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盐藻新基因DsSTPK的克隆及生物信息学分析

薛飞, 柴晓杰, 余祝君, 张晓琳, 张婷

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(3): 289-295.

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采用RT-PCR和RACE技术克隆了杜氏盐藻DsSTPK的1种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（GenBank accession No.JN625213），命名为DsSTPK，并对其进行了生物信息学分析. 结果表明，盐藻DsSTPK基因的cDNA全长为3 129 bp，可阅读框为2 184 bp，编码727个氨基酸.该蛋白为亲水性蛋白，无信号肽，无跨膜区域，为非跨膜蛋白，且定位于细胞质基质，二级结构的主要元件为无规卷曲和α 螺旋，三维建模成功，在167~190位有1个蛋白激酶的ATP结合区、293~305位1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区，存在多个潜在的磷酸化位点.进一步的进化分析表明，其与衣藻、团藻亲缘关系最近. 这些研究结果为进一步阐明DsSTPK的功能及作用机制奠定了基础.

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