中国生物化学与分子生物学报

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罗肖，李惠侠，杨公社

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 791-796.

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Wnt蛋白是一类分泌型蛋白生长因子，通过自分泌和旁分泌作用调节多种细胞的发生和发育.新近研究表明,Wnt信号通路在前体脂肪细胞的增殖分化中发挥着重要作用.Wnt蛋白的配基通过与细胞膜上的特异性受体Frizzled1/2/5及辅助受体LRP5/6结合，激活经典或非经典的Wnt信号通路，影响下游靶基因产物的磷酸化作用，进而抑制C/EBPα、PPARγ等脂肪细胞关键转录因子，使细胞保持未分化状态，从而抑制脂肪的形成.本文就Wnt信号通路的研究史和主要分支、作用方式及其抑制脂肪细胞的机制方面进行了综述，并对今后的研究方向和应用作了展望.

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吡啶核苷酸转氢酶的结构及功能

赵旵军,黄恩启,龚仁敏,朱国萍

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 797-803.

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吡啶核苷酸转氢酶(pyridine nucleotide transhydrogenases)是能直接催化NADP(H)与NAD(H)之间氢负离子可逆转移的氧化还原酶, 主要调控分解代谢和合成代谢过程中NADH与NADPH之间的动态平衡. 膜结合吡啶核苷酸转氢酶(TH)是ATP依赖性跨膜蛋白, 由2个亚基构成, 每个亚基包含dⅠ、dⅡ和dⅢ三个结构域. 在TH结合可变催化机制中, 氢负离子的转移总是与质子转移相偶联. 可溶性吡啶核苷酸转氢酶(STH)是非能量依赖性的黄素蛋白, 以可溶性多聚体形式存在. 目前认为,很多因活性氧自由基异常增多而引起的线粒体疾病都与TH的活性有关, 包括糖尿病、癌症、神经退行性疾病及心血管疾病等. TH分子机制的研究将有助于揭示这些线粒体疾病的致病机理以及为其诊断和基因治疗提供分子依据. STH作用机理的研究及其在辅酶再生系统中的应用, 将会推动代谢工程和工业生物催化过程的进一步发展.

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植物中的H2O2信号及其功能

李师翁，薛林贵;冯虎元，徐世键，安黎哲

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 804-810.

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H2O2是植物细胞的信号分子,是细胞正常代谢的产物,生物和非生物胁迫促使植物细胞产生H2O2,通过H2O2信号应答胁迫.H2O2信号调控一系列重要的植物生理生化过程,如系统获得抗性(SAR)和高度敏感抗性(HR)、细胞衰老与程序化细胞死亡(PCD)、气孔关闭、根的向地性、根的生长和不定根形成、细胞壁的发育、柱头与花粉的发育及相互关系等.Ca2+流动和可逆蛋白磷酸化作用是H2O2下游信号,通过MAPK级联作用于转录因子,最终调控基因的表达.H2O2调控多种基因的表达,包括编码抗氧化酶基因、调控程序化细胞死亡相关蛋白基因、生物与非生物胁迫应答蛋白基因等.

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脂肪间充质干细胞的分离培养、多向分化及其应用前景

屈长青，朱茂英，刘生杰，聂传朋

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 811-816.

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脂肪组织几乎遍布于动物体全身，在整个生命过程中有极强的可塑性. 近年研究表明，运用相似的分离方法，可从人、小鼠、大鼠、兔和猪等物种脂肪组织中分离获得脂肪间充质干细胞. 与骨髓来源的间充质干细胞相比，它具有相似的表面标记和分化潜能;在合适的诱导条件下，这种细胞能分别向3个胚层的细胞分化，如成肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、血管内皮细胞和肝细胞等;脂肪间充质干细胞具有来源丰富，取材安全方便和扩增速率高的特点，使其在细胞治疗和组织工程方面具有更广阔的应用前景.

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胆汁酸功能及其与肠道细菌相互关系

李灏;姜颖;贺福初,

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 817-822.

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胆汁酸具有多种重要生理功能. 近年研究发现，胆汁酸可作为信号分子与褐色脂肪细胞表面受体TGR5结合，可激活法尼酯衍生物X受体（nuclear receptor farnesoid X receptor, FXR）的表达. 通过激活这些不同的信号传导途径，胆汁酸可以分别起到调节体内能量代谢平衡、控制肥胖以及抑制肠道细菌过度增殖的作用. 胆汁酸与人及动物肠道细菌具有复杂的相互关系：肠道细菌对于胆汁酸的转化很重要，除了在胆汁酸的转化中发挥重要作用外，肠道微生物菌群还可以十分有效地水解已被胆汁酸清除的生物体内结合寄生物或异源物质，促进这些物质的活化或肠肝循环. 宿主拥有一些抑制细菌过度增殖的机制，这些机制包括快速转运以及利用抗菌肽、蛋白水解肽和胆汁酸等进行抑菌;而有些肠道细菌在进化中形成一些抗性机制可避免胆汁酸胁迫. 本文主要就胆汁酸控制肥胖以及抑制细菌过度增殖的机制和胆汁酸与肠道细菌相互关系进行了综述.

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DAZ家族新成员BOULE蛋白的结构与功能

李齐发，李隐侠，张庆波，刘振山，曲旭光，谢庄

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 823-828.

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BOULE蛋白是2001年发现的DAZ家族的新成员，是人类精子发生过程中减数分裂的关键调控因子. BOULE基因表达的改变或BOULE蛋白的缺乏可引起减数分裂阻滞和精子生成障碍，从而导致无精子症并产生不育. BOULE蛋白的一级结构中含有DAZ家族的特征结构域，包括DAZ重复和RNA结合域（RBM），因此,将其列为继DAZ、DAZL之后DAZ家族的第3个成员.本文对BOULE的发现过程、结构和定位进行了总结回顾，并重点介绍了其在精子发生减数分裂中的作用及其作用机制.

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筛选环孢霉素A适体的SELEX技术的建立

李卫滨,兰小鹏,杨湘越,周长邵

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 829-834.

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体外合成一个全长78个核苷酸,中间含35个随机序列的随机单链寡核苷酸序列(ssDNA)文库，运用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术，以环孢霉素A(CsA)为靶目标,以磁珠作为筛选介质，利用生物素链酶抗生物素辣根过氧化物酶系统,检测每轮ssDNA文库与CsA的亲和力，筛选并鉴定CsA特异性的适体.经过11轮的筛选，ssDNA文库与CsA的亲和力呈上升趋势.将第10轮筛选产物克隆测序并运用相关软件进行一级结构和二级结构分析.随机挑选的19个克隆适体,根据一级结构的同源性可分为5个家族，二级结构预测以茎环(发夹)为主,这可能是适体与CsA作用的部位. CsA特异性的适体将用于酶联法、免疫荧光法等对CsA进行检测.

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眼镜蛇毒中一个弱纤维蛋白原水解活性金属蛋白酶的纯化和性质研究

孙黔云,李敏，杨付梅

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 835-843.

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通过蛋白层析从中华眼镜蛇毒中分离纯化出一个新的纤维蛋白原水解酶atrase A. Atrase A是一个分子量为64.6 kD,等电点为pH 9.6和中性糖含量为4.16%的碱性单链糖蛋白.它具有弱的纤维蛋白原α链水解活性.该活性能被金属螯合剂EDTA, EGTA,1,10phenanthroline和还原剂DTT完全抑制，而PMSF只能部分抑制该活性，大豆胰蛋白酶抑制剂对其没有影响，表明atrase A属于金属蛋白酶. Atrase A具有水肿活性和金黄色葡萄球菌抑制活性.它对A549 和K562 细胞没有细胞毒性，但能使贴壁生长的A549细胞解离悬浮. Atrase A没有纤维蛋白、azocasein 、BAEE水解活性，对ADP、胶原诱导的血小板聚集没有明确的抑制作用. 经小鼠皮下注射后没有发现其有出血毒活性.

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Nogo A和srGAP蛋白在NIH 3T3细胞中的共表达

姚琴，金卫林，王颖，鞠躬;

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 844-848.

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为检测NogoA和srGAPs蛋白在NIH 3T3细胞上的表达，应用Western印迹的方法检测Nogo A蛋白的表达. 从NIH 3T3细胞抽提物中检测到约230 kD特异性的Nogo A反应条带;利用双重免疫细胞荧光化学标记法和激光共聚焦显微镜成像技术分别检测Nogo A与srGAPs或Rho蛋白在NIH 3T3细胞上的共表达状况，可观察到Nogo A与srGAPs共存于3T3细胞的细胞浆、突起和生长锥样结构上，亦可观察到Nogo A与Rho蛋白的共存.结果表明，NIH 3T3细胞中共表达Nogo A、srGAPs和Rho分子. 这为研究Nogo A与Rho信号转导途径间的关系奠定了基础.

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异源四倍体鲫鲤及其原始父母本细胞周期蛋白B基因克隆与分子遗传分析

刘良国，陶敏，段巍，刘少军，刘东，刘筠

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 849-858.

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细胞周期蛋白(cyclin)B是真核细胞周期运转中调控G2期至M期转化的关键因子.本实验根据斑马鱼细胞周期蛋白 B1基因的剪切方式，设计3对特异于金鱼和银鲫细胞周期蛋白B基因外显子区兼并引物，首次扩增出异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼细胞周期蛋白B基因2条大小分别约为2.4 kb和2.1 kb的片段.测序及比对分析表明：这3种鱼的细胞周期蛋白B基因2个片段均包含8个外显子和7个内含子.内含子剪切位点符合GT/AG规则，推测细胞周期蛋白B基因2个片段可能是细胞周期蛋白B基因的2种存在形式.异源四倍体鲫鲤与其原始父母本细胞周期蛋白B基因片段序列的比较结果表明：无论是外显子区还是内含子区，异源四倍体鲫鲤与其原始亲本都具有较高的遗传相似性，在1 025 bp的外显子序列中相同的碱基位点数达963个，为异源四倍体鲫鲤来源于红鲫和鲤鱼提供了分子证据;同时，异源四倍体鲫鲤与其原始亲本差异碱基位点的存在又表明这一独特的多倍体物种与其原始亲本存在着进化上的变异.此外，还分别以细胞周期蛋白B基因外显子和内含子序列构建了包括异源四倍体鲫鲤及其原始父母本在内的系统进化树.结果初步表明：对于亲缘关系较近的物种，用外显子和内含子序列构建的系统进化树与传统的物种进化树一致;而对于亲缘关系较远的物种，用内含子序列构建的进化树与传统的物种进化顺序存在较大差异.

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人重组t-PA突变体与β2糖蛋白Ⅰ的相互作用

张春娥,孙石静,蔡国平

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 859-863.

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利用重组DNA技术和原核表达,得到了人体组织型纤溶酶原激活剂t-PA 的缺失型突变体r-PA和Kringle2功能区,并在变性条件下通过金属螯合层析纯化得到纯度较高的r-PA和Kringle2重组蛋白.用纤维蛋白活性平板检测到复性的r-PA和Kringle2都具有体外纤溶活性,并且β 2糖蛋白Ⅰ (β2-glycoprotein Ⅰ, β2GPⅠ)对r-PA的体外纤溶活性有显著的促进作用:在β2GPⅠ浓度为1 μmol/L和4 μmol/L时,r-PA的纤溶活性分别提高1.8和2.1倍.ELISA方法检测发现, β2GPⅠ与r-PA,Kringle2均有特异性结合,并且随着β2GPⅠ浓度的增加,它与包被在酶标板上的重组蛋白r-PA和Kringle2的结合都有趋于饱和的趋势,但其饱和浓度却均远高于β2GPⅠ与t-PA结合的饱和浓度.

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乏氧诱导因子-1α基因沉默对肺癌细胞乏氧应答相关基因表达的影响

宋现让，宋宝，魏玲，柳永蕾，王兴武

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 864-869.

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乏氧诱导因子-1α (HIF-1α)是肿瘤细胞适应乏氧微环境的关键调控因子，具有作为治疗靶基因的潜力，以克服乏氧诱导的治疗抗拒等效应.下调其表达可能影响肿瘤细胞内一系列乏氧应答相关基因的表达.本研究采用已构建的HIF-1α RNAi慢病毒载体转导肺腺癌A549细胞，经杀稻瘟素（blasticidin）筛选建立HIF-1α基因稳定沉默的A549细胞株.应用cDNA微阵列技术检测并比较HIF-1α基因沉默A549细胞株和其亲本细胞株在常氧和乏氧状态下的基因表达谱改变. 应用定量RTPCR方法验证部分cDNA芯片差异表达基因的表达改变.HIF-1α基因稳定沉默细胞株A549/HIF-1α，在常氧和乏氧条件下HIF-1αmRNA水平分别较A549细胞下降89.2％和88.1％，HIF-1α蛋白水平分别下降97.2％和88.4％. 在乏氧条件下，cDNA微阵列检测的1 280个基因中,52个基因表达上调，15个基因表达下调. HIF-1α基因沉默显著影响其中27个基因的乏氧诱导效应.定量RT-PCR验证其中ENO2、BCL-2、CXCR4和MMP11的表达水平，与cDNA芯片结果相符合.结果提示，HIF-1α基因沉默能够在一定程度上阻断肺癌细胞的乏氧应答，在克服乏氧导致的肺癌治疗抗拒方面具有潜力.

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层粘连蛋白对晚G1期人胃癌BGC-823细胞生长的促进作用

孟书聪，董晓敏，张莎，林明，黄应申，肖军军

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 870-875.

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为研究层粘连蛋白（laminin,LN）促进肿瘤细胞生长作用,采用脉冲标记计数有丝分裂百分率(percentage labeling mitosis,PLM)法测得体外培养人胃癌 (BGC 823) 细胞周期时间为41 h,其中G1期时间为24.5 h. 分裂细胞脱离法获取分裂期细胞,继续培养23 h，在细胞运行进入G1晚期时,将其置于LN 0、0.11、0.55、1.10 μmol/L基质上孵育4 h; 细胞荧光光度计检测晚G1期细胞内Ca2+浓度、钙调蛋白、DNA含量. 结果显示,LN与其膜上受体结合后引起细胞内Ca2+浓度、钙调蛋白、DNA含量增加,尤以在0.55 μmol/L LN作用显著（P<0. 001）.蛋白质免疫印迹分析证明,cPKCα呈现表达,提示 LN与其受体结合可增强其细胞cPKC-α的活性;分析G1期细胞周期蛋白E(cyclinE)、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2表达水平，呈现逐渐增强的趋势; LN可诱导c-Myc蛋白呈现高表达,提示 LN与其受体结合增强与细胞增殖密切相关的基因表达;在LN作用前后的BGC 823细胞均未检测到Bax蛋白表达.结果提示,在人胃癌 (BGC 823)细胞G1/S期交界处,层粘连蛋白与其膜上受体结合引起细胞内Ca2+浓度升高,诱导钙调蛋白的释放，其含量增加,增强蛋白激酶C的活化,导致细胞内DNA含量增加、G1/S期细胞周期蛋白与CDK表达增强、诱导原癌基因c-Myc呈持续表达状态，而凋亡基因Bax不表达.

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一种用于DNA甲基化分析的改进型亚硫酸氢盐转化法

赵贵森;郑海燕;莫耀南;冯文芳;杨渝珍

中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(10): 876-880.

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DNA甲基化分析是认识生理、病理条件下基因表达变化的重要途径.亚硫酸氢盐转化是DNA甲基化分析的瓶颈.本文旨在改进琼脂糖亚硫酸氢盐DNA处理方案(agarose bisulfite method),建立一种简便稳定、适合常规甲基化分析的亚硫酸氢盐转化法.把DNA包入普通琼脂糖,以饱和亚硫酸氢盐在较高的温度下快速处理,然后用离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,集DNA凝胶回收、脱盐、脱磺基和纯化于一体,完成整个转化过程.Bisulfite-PCR、克隆测序和酶切法分析转化率、转化特异性和转化物的质量.用该方案处理的HeLa细胞DNA,多个片段的转化率均大于98%,甲基化片段96.2%的CpG保持不变,可以扩增605 bp的较大片段,灵敏度介于普通法和琼脂糖亚硫酸氢盐法之间,而重复性较二者都好.改良后的方案简化了操作流程,快速稳定,易学易用,可实现高效特异转化,适合于一般实验者对常规检材进行DNA甲基化分析.

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