中国生物化学与分子生物学报

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技术与方法

交叉活性探针确定单核苷酸多态性相关的拷贝数目变异

胡笑梅, 周晨, 张品正, 陈阳, 李佳文, 马雨凯, 王佳琪, 郭志义

中国生物化学与分子生物学报. 2025, 41(6): 895-902. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2025.04.1100

摘要 (17) PDF全文 (16)

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单核苷酸多态性相关的拷贝数变异(copy number variant,CNV)在体外诊断和精准治疗中占据着重要地位,而其常用的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)无法区分具有单核苷酸差异的CNV。本研究利用交叉活性探针定性与定量检测具有单核苷酸差异的拷贝数变异(copy number variant,CNV)。rs76711854所在以及下游9 514 bp长度片段通过PCR方法扩增获得,其基因型通过一代测序确认。此SNP的定性与定量分别通过探针法的定量PCR和数字PCR方法检测。rs76711854所在的CNV在针对G基因型探针出现分层,并在针对GA不同基因型的探针中均表现出A/G比例2:1。检测长度超过其下游9 kb以及更长的92 kb和203 kb的DNA片段,发现此CNV存在于前列腺癌细胞系DU145中,而子宫内膜癌细胞系中此203 kb范围拷贝数一致。本研究开发出以rs76711854位点的G/A片段为例,通过不同通道交叉定量检测的CNV方法,并推断DU145细胞的此处为多拷贝。

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技术与方法

β-伴大豆球蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

常家树, 孙华博, 王玉婷, 王潇惠, 杨博, 刘鸿瑞, 李玥昕, 孙源钊, 古少鹏, 何金鑫

中国生物化学与分子生物学报. 2025, 41(5): 764-770. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2025.03.1462

摘要 (67) PDF全文 (30)

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大豆是一种重要的植物蛋白质来源,在幼儿和幼小动物具有较高的过敏性,尤其是其中的β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin),约占大豆总蛋白质的30%,是主要的过敏原。传统的ELISA检测方法依赖于多克隆抗体或单克隆抗体,这些抗体分子量大,难以接触核心区域,且对酸碱敏感,限制了快速检测的应用。纳米抗体(nanobodies,Nbs)源自驼科动物的重链抗体可变区,具有体积小、结构稳定、特异性强和亲和力高等优点。本研究旨在研制β-伴大豆球蛋白的纳米抗体,使用β-伴大豆球蛋白对羊驼进行5次免疫,ELISA检测显示,其重链抗体效价为1∶16 000;随后分离外周血淋巴细胞并提取总RNA,通过PCR扩增重链抗体的可变区,构建重组质粒并转化至ER2738感受态,获取Nbs噬菌体展示文库。该文库的库容约为3.5×10⁸ CFU/mL,经辅助噬菌体拯救后达到1.15×10¹² PFU/mL,Nbs基因插入率为100%。通过4轮固相筛选,其纳米抗体噬菌体输出明显富集,富集率为155.9;Phage-ELISA结果显示,筛选出35株阳性克隆,测序结果显示,均为同一氨基酸序列。将该Nbs进行原核表达,通过Western 印迹和ELISA验证其对β-伴大豆球蛋白具有良好的结合能力。这一研究为开发Nbs的β-伴大豆球蛋白快速检测方法奠定基础。

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技术与方法

iKcr-RG: 基于ResNet和BiGRU的双分支策略预测非组蛋白质赖氨酸酰化位点

程航, 段燕北, 魏欣

中国生物化学与分子生物学报. 2025, 41(2): 305-314. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2025.01.1354

摘要 (79) PDF全文 (39)

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赖氨酸酰化是一种蛋白质翻译后修饰方式,这种修饰在细胞功能、基因转录以及细胞代谢中发挥着关键作用。同时,赖氨酸酰化还涉及生命体多个生物学过程,其异常可能与多种疾病的发生和发展相关。因此,研究赖氨酸酰化位点的预测对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。尽管生物医学实验可以高精度地检测赖氨酸酰化位点,但其成本高且耗时较长。为了解决这一问题,研究人员开发了更为便捷和高效的计算方法,以替代传统的生物医学实验技术。本研究开发了一个深度学习方法的预测模型iKcr-RG,该模型采用了双分支策略,同时使用ResNet和BiGRU来提取原始序列编码中的局部特征和全局特征信息。为了进一步提升模型的性能,我们创新性地设计了一种特征融合方法。经过这些优化,本研究在非平衡数据中展现出了更强的鲁棒性和稳定性。在独立数据集的结果中,特异性(Sp)、灵敏性(Sn)、准确性(Acc)和马修斯相关系数(MCC)分别为0.8109、0.7902、0.7940和0.4978。iKcr-RG模型在预测赖氨酸酰化位点优于现有方法,这项研究为深度学习在生物信息学领域的应用提供了新的思路和方法。

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技术与方法

植物源SARS-CoV-2 S1-RBD表达水平的优化

李晗, 纪惠莹, 张天昊, 王春玉, 何金鑫, 张莉莉

中国生物化学与分子生物学报. 2024, 40(12): 1761-1770. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2024.10.1225

摘要 (85) PDF全文 (47)

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SARS-CoV-2 受体结合域(RBD)是重组蛋白质疫苗的关键靶点。高效和高质量地表达 RBD蛋白是开发有效重组蛋白疫苗的重要基础。相较于 CHO 细胞生产的 RBD 疫苗,植物表达系统具有更高安全性和更低成本的优势。目前,RBD 抗原在植物中的表达水平较低,且其提取和质量优化方法尚未完全建立。本研究以 SARS-CoV-2 原型株 RBD 的 R₃₁₉~K₅₃₇ 位氨基酸为模板,通过植物表达载体 pCAMBIA1300 在本氏烟草中进行瞬时表达。初始表达水平较低,仅为 23.3 μg/g 鲜重,占植物总可溶蛋白质的 0.23%。通过共表达高效基因沉默抑制子 pGD-VSRs,RBD 表达量提高了2.61倍。通过 C-末端融合绿色荧光蛋白,确定了 RBD 在植物中定位于质外体区域。进一步引入 αAmy3 信号肽,使RBD的积累水平较 PR1a 信号肽提高2.1倍。最终,RBD 在本氏烟草中的表达量提升至 128.6 μg/g 鲜重,占植物总可溶蛋白质的 1.29%。随后,采用质外提取纯化方法,获得纯度超过90%的 RBD 蛋白。小鼠免疫实验表明,该植物来源的 RBD 与 CHO 来源的 RBD 具有相当的免疫原性。本研究为植物源 RBD 疫苗的开发提供了重要的理论基础和技术支持。

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技术与方法

基于报告基因法检测白细胞介素-11生物学活性

王伊莹, 周小玲, 叶子弘, 张雅芬

中国生物化学与分子生物学报. 2024, 40(10): 1462-1470. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2024.09.1191

摘要 (212) PDF全文 (64)

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白细胞介素-11(interleukin-11,IL-11)是一种多功能细胞因子,具有促进造血、免疫调节和组织修复等多种功能,在医学研究和临床治疗中具有重要的应用价值,因此,IL-11生物学活性的准确检测和评估至关重要。现采用的细胞增殖抑制法操作繁琐、耗时较长和易受到白细胞介素-6影响。本研究首先根据IL-11的作用机制(JAK-STAT信号通路),构建可稳定响应IL-11的萤光素酶报告基因表达单克隆细胞株,然后对IL-11 的预稀释浓度及稀释梯度、接种细胞量和IL-11孵育时间进行优化,进一步对方法的准确性、精密度、特异性、稳定性以及和药典方法一致性进行全面验证,建立了基于报告基因法检测IL-11生物学活性的新方法。该方法可有效提高检测准确性和灵敏度,并且缩短检测时间,具有一定的应用前景。

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技术与方法

英文共同第一作者基于表面等离子体共振的外泌体PD-L1蛋白检测技术

屈丽思, 彭宇彦, 俞泽涛, 叶子弘, 夏文强

中国生物化学与分子生物学报. 2024, 40(9): 1300-1307. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2024.07.1136

摘要 (120) PDF全文 (41)

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血清中可溶性程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)蛋白的存在形式包括外泌体表面、微囊泡表面以及分泌的游离形式等。前期研究表明,血清中外泌体表面PD-L1含量与多种癌症的预后评估显著相关,然而目前的常规检测方法通常将血清中所有可溶性PD-L1蛋白作为一个整体进行检测,无法有效分辨外泌体PD-L1与其他形式的PD-L1。本研究基于表面等离子体共振技术,建立了一种外泌体PD-L1的特异性检测方法。该方法首先通过抗体识别PD-L1蛋白,并将其捕获至检测芯片表面;再利用α-溶血素在外泌体膜上形成多个寡聚体,从而特异性检测外泌体PD-L1。该方法通过α-溶血素结合过程的信号变化对外泌体PD-L1含量进行检测,可以有效降低检测背景噪音并放大信号。使用α-溶血素放大信号前的线性范围为0.035～2.208 pg/mL,信号放大后的线性范围为0.004-0.552 pg/mL。方法学验证实验表明,该方法特异性、灵敏度和精密度良好,具有一定的临床应用前景。

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技术与方法

流式细胞术检测细胞周期影响因素及不同免疫细胞亚群周期分析

刘丹, 张洁, 郭正阳, 薛丽香, 王羽晴

中国生物化学与分子生物学报. 2024, 40(9): 1308-1316. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2024.09.1302

摘要 (409) PDF全文 (537)

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细胞周期检测对于了解细胞增殖状态、细胞功能研究、药物筛选与评估等领域具有重要意义。流式细胞仪分析细胞周期是目前较为经典且广泛应用的检测手段之一。碘化丙啶(propidium iodide,PI)单染是最常用的基于流式的检测细胞周期方法,然而,该方法在使用过程有诸多处理因素会对检测结果造成影响。此外,不同免疫细胞亚群在不同细胞周期阶段的分布差异也有助于研究免疫反应,了解疾病状态。本文以B16-F10细胞系为例,采用PI单染法,从固定条件、上机条件和软件分析3个角度,评价多种处理因素对细胞周期检测结果的影响。根据结果分析,在进行细胞周期检测时,建议取3 × 10⁶个细胞,用300 μL 预冷PBS重悬细胞后逐滴滴入700 μL预冷的无水乙醇,放置于4℃或-20℃过夜固定,低速收样,收样速率为每秒400~600 颗粒数,去黏连后需收集至少3 000个细胞。另外,通过EdU、PI双指标染色可以精确划分细胞周期,而细胞表面标志物染色联合Ki-67和PI染色法,可在不进行细胞分选的情况下进行不同免疫细胞亚群周期分析。本文较为系统的探讨了PI单染法检测细胞周期的影响因素,提供了标准的实验操作流程。建立了EdU联合PI检测细胞周期和针对不同免疫细胞亚群周期分析方案,拓宽了细胞周期检测方式。

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技术与方法

KIH结构在人白介素-35体外重组表达中的应用

张凯跃, 李宗艳, 曹瑞晴, 孟琳琳, 胡祥维, 顾玉超, 王建刚

中国生物化学与分子生物学报. 2024, 40(6): 857-866. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2024.04.1051

摘要 (151) PDF全文 (60)

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白细胞介素35(interleukin-35, IL-35)是非常重要的免疫抑制性细胞因子,被证实在多种疾病的免疫应答中发挥作用。本研究通过克隆人IL-35基因编码序列,构建单亚基表达载体pXC17.4-p35和pcDNA3.1(+)-EBI3,共转染CHO-K1细胞体外表达IL-35,经检测未发现p35亚基与EBI3亚基的结合。Knobs-into-Holes(KIH)可解决异源抗体重链错配的问题,因此,在原始序列的基础上融合KIH结构构建表达载体pXC17.4-p35-Fch和pcDNA3.1(+)-EBI3-Fck来表达KIH-IL-35重组融合蛋白质;同时交换2个亚基的表达载体来验证不同表达载体对KIH-IL-35表达量的影响。经过多种蛋白质检测方法的分析,显示KIH-IL-35结构的正确表达率明显提高。大量表达后对KIH-IL-35进行亲和纯化,采用ELISA法检测纯化后的KIH-IL-35与糖蛋白130(gp130)分子的结合活性,结果表明,KIH-IL-35与gp130的结合呈浓度依赖性。采用细胞活性检测方法检测KIH-IL-35与M1细胞的间接活性,结果表明,M1细胞的抑制率与KIH-IL-35的浓度呈剂量依赖性增长。此外,本研究成功建立了一种利用激活的人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)对IL-35进行活性检测的方法,结果显示,激活的PBMCs与KIH-IL-35的浓度呈剂量依赖性增长。总之,本研究利用KIH-IL-35模型,提高了重组人IL-35的正确表达率,并验证其在体外的高活性,为IL-35的研究及类似异源二聚体细胞因子的重组表达提供新思路。

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技术与方法

建立数字PCR检测非小细胞肺癌溶酶体相关的4次跨膜蛋白B基因拷贝数变异方法

王鲁, 徐国兵, 张青云

中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(9): 1356-1364. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.06.1165

摘要 (185) PDF全文 (178)

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建立芯片式数字PCR(dPCR)检测非小细胞肺癌(NSCLC)LAPTM4B基因拷贝数变异方法,并初步评估其基本性能和临床应用的可行性。设计LAPTM4B基因引物及特异性探针,建立dPCR反应体系,根据制备的不同浓度目的DNA样品验证该检测方法的最低检测限、精密度和线性范围。本研究首次建立并优化dPCR检测LAPTM4B基因拷贝数的反应体系,分析数据显示,该方法最低检测到12.5%的LAPTM4B基因拷贝数缺失,批间精密度变异系数CV<10%,且缺失比例在12.5%~100%范围内线性良好(R²>0.99)。此外,收集2021年3月至7月于北京大学肿瘤医院就诊的6例NSCLC患者,采用自建方法检测其冰冻组织标本,探究其临床应用可行性。dPCR结果显示,其中5例患者的组织样本存在LAPTM4B基因拷贝数缺失,1例出现拷贝数增加,推测可能与其术前化疗有关。综上所述,本研究成功应用芯片式dPCR方法,建立非小细胞肺癌LAPTM4B基因拷贝数变异的检测体系,并在组织标本中初步证实其临床应用的价值。

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技术与方法

海南捕鸟蛛毒素-IⅤ在大肠杆菌中的分泌表达及纯化

刘长军, 王健杰, 易可, 张哲扬, 李慧敏, 严青, 孟尔

中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(8): 1191-1199. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.03.1665

摘要 (371) PDF全文 (515)

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海南捕鸟蛛毒素-IV(hainantoxin-IV,HNTX-IV)是从海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)的毒液中分离得到的一种可以特异性抑制河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的多肽毒素,并且能够选择性抑制Na_v1.7亚型电压门控钠离子通道。HNTX-IV的成熟肽含有35个氨基酸残基,其结构通过3对二硫键稳定。HNTX-IV是研究钠通道结构和功能以及镇痛药物开发过程中非常有用的一种分子探针,但是其在天然毒素中的含量较少,很难分离足够量的组分进行后续研究。在本研究中,我们通过OEPR克隆构建了HNTX-IV的大肠杆菌分泌表达质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-IV。将质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-IV转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行自动诱导分泌表达,含有6×His标签和SUMO标签的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-IV成功分泌到大肠杆菌的细胞外培养基中。通过弱阳离子交换柱富集和Ni-NTA柱纯化之后,成功获得了纯度较高的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-IV。通过Ulp1激酶切割,重组HNTX-IV(rHNTX-IV)被释放出来,并通过RP-HPLC分离获得。通过MALDI-TOF 质谱鉴定rHNTX-IV分子量为3.9876kD。通过膜片钳技术,10 μmol/L的rHNTX-IV能够抑制90%以上的hNa_v1.7的电流,其IC₅₀值为126 nmol/L。本研究成功将HNTX-IV分泌到了大肠杆菌的细胞外培养液中,并最终获得了纯度较高且具有生理活性的rHNTX-IV分子,丰富了HNTX-IV的制备方法,为其后续研究奠定了基础。

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技术与方法

基于金纳米和杂交链式反应可视化检测植物病毒RNA

李文慧, 王舒婷, 马振男, 杜江, 王德富, 牛颜冰

中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(7): 1036-1046. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.04.1014

摘要 (339) PDF全文 (112)

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植物病毒病危害严重,严重制约着农业的可持续发展,可造成巨大的经济损失。监测植物健康和及早检测病毒病原对于减少疾病传播至关重要。为实现对植物病毒病的早期田间检测,本文将基于金纳米(AuNPs)的比色法与杂交链式反应(HCR)相结合,设计了一种灵敏、特异与高效的植物病毒RNA可视化检测技术。以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)为模型,根据TMV特异性保守片段设计2个具有单链尾的发夹结构H1/H2,TMV可打开发夹结构,使之交替形成长的双直链DNA。HCR反应前后核酸的2种状态与AuNPs之间的结合差异性致使比色信号产生,从而实现对TMV的可视化检测。经过对Tris-HAc浓度、发夹结构浓度、HCR反应时间等进行优化,得到最佳检测条件。在最优条件下,进一步分析了该技术的灵敏性、特异性以及进行了真实样本检测。结果表明,AuNPs的吸光度比值(A₆₂₀/A₅₂₀)与0~10 nmol/L范围内的目标片段浓度存在线性关系,最低检出限可达412 pmol/L;在实际样本检测中,该技术能从众多病样中准确检出目标病毒,且AuNPs的吸光度比值与0~40ng/μL的TMV也存在良好的线性关系,线性方程为y=0.00827x+0.14606,R²=0.96405,检出限为4.68 ng/μL,裸眼检出限也可达10 ng/μL。所建立的检测技术具有快速简易、成本低廉、特异性强和灵敏度高等优点,能实现对植物病毒RNA的早期快速可视化检测,具有广阔的应用前景。

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技术与方法

m⁶A_mTwins:基于深度学习和Twins网络的m⁶A_m位点预测

贾建华, 陈天, 吴跟强, 孙明炜

中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(6): 889-895. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.03.1500

摘要 (259) PDF全文 (176)

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N6,2'-O-二甲基腺苷(m⁶A_m)是一种常见的RNA分子的可逆修饰。部分研究已经说明m⁶A_m对mRNA的影响,但现阶段对m⁶A_m的生物学功能探索仍不够。所以我们提出了m⁶A_mTwins,一种新的端到端双胞胎网络,将Transformer(自动编码器)和双向门控循环单元(Bi-GRU)有机结合,简单利用RNA序列得到RNA的检测性。相比于现有的算法,本文亮点在于利用对比学习,构建新的损失函数来训练m⁶A_mTwins模型,提高了模型的泛化能力。基于Twins网络和简单编码方案,在两组正负比为1∶10的非平衡数据集下,其独立测试集上均取得了较好的结果,马修斯相关系数(MCC)分别得到0.53和0.545。同时,为增强m⁶A_mTwins模型的鲁棒性(robustness),本文在训练集上还进行了10折交叉验证,其MCC结果分别为0.562和0.567,说明该模型具有良好的泛化能力,可为生物医学在m⁶A_m上的研究提供一定的价值。

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技术与方法

基于双向长短时记忆网络和注意力机制的RNA m5C甲基化位点预测

胡梦, 李慧敏, 唐轶, 王煜, 陈鹏辉

中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(2): 303-310. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.12.1389

摘要 (327) PDF全文 (267)

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RNA 5-甲基胞嘧啶(m5C) 修饰在许多生物过程中发挥重要的作用,对m5C位点的准确识别有助于更好地理解其生物学功能,所以识别m5C甲基化位点十分必要。尽管已发展了多种识别m5C甲基化位点的机器学习方法,但预测能力仍有待提高。本文基于双向长短时记忆网络和注意力机制,提出了一种预测RNA m5C甲基化位点的深度学习算法。用该方法在人、小鼠、酿酒酵母和拟南芥共4种生物的RNA m5C数据集上进行实验,m5C位点预测AUC值分别达到92.5%、99.7%、93.6%和86.5%。与现有预测方法相比,该方法具有较好的预测性能,并且具有更优的泛化能力,为RNA m5C甲基化位点预测提供了一种新方法。

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技术与方法

人多能干细胞来源的肾定向分化平台的构建

周冰蕊, 魏云亮, 梁婷, 何生, 冯志伟, 靳宁, 刘志贞, 赵虹, 侯淑琳, 于保锋, 解军

中国生物化学与分子生物学报. 2022, 38(8): 1098-1105. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.07.1166

摘要 (408) PDF全文 (124)

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肾是一种重要的人体器官,具有多种生理功能。然而,全球范围内约有10%的人口患有肾疾病。因此,建立一种接近人体肾的结构与功能的模型进行肾疾病的研究是十分必要的。多能干细胞体外定向诱导分化技术的兴起,为再生医学和精准医学领域注入了新的动力。本研究通过在体外条件下模拟体内肾发育的过程,将人多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞,通过体外定向诱导分化形成肾的祖细胞,进而建立肾的结构与功能单位:肾元。该研究通过激活WNT信号通路,同时抑制TGF-β信号通路,将人多能干细胞从多能态定向诱导至原条阶段。之后通过细胞自分化的能力使其发育至中间中胚层,再通过激活FGF信号通路,将其分化至肾祖细胞阶段。流式细胞检测结果显示,肾祖细胞占总细胞数的51.5%~61.9%。通过免疫荧光检测发现:分化得到的结构中包含肾小球足细胞、近端小管、远端小管等肾组织结构。该研究建立的肾体外分化方法,具有稳定性好、分化效率高、重复性好的特点。为研究人类肾的早期发育机制,肾疾病模型构建,以及药物筛选提供了一种新的方法。

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技术与方法

SC-BPSO:肝癌分类中一种融合过滤器的二进制粒子群算法特征的选择方法

周楠, 郑云

中国生物化学与分子生物学报. 2022, 38(8): 1106-1116. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.05.1072

摘要 (287) PDF全文 (66)

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癌症的早期诊断能够显著提高癌症患者的存活率,在肝细胞癌患者中这种情况更加明显。机器学习是癌症分类中的有效工具。如何在复杂和高维的癌症数据集中,选择出低维度、高分类精度的特征子集是癌症分类的难题。本文提出了一种二阶段的特征选择方法SC-BPSO:通过组合Spearman相关系数和卡方独立检验作为过滤器的评价函数,设计了一种新型的过滤器方法——SC过滤器,再组合SC过滤器方法和基于二进制粒子群算法(BPSO)的包裹器方法,从而实现两阶段的特征选择。并应用在高维数据的癌症分类问题中,区分正常样本和肝细胞癌样本。首先,对来自美国国家生物信息中心(NCBI)和欧洲生物信息研究所(EBI)的130个肝组织microRNA序列数据(64肝细胞癌,66正常肝组织)进行预处理,使用MiRME算法从原始序列文件中提取microRNA的表达量、编辑水平和编辑后表达量3类特征。然后,调整SC-BPSO算法在肝细胞癌分类场景中的参数,选择出关键特征子集。最后,建立分类模型,预测结果,并与信息增益过滤器、信息增益率过滤器、BPSO包裹器特征选择算法选出的特征子集,使用相同参数的随机森林、支持向量机、决策树、KNN四种分类器分类,对比分类结果。使用SC-BPSO算法选择出的特征子集,分类准确率高达98.4%。研究结果表明,与另外3个特征选择算法相比,SC-BPSO算法能有效地找到尺寸较小和精度更高的特征子集。这对于少量样本高维数据的癌症分类问题可能具有重要意义。

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技术与方法

肠道微生物测序研究中不同实验来源差异的综合评价以及应用

徐珂琳, 庄悦, 朱嗣博, 薛江莉, 蒋艳峰, 袁子宇, 王久存, 索晨, 张铁军, 吕明, 陈兴栋

中国生物化学与分子生物学报. 2022, 38(7): 959-970. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.05.1516

摘要 (413) PDF全文 (49)

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肠道微生物测序研究具有将微生物结果转化为人类健康的巨大潜力。16S扩增子测序和宏基因组鸟枪测序(whole-metagenome shotgun, WMS)是微生物组研究中的两大主要方法,各具优势。然而,研究样品的异质性、测序仪和文库制备方法的差异如何影响肠道微生物测序结果的可重复性仍有待深入研究。该研究旨在通过比较粪便样本中微生物组成的差异,为测序技术的选择提供参考标准。3种广泛采用的测序仪的结果显示,WMS法中技术重复相关性(r=0.94)较高,而生物学重复相关性(r=0.69)较低。Bray-Curtis距离表明,生物学重复的差异大于技术重复(P<0.001)。此外,16S和WMS数据集间具有明显的分类学图谱差异。研究结果表明,同质化是样品DNA提取前的一个必要步骤;测序仪对分类学变异的贡献小于文库制备方法。我们开发了经验贝叶斯方法,即在计算中“借用信息”,利用标准化数据和(非)参数先验分布分析批次效应参数,提高了16S和WMS之间的群体可比性,为进一步应用于融合分析已发表的16S和微生物数据集提供了依据。

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技术与方法

iSucc-PseAAC:基于集成机器学习的赖氨酸琥珀酰化修饰位点预测

魏欣, 贾建华, 吴跟强, 刘春生

中国生物化学与分子生物学报. 2022, 38(6): 816-822. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.04.1670

摘要 (547) PDF全文 (147)

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赖氨酸琥珀酰化是一种新型的翻译后修饰,在蛋白质调节和细胞功能控制中发挥重要作用,所以准确识别蛋白质中的琥珀酰化位点是有必要的。传统的实验耗费物力和财力。通过计算方法预测是近段时间以来提出的一种高效的预测方法。本研究中,我们开发了一种新的预测方法iSucc-PseAAC,它是通过使用多种分类算法结合不同的特征提取方法。最终发现,基于耦合序列(PseAAC)特征提取下,使用支持向量机分类效果是最好的,并结合集成学习解决了数据不平衡问题。与现有方法预测效果对比,iSucc-PseAAC在区分赖氨酸琥珀酰化位点方面,更具有意义和实用性。

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技术与方法

扩增子测序法筛选结核分枝杆菌的耐药突变

杨鹏鹏, 罗娟秀, 宋玉竹, 李晓非, 夏雪山, 张阿梅

中国生物化学与分子生物学报. 2022, 38(4): 527-536. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.01.1510

摘要 (346) PDF全文 (149)

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结核病是严重的公共健康问题之一,而耐药结核病的增加是控制结核病流行的难点之一。快速、准确的诊断是提高结核患者治愈率和降低死亡率的关键因素。本研究建立了基于二代测序技术的扩增子测序方法,对5种一线抗结核药物的17个耐药基因进行检测。在26个临床耐药结核菌株中共鉴定出65个突变,包括33个热点突变,9个稀有突变和23个新突变。对18个新发现的错义突变进行了蛋白质序列保守性和蛋白质局部结构的分析。结果表明,14个新的错义突变在9种分枝杆菌中显示出高度保守性,并且导致了该蛋白质局部结构的改变。根据本研究检测和分析结果,推测这些新发现的突变可能是潜在的耐药突变。在本研究中,构建了扩增子测序的检测方法,可同时检测10株临床结核菌株的17个耐药基因,是一种快速、准确并且全面的检测耐药结核分枝杆菌一线治疗药物耐药突变的方法,该方法不仅能检测热点突变和稀有突变,还能发现一些未报道过的新突变。该检测方法或可用于临床诊断和基础研究。

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技术与方法

一种快速提取组织外泌体的分离富集方法

王建立, 张子怡, 秦伟伟, 王程程, 杨瑞

中国生物化学与分子生物学报. 2022, 38(3): 365-371. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.11.1260

摘要 (550) PDF全文 (484)

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本文提供一种快速提取组织外泌体的分离富集方法。通过将目标组织用机械法切碎,加入组织消化酶进行组织解离和过滤,将获得的组织细胞悬液依次进行差速离心、超离、尺寸排阻和超滤,实现组织高质量外泌体的富集纯化。组织解离方法比较试验中,采用组织消化酶解离组织得到的蛋白质含量更高,获得的外泌体组织来源的蛋白质污染小。富集小鼠心组织、小鼠肝组织、小鼠肾组织、人结肠癌组织、人乳腺癌组织和动脉粥样硬化组织的外泌体,并对其进行纳米粒径追踪和透射电镜观察。结果显示,外泌体的粒径均在30~150 nm内,结构清晰明确。对小鼠肝组织富集的外泌体进行蛋白质印迹分析。结果显示,阳性蛋白质标志物CD9、ALIX和CD63的表达,TSG101弱表达,阴性蛋白质标志物Calnexin无表达。本方法集合多种分离措施,能够达到分离纯化外泌体的作用,同时简化了分离组织外泌体的步骤,相对于其他方法,全程只需要4~5 h,节省了富集时间,所富集的外泌体纯度高、可溶性杂蛋白质污染小,实用性更加广泛。使用微量组织样本富集的外泌体即可满足后续纳米粒径追踪、蛋白质印迹、透射电镜和转录物组等分析。

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技术与方法

盐离子作用下组蛋白变体H2A.Z增强核小体结构的稳定性

邵学勤, 郭明欣, 蔡禄, 赵宏宇

中国生物化学与分子生物学报. 2022, 38(3): 372-380. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.02.1558

摘要 (332) PDF全文 (141)

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真核生物染色质的基本结构组成单元是核小体,基因组DNA被压缩在染色质中,核小体的存在通常会抑制转录、复制、修复和重组等发生在DNA模板上的生物学过程。组蛋白变体H2A.Z可以调控染色质结构进而影响基因的转录过程,但其详细的调控机制仍未研究清楚。为了比较含有组蛋白变体H2A.Z的核小体和常规核小体在盐离子作用下的稳定性差异,本文采用Förster共振能量转移的方法检测氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙、氯化镁等离子对核小体的解聚影响。实验对Widom 601 DNA序列进行双荧光Cy3和Cy5标记,通过荧光信号值的变化来反映核小体的解聚变化。Förster共振能量转移检测结果显示:在氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙和氯化镁作用下,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体解聚速度相比于常规核小体要慢,且氯化钙、氯化锰和氯化镁的影响更明显。电泳分析结果表明,在75℃条件下含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的解聚速率明显低于常规核小体。采用荧光热漂移检测(fluorescence thermal shift analysis , FTS)进一步分析含有组蛋白变体H2A.Z核小体的稳定性,发现两类核小体的荧光信号均呈现2个明显的增长期,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的第1个荧光信号增速期所对应的温度明显高于常规核小体,表明核小体中H2A.Z/H2B二聚体的解聚变性温度要高于常规的H2A/H2B二聚体,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的热稳定性高。研究结果均表明,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的结构比常规核小体的结构稳定。

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技术与方法

水产品和水体中灿烂弧菌现场可视化环介导等温扩增快检方法的建立及应用

田卓, 郑秋月, 麻丽丹, 郑文杰, 尚德静, 曹际娟

中国生物化学与分子生物学报. 2022, 38(1): 108-119. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.11.1366

摘要 (383) PDF全文 (127)

可视化

基于环介导等温扩增(LAMP)技术建立水产品和养殖水域中灿烂弧菌现场可视化的快速、简便检测方法。以灿烂弧菌等作为研究对象,以灿烂弧菌的toxR基因作为靶基因,确定煮沸法为适合于弧菌基因组DNA提取的快捷方法,优化筛选的引物可以特异地检测灿烂弧菌,检测核酸浓度的灵敏度可以达到10^-9g/L,并且结果稳定、可靠。采用该方法进行实际样品的检测应用,在558份水体样品和655份水产品样品中,灿烂弧菌阳性检出率分别为0.54%和0.46%,与实时荧光PCR方法的检测结果符合率为100%。低技术要求,低设备成本以及短检测时间使得可视化LAMP快检方法成为现场可使用的一个理想选择,这对于水产养殖业来说也更方便。

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技术与方法

双重结合肽段协助胞内蛋白酶体系统降解alpha-突触核蛋白

郝梦娇, 任晓曦, 陈茜, 邓邺云, 张建亮

中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(12): 1675-1681. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.10.1244

摘要 (367) PDF全文 (117)

可视化

alpha-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)异常累积与聚集是帕金森病的重要致病因素之一。目前,已有的降低细胞内α-syn的方法多是从抑制新蛋白质合成角度进行,而无法干预已经存在并产生毒性的蛋白质。该研究旨在探索一种可以降解α-syn的新方法,从而挽救α-syn造成的细胞损伤。本研究依据Trim-Away方法设计了2种针对α-syn降解的肽段,即Pep1和Pep2,并将其过表达至HEK293T以及SH-SY5Y细胞中。Western印迹检测和免疫荧光分析以及免疫共沉淀结果表明,Pep1和Pep2可以在上述细胞系中表达,并与α-syn形成复合物,协助胞内蛋白酶体系统降解α-syn(P < 0.05, P < 0.0001)。进一步的细胞活力以及细胞毒性结果显示,Pep1和Pep2可以挽救α-syn引起的细胞活力的下降(P < 0.0001),并且可以缓解α-syn造成的细胞毒性的增加(P < 0.0001)。总之,本文的结果提示,肽段可以协助胞内蛋白酶体系统降解α-syn,并缓解α-syn造成的细胞损伤。本研究为短肽的研发、应用以及帕金森病的干预提供新的思路。

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技术与方法

老年小鼠肠道短链脂肪酸含量和菌群特征关联性探究

赵亚婷, 杨玲, 庞会婷, 罗朵生

中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(12): 1682-1690. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.10.1307

摘要 (577) PDF全文 (130)

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随着社会经济的发展,我国人口老龄化日益严重,衰老这个永恒的问题又一次引起人们的关注。肠道菌群失衡是衰老发生发展的关键因素,而短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)是介导菌群影响机体的主要方式之一。研究衰老、肠道菌群及SCFAs三者之间的关系,能够为临床通过干预肠道菌群影响SCFAs含量,进而延缓衰老的治疗策略提供依据。本研究收集雄性青年(4月龄)和老年(20月龄)C57/BL6J小鼠的粪便,建立8种(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸和庚酸)SCFAs的GC/MS含量测定方法。在青年小鼠和老年小鼠粪便中检测到乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸6种SCFAs,其中,乙酸、丙酸和丁酸含量较高。相较于青年小鼠,老年小鼠粪便中的乙酸(P<0.05)、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸含量均显著降低(P<0.001)。采用16S rRNA测序,分析肠道菌群组成结构和菌属相对丰度变化,发现Prevotella(P<0.001)、Gemmiger(P<0.05)等丰度增加,而Sutterella(P<0.001)、Coprococcus(P<0.01)、Ruminococcus(P<0.01)和Adlercreutzia(P<0.01)等丰度减少。利用冗余分析(redundancy analysis, RDA)分析SCFAs含量与菌群的关联性。结果表明,Coprococcus、Anaerorhabdus、Ruminococcus、Adlercreutzia和Sutterella等与SCFAs呈正相关,而Prevotella、Anaeroplasma、Roseburia、Clostridium和Gemmiger等与SCFAs含量呈负相关。本研究表明,老年小鼠与青年小鼠肠道中SCFAs含量及肠道菌群特征紧密联系。相关性分析表明,Coprococcus和Ruminococcus等可能为影响SCFAs及成为监测及延缓衰老进程的关键菌属。本研究结果为临床通过干预肠道菌群影响SCFAs含量进而延缓衰老的治疗策略提供实验依据。

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技术与方法

转基因大豆快速筛查方案及阳性多靶标质粒分子的构建

史宗勇刘璇许冬梅李夏莹陈子言梁晋刚王颢潜张雨琪温洪涛张秀杰高建华

. 0, (): 1540-1554.

摘要 (106)

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随着我国批准进口的转基因大豆转化体数量不断增加，亟需建立覆盖全面的快速筛查方案。另外，为了控制检测工作量，还需构建对应的多靶标质粒（Multiple targets plasmid，MTP）分子，作为大豆转基因成分检测的阳性物质。本文通过收集整理相关转化体的分子特征信息，获得了28种转基因大豆独立转化体的外源转化元件信息。全面分析其组成情况及使用频率，同时结合我国转基因检测相关标准方法，从而确定一套覆盖全面且检测靶标数量较少的筛查方案，并进行验证。然后，将这些靶标序列同时接入克隆载体，建立相应的MTP。最后，检测该MTP作为阳性质粒的适用性。通过分析，筛出8个检测靶标，包括CaMV 35S启动子（P-35S）、NOS终止子（T-nos）、耐除草剂基因pat、E9终止子（T-E9）、抗虫基因cry1Ac、AHAS启动子（P-AHAS）、pinII终止子（T-pinII）以及DP305423转化体的特征序列。使用这8个检测靶标并配合对大豆内标准基因Lectin的检测，可以全面筛查上述28种转基因大豆独立转化体。本文将其称为转基因大豆筛查的“8+1”方案。将这9种靶标的检测序列串联并接入pUC18质粒，获得MTP分子pDDSC-1910。使用该分子作为模板，对9种靶标进行定性PCR分析发现，均能获得特异性扩增产物，其大小与预期一致，且具有较高的灵敏度。本文建立了覆盖全面的转基因大豆筛查方案，并成功构建了相应的MTP分子作为阳性物质，为转基因大豆的高效筛查和检测工作提供便利。

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技术与方法

基于多靶标质粒分子的转基因大豆快速筛查方案

史宗勇, 刘璇, 许冬梅, 李夏莹, 陈子言, 梁晋刚, 王颢潜, 张雨琪, 温洪涛, 张秀杰, 高建华

中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(11): 1540-1554. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.10.1329

摘要 (427) PDF全文 (129)

可视化

随着我国批准进口和自主研制的转基因大豆转化体数量不断增加,亟需建立覆盖全面、检测靶标数量较少且符合国情的快速筛查方案。另外,为了控制检测工作量,还需构建对应的多靶标质粒(multi-targets plasmid, MTP)分子,作为大豆转基因成分检测的阳性物质。本文通过收集整理相关转化体的分子特征信息,获得了29种转基因大豆独立转化体的外源转化元件信息。全面分析其组成情况及使用频率,同时结合我国转基因检测相关标准方法,从而确定一套新的筛查方案。该方案包括8个检测靶标,CaMV 35S启动子(P-35S)、NOS终止子(T-nos)、耐除草剂基因pat、E9终止子(T-E9)、抗虫基因cry1Ac、AHAS启动子(P-AHAS)、pinⅡ 终止子(T-pinⅡ)和DP305423转化体的特征序列,以及1个大豆内标准基因Lectin。通过这9个靶标序列的检测,可全面筛查上述29种转基因大豆独立转化体。本文将其称为转基因大豆筛查的“8+1”方案。将这9种靶标的检测序列串联并接入pUC18质粒,获得MTP分子pDDSC-1910。为了验证该分子作为阳性物质的适用性,以其为模板,对9种靶标进行定性PCR分析,结果均能获得预期的特异性扩增产物,且表现出较高的灵敏度。因此,本文建立了一个覆盖全面的转基因大豆筛查新方案,并成功构建了相应的MTP分子作为阳性物质,为转基因大豆的高效筛查和检测工作提供便利。

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技术与方法

iSulf_wide-PseAAC: 基于集成支持向量机的蛋白质S-亚磺酰化预测方法

贾建华, 魏欣

中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(6): 822-829. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2021.04.1625

摘要 (389) PDF全文 (229)

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蛋白质S-亚磺酰化是可逆的蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs),在生物生长中发挥至关重要的作用。同时,它与一些疾病相关。因此,无论是从基础研究还是药物开发的角度,都面临着一个具有挑战性的问题:哪些是属于S-亚磺酰化位点？为了解决这个问题,本文开发了一种基于机器学习的预测方法。该系统主要步骤为:(1)将这些蛋白质组合成等长度的伪氨基酸;(2)使用下采样方法来平衡训练数据集;(3)通过集成方法建立一个综合的预测系统进行预测。最终,得到的独立测试集的准确率达到90.77％,其他各个指标对比现有方法提升效果明显,为生物信息学的发展提供了帮助。本文建立了一个友好的web服务器预测网站:http: //www.jci-bioinfo.cn/iSulf_Wide-PseAAC,通过该网站不需要复杂的计算公式即可在线预测,它将为用户提供便利和进一步研究的指南。与此同时,本文中使用到的数学方法会解决类似相关领域的诸多其他问题。

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技术与方法

MicroRNA-100-5p通过FGF21靶向调控羊驼黑素细胞的黑色素生成

贾琼,王瑞玮,胡世雄,范瑞文

中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(2): 244-250. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.12.1472

摘要 (338) PDF全文 (148)

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目前已知许多microRNA（miRNA）可以调节动物毛色及黑色素生成，但miR-100-5p调节黑色素的分子机制尚未完全了解。成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21, FGF21）是miR-100-5p的预测靶基因，萤光素酶报告基因检测结果表明，miR-100-5p通过与FGF21的3′非翻译区（3′UTR）结合来调节FGF21。在本研究中，用miR-100-5p过表达质粒和阴性对照质粒转染羊驼黑素细胞，结果表明，miR-100-5p过表达显著降低FGF21的mRNA和蛋白质表达。同时，抑制细胞外调控MAP激酶（extracellular regulated MAP kinase, ERK）信号通路，上调小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor, MITF）、酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）和酪氨酸酶相关蛋白2（tyrosinase-related protein 2, TYRP2），从而增加了黑色素的产生。结果表明，miR-100-5p可能通过ERK信号通路靶向FGF21，从而调节黑色素生成。

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技术与方法

细菌双杂交系统的优化及其应用

樊粉霞,赵文轩,阚飙

中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(2): 251-258. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.12.1556

摘要 (966) PDF全文 (792)

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细菌双杂交系统是一种用于检测体内蛋白质互作的方法，该方法互补腺苷酸环化酶功能，通过检测细胞表达的β-半乳糖苷酶LacZ的活性，分析蛋白质互作能力。但在应用过程中，发现存在操作繁琐、灵敏度低、难实现高通量操作等缺陷。本研究目的是对原有细菌双杂交进行优化，建立一种操作方便、可批量操作、具有较高灵敏度和能够实现实时监测的细菌双杂交系统，本研究成功构建由lacZ启动子控制的luxCDABE的报告质粒pBBR-lacZ-luxCDABE，引入原有的检测系统，新的判读标准并不影响原有的判读标准，本文通过快速灵敏地冷光观察菌落或测定菌液冷光值即可判读结果，优化后的双杂交系统，阳性对照组冷光值为阴性对照组的几十（霍乱弧菌为宿主）至几百倍（大肠杆菌为宿主），阴阳性结果判读差异明显，不仅节约实验成本，提高工作效率，又实现了连续监测。该系统不仅以大肠杆菌为宿主获得成功应用，宿主范围也扩展到霍乱弧菌。该系统通过质粒将lacZ启动子的拷贝数提高，减弱了非腺苷三磷酸（cAMP）因素引起的lacZ启动子活性的干扰，无需繁琐耗时的实验操作，为大批量的蛋白质互作分析及互作蛋白质的筛选提供了有利工具。

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技术与方法

基于功能化磁珠快速提取植物病毒RNA方法的建立与优化

王舒婷，马振男，李玲玉，龙丹丹，申少斐，王德富，牛颜冰

中国生物化学与分子生物学报. 2021, 37(1): 127-134. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.12.1549

摘要 (454) PDF全文 (163)

可视化

植物病毒病是制约作物生产的主要病害之一。及时明确其病毒病原和发展规律是有效控制其大规模传播的前提。而现有植物病毒病检测技术存在周期长、步骤繁琐、检测环境严苛等缺点。本研究以烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus，TMV)为模型，基于碱基互补配对原则设计针对TMV的功能化磁珠（CMBs-ACPTMV）进行RNA提取，并对功能化磁珠的制备条件、提取反应条件以及灵敏性和稳定性等性能进行优化分析。结果表明，当添加4 μmol捕获探针（ACPTMV）、0.08 mg羧基磁珠（CMBs）时，所制备的CMBs-ACPTMV吸附RNA的能力最好；当提取时间为3 min时，CMBs-ACPTMV提取RNA的效果最好，而改变CMBs-ACPTMV的提取温度时其提取能力无明显变化；性能评价分析发现，CMBs-ACPTMV的灵敏度可达2.5 ng/μL，且检测稳定性较好。与常规RNA提取技术相比，CMBs-ACPTMV在检测时间和样品消耗量上具有突出优势。本研究所建立的功能化磁珠提取法快速、安全和简便，只需简易设备便可实现植物病毒RNA的快速提取，具有广阔的应用前景。

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技术与方法

单细胞显微注射技术在原生动物草履虫研究中的应用

史磊，申香玉，申远

中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(12): 1508-1513. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.10.1324

摘要 (405) PDF全文 (956)

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对大多数单细胞原生动物的分子遗传学研究，目前还缺乏行之有效的转基因手段。针对这种情况，本研究以第四双小核草履虫为对象，将包含自身调控序列的草履虫纤毛内运输蛋白（intraflagellar transport，IFT）基因IFT43或IFT46插入表达载体Pzz02-GFP中，用单细胞显微注射术将重组质粒注入到第四双小核草履虫营养大核内。蛋白质免疫印记结果显示，与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标签偶联的IFT43或IFT46在草履虫细胞中表达，利用荧光显微镜或激光共聚焦成像系统观察，IFT43-GFP与IFT46-GFP融合蛋白显示出相似的纤毛定位，同时它们在草履虫多纤毛内的运输过程被动态记录。本研究表明，显微注射方法能够在草履虫细胞中实现外源基因转入和表达，在对单细胞模式生物的研究中具有广泛的应用前景。

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技术与方法

一种基于量子点免疫层析技术的轮状病毒检测方法

伍钢,张玉雪,韦佳塔,刘琪琦,陈海兰

中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(11): 1367-1373. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.09.1341

摘要 (457) PDF全文 (256)

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轮状病毒感染主要引起婴幼儿腹泻和胃肠炎，每年可导致数百万人住院治疗，对轮状病毒的快速测定是及时制定针对性治疗方案的关键，但现有检测技术存在或操作繁琐、耗时长，或灵敏度低、无法定量的问题。本研究将羧基化量子点微球与轮状病毒标记抗体Ab2偶联制备荧光标签，并喷涂在结合垫上，以轮状病毒捕获抗体Ab1和羊抗鼠IgG包被硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane, NC膜）分别作为检测线和质控线，将样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸组装到PVC底板上，并切割成3 mm宽的试纸条。采用轮状病毒抗原检测国家参考品和临床样本，对所制备试纸条的特异性、灵敏度、稳定性和有效性进行考察。试纸条最低检测限为86.46 pg/mL，与柯萨奇病毒A16型、肠道腺病毒71型、大肠杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌及金黄色葡萄球菌均无交叉反应，常温保存2个月未造成其灵敏度和特异性下降，检测临床样本的结果与商品化胶体金试纸条方法符合率为100%。本研究所建立的量子点免疫层析方法灵敏度高、特异性强、操作方便、结合便携式荧光检测设备可实现定量分析，可用于粪便等样本中轮状病毒的快速和定量检测。

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技术与方法

基于超氧阴离子探针观察原位软骨细胞线粒体及线粒体炫

胡晓青，程锦，张辛，敖英芳

中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(7): 858-864. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.04.1050

摘要 (502) PDF全文 (232)

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关节软骨是无血供组织。软骨细胞处于低氧环境中，细胞能量来源的大部分来自糖酵解，仅有一小部分来自线粒体氧化磷酸化。因此，软骨细胞中线粒体的功能一直未被重视，且局限于体外细胞研究。本文采用激光共聚焦显微成像技术建立了原位软骨细胞及其线粒体形态的观察方法，发现软骨细胞形态及线粒体密度与细胞所在层次相关。有文献表明，软骨细胞内线粒体源性活性氧（reactive oxygen species, ROS）可与促炎因子共同作用加速软骨组织退变。线粒体呼吸链电子漏产生的超氧阴离子是细胞内ROS的最主要来源。而超氧阴离子半衰期非常短，并且很容易自发地转化为过氧化氢，使它成为最难检测的ROS信号。新型超氧阴离子探针mt-cpYFP（mitochondrially targeted circularly permuted yellow fluorescent protein）是一种可特异性感受超氧阴离子的黄色荧光蛋白。本文基于mt-cpYFP转基因小鼠实时监测软骨细胞内超氧阴离子变化情况，发现原位软骨细胞在静息状态下存在量子化超氧爆发现象（线粒体炫）；同时，促炎因子白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）刺激软骨细胞后，线粒体炫活性增加。因此，我们建立了原位软骨细胞线粒体形态与超氧阴离子动态变化的检测方法，并进一步探讨了促炎因子对关节软骨细胞线粒体ROS产生的影响。

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技术与方法

基于高通量测序鉴定细菌RNA加工位点方法的开发

王娜，尤梦成，任振兴，许成钢

中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(6): 715-723. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.03.1482

摘要 (384) PDF全文 (143)

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简便的RNA剪切加工位点鉴定方法对于细菌核糖核酸内切酶功能和转录后水平调控机制的研究至关重要。本研究基于第二代测序技术，开发了一种能够精确鉴定RNA剪切加工位点及其剪切效率的高通量测序方法。在该方法中，首先将各种潜在RNA剪切加工的DNA片段分别克隆至报告系统进行转录，然后利用其下游特异引物进行反转录，直接构建约500 bp的双端测序cDNA文库，并在Illumina MiSeq平台对该文库进行测序。最后通过对reads 5′末端的比对定位，精确测定发生RNA剪切的位点。利用该方法，成功鉴定了来自Ruminiclostridium Cellulolyticum的cip-cel mRNA中的3个RNA剪切加工位点。与传统引物延伸和5′RACE等方法相比，该方法不仅具有更高的安全性和通量，同时还可像Northern印迹鉴定RNA的剪切效率。

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技术与方法

肥厚型心肌病致病基因热点突变位点Taqman-MGB探针检测方法的建立

王玉鑫,张世梅,闵婷婷,张琢奇,赵跃

中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(5): 592-600. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.03.1462

摘要 (530) PDF全文 (1965)

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肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）的分子遗传学基础为基因突变。本研究旨在建立一种用于HCM致病相关基因热点突变位点的Taqman-MGB实时荧光PCR检测方法。以HCM患者基因组为模板，根据设计好的引物进行PCR扩增，分别构建5个与HCM致病相关热点突变位点（MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c.2155C>T、TNNI3-c.433C>G和PRKAG2-c.298G>A）的野生型、纯合突变型和杂合突变型阳性质控品。以阳性质控品为模板，对5对引物和探针组合物的灵敏性、重复性和特异性进行验证。研究结果表明，对阳性质控品10倍梯度稀释(10^-1～10^-7)，PCR扩增标准曲线R2>0.996；批间和批内重复性验证其变异系数均小于2％；特异性验证显示，探针与模板匹配的荧光信号较强。以上结果表明，引物探针组合物的灵敏性、重复性和特异性较好。此外，以阳性HCM患者基因组为模板，对引物探针组合物进行回复性验证，其检测结果与毛细管电泳一致。综上所述，本研究利用Taqman-MGB实时荧光PCR检测技术，建立了经济、快速、灵敏的HCM热点突变位点检测方法。该方法的建立，有助于HCM临床分子诊断、治疗和愈后评估。

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技术与方法

一种新型免疫层析技术在临床乳腺癌Her-2蛋白定量检测中的应用

张洁莹，岳洋，邓桥生，糜军

中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(4): 467-473. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.03.1063

摘要 (535) PDF全文 (253)

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建立一种靶点蛋白质快速定量检测方法。在原有侧向流动免疫层析技术的基础上，通过优化层析材料和纳米微球的均一性、改进检测区的检测方法，经逐点扫描技术，建立标准浓度曲线，以达到对临床靶点蛋白质的定量检测。以乳腺癌组织中的Her2表达为例，通过对已知浓度样品的检测，验证本技术方法的准确度大于96%。另外，以蛋白质免疫印迹作为组织中特定蛋白质检测金标准，分析临床肿瘤组织中Her2蛋白的含量，其准确率也达到95.5%，而免疫组织化学方法检测准确率仅为69.58%。新型免疫层析法检测结果与靶向治疗患者的愈后密切相关（P < 0.01）。改进后的新型免疫层析方法能够准确地对临床靶点蛋白质进行定量检测，而且结合侧向流动技术的简单、快速和易用性，这种新型检测方法可以广泛应用于临床组织标本、血液标本和体液标本中靶点蛋白质的临场定量检测，在一定程度上可以替代免疫组化技术。

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技术与方法

猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达

林优红，程霞英，杨东风，姜永厚，邢少辰，韦正乙，韩蕊莲，梁宗锁，杨宗岐

中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(3): 350-356. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2020.01.1178

摘要 (605) PDF全文 (187)

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猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2, PCV2）可读框2（open reading frame 2,ORF2）基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白，能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体，是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease, PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径，本研究选择烟草叶绿体为表达平台，构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03，并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测，证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA 分析表明，Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达，具有免疫活性。此外，种子萌发研究结果显示，转基因烟草植株F1代具有aadA抗性，目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。

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技术与方法

利用滚环扩增鉴别同源家族miRNAs

赵斌，张新安

中国生物化学与分子生物学报. 2020, 36(1): 110-117. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2019.12.1311

摘要 (751) PDF全文 (537)

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滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）是一种基于病毒DNA复制而发明的新技术。近些年，RCA技术已经被广泛应用于微小核糖核酸（micro ribonucleic acid, miRNA）的检测。在miRNA检测研究领域中，鉴别高度同源的家族miRNAs成为该研究领域的瓶颈。本研究引入新型的RCA技术来增加鉴别的灵敏度和特异性，进一步提高家族miRNA鉴别的灵敏度，滚环扩增的程度用相对荧光强度来表示。研究结果显示，T4 RNA连接酶2可在RCA的环化过程中实现最大的环化效率，从而提高RCA的检测特异性。本文利用优化的RCA技术，实现对let 7高度同源的家族miRNAs高灵敏度的鉴别，灵敏度可达5 fmol。let 7a的滚环探针对Let 7a这一miRNA扩增后的相对荧光强度为1 550，而对其他的家族miRNA相对荧光强度仅为260。其他的家族miRNA探针在鉴别时相对荧光强度也显示了较大的差异。而依靠传统的RT-qPCR方法的鉴别灵敏度是4 pmol，与本研究相比，灵敏度低了近1 000倍。本研究的结果表明，利用RCA技术鉴别高度同源性miRNAs是高效灵敏的，此前未见相关研究的报道。RCA技术可能被应用于miRNA高灵敏度检测和鉴别的相关研究中。

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技术与方法

模型膜实验方法在β淀粉样蛋白与细胞膜间相互作用中的应用与改进

石镜明，白彩娟，李岩松，张海骄，孙正启

中国生物化学与分子生物学报. 2019, 35(12): 1409-1418. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2019.11.1353

摘要 (573) PDF全文 (165)

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β淀粉样蛋白(amyloid β peptide，Aβ)与细胞膜间的相互作用很可能是阿尔茨海默症病(Alzheimer disease, AD)重要的风险因素。模型膜研究方法在该领域的应用和更新持续至今，但仍存在一些问题有待解决，例如，Aβ插膜后聚集状态与Aβ融合到脂质体膜聚集状态的差异，Aβ插膜后形成微通道的时间及与磷脂成分的关系等。本文试图解析这两个问题，同时，系统地总结出常用的和更新的模型膜研究方法，这些方法包括单层膜插膜及电镜样品的制备，脂质体制备方法的改进，脂质体膜上Aβ42经过高盐及酸清洗后的Western 印迹检测，ANTS-DPX研究脂质体泄漏等。研究结果显示：(1)胞外及膜内Aβ42单体与脂质体膜作用后的聚集状态存在差异，Aβ42单体插膜后更容易聚集成纤维，而膜内融合的Aβ42呈现寡聚体形式；(2) Sepharose CL-4B柱过滤比微型挤出器制备的脂质体更加均一分散；(3)Aβ42在膜上形成微通道很可能是一个缓慢的过程，且与脂质体的磷脂种类相关。这些方法为Aβ42与细胞膜的相互作用提供了实用的研究手段，同时也为其他膜蛋白质与细胞膜的相互作用提供了可以借鉴的办法。研究结果使β淀粉样蛋白代谢过程更加清晰。

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技术与方法

黑色素瘤细胞单域抗体文库的构建及鉴定

姬凯元,齐淑慧,刘博,蒋书东,范瑞文,董常生

中国生物化学与分子生物学报. 2019, 35(11): 1294-1302. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2019.11.15

摘要 (506) PDF全文 (251)

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黑色素瘤作为一种多发于皮肤部位的恶性肿瘤，严重危害着动物和人们的健康。与传统抗体比较，单域抗体具有结构简单、分子量小、免疫原性弱等特点，使其在疾病的诊断及治疗方面具有广阔的应用空间。本研究以B16-F10细胞蛋白质为研究对象，通过反复冻融与超声破碎相结合的方式获得B16-F10蛋白质作为抗原，免疫成年雄性羊驼。采用噬菌体单域抗体展示技术，构建了质量优良的B16-F10细胞蛋白质单域抗体免疫文库，其库容为5.76 × 10¹⁰，VHH重组率为96%，文库丰度为3.00 × 10¹⁰个/mL。该结果为研究黑色素瘤的生物学特性提供了新思路，同时也为后续筛选B16-F10单域抗体奠定了基础。

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技术与方法

RT-PCR检测HUTP14A mRNA时排除假基因HUTP14C干扰的方法

许阁阁, 刘小锋, 张春凤, 杜晓娟

中国生物化学与分子生物学报. 2019, 35(10): 1155-1165. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2019.10.15

摘要 (633) PDF全文 (153)

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人类U3蛋白14C基因(HUTP14C)是人类U3蛋白14A基因(HUTP14A)的假基因。两者转录本序列同源性高达95%。常规RT-qPCR技术在检测HUTP14A mRNA丰度时，HUTP14C的存在会影响检测结果。本研究旨在建立检测HUTP14A mRNA时排除HUTP14C干扰的RTPCR方法。本研究设计出能分别从多种肿瘤细胞DNA和RNA中特异性扩增HUTP14A和HUTP14C的引物，避免假基因HUTP14C对其同源基因HUTP14A检测的干扰。在检测细胞系HUTP14A mRNA时，通过DNaseⅠ消除RNA中污染的HUTP14C DNA，用靶向HUTP14C 3′-UTR的siRNA沉默HUTP14C mRNA后，再用RTPCR检测HUTP14A mRNA丰度，使结果更加准确。在18对肝癌及癌旁组织中，利用特异性引物进行RTPCR检测，HUTP14A和HUTP14C mRNA的表达略高于癌旁组织。本研究提示，针对有假基因存在的功能基因，对其mRNA丰度进行检测时，在提取细胞或组织总RNA后，用DNaseⅠ处理，再用RNA直接进行PCR扩增，排除DNA污染后，再进行RT-PCR或RT-qPCR扩增。大多假基因具有较长的3′-UTR区，在该区域设计siRNA特异性沉默假基因的mRNA后，用RT-qPCR检测功能基因的mRNA丰度，可以排除假基因mRNA的影响。在病理组织中检测功能基因的mRNA丰度时，可以根据假基因和其功能基因的序列差异设计出特异扩增功能基因的引物，从假基因的3′-UTR区设计特异扩增假基因的引物，通过RT-qPCR技术分别检测二者的mRNA。

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