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• 2023年, 39卷, 第4期
  刊出日期：2023-04-20

    

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  核糖核酸酶A专栏
  综述
  研究论文
  
  

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核糖核酸酶A专栏
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  核糖核酸酶A专栏导读

  许正平

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 477-477. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.03.0136

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  长久以来，我们“顾名思义”，“理所当然”地认为核糖核酸酶A的功能就是降解核糖核酸（RNA）。事实上，随着研究的深入，发现该家族不少成员不仅能降解RNA，而且能精准地在特定位点切割RNA产生功能性非编码RNA，甚至具有“非酶”功能！例如，我们课题组研究的核糖核酸酶A超家族成员5（ribonuclease 5，也称angiogenin，中文译为“血管生成素”）不仅以酶的形式参与RNA代谢（主要是rRNA、tRNA和miRNA），而且能以转录因子的方式促进rRNA转录、以细胞因子的方式调控细胞行为、作为细胞内分子机器的一个成员与蛋白质相互作用；不仅是一个应激响应蛋白质，而且在维持细胞/组织稳态中发挥重要作用。因此，在《中国生物化学与分子生物学报》编辑部的支持下，本专栏邀请了国内从事核糖核酸酶A研究的专家，结合自己的研究专长，分别从核糖核酸酶A超家族的研究历史、发挥多种生物学功能的结构基础、在肿瘤发生发展中的作用、抗微生物作用、活性检测方法等角度系统综述了该家族的研究进展，并在同一实验条件下系统评估了该家族在人体中的8个典型成员的抗菌活性。 首先，本课题组回顾了核糖核酸酶A超家族的研究历程，探讨了未来的研究方向，特别呼吁要系统研究该超家族成员除降解RNA外的其他生理病理功能；为吸引大家的关注，特别将文章题目定为“核糖核酸酶Ａ超家族：不仅仅是一组降解RNA的酶”。其次，为帮助读者更好地理解该家族成员发挥不同作用的原因，邀请从事人源核糖核酸酶A免疫调节研究的四川农业大学陆路副教授撰写“人核糖核酸酶Ａ家族生物学功能的结构基础”，概述了决定家族成员酶活性、抗微生物特征、免疫调节等生物学功能的结构基础。近年来，美国德州大学安德森癌症中心的洪明奇教授、塔夫茨大学的胡国富教授等团队相继报道了核糖核酸酶A超家族成员1、4、5、7等在不同肿瘤中的作用，引发了学术界的兴趣。为此，本专栏邀请在tiRNA等非编码RNA与肿瘤领域有深厚造诣的宁波大学郭俊明教授全面综述了“核糖核酸酶Ａ家族典型成员在肿瘤发生中的作用”。为深入理解该超家族成员对微生物的杀伤活性及内在机制，本专栏邀请长期从事微生物与宿主相互作用、最近专门研究家族成员1、2、5与先天免疫关系的哈尔滨医科大学张凤民教授撰写“人核糖核酸酶Ａ超家族抗微生物活性及其作用机制”，对各成员的抗微生物（包括病毒、细菌、真菌）和抗寄生虫活性及其作用机制进行系统综述，并展望了其作为抗微生物活性物质和天然免疫分子在治疗严重和耐药微生物感染中的应用前景。为帮助读者系统了解当前的核糖核酸酶A活性检测方法，邀请创新研发了多种新型检测技术的湖南大学刘斌教授撰写“RNase A活性检测及其在癌症靶向治疗中的应用”，不仅介绍了基于传统技术的酸溶法、凝胶电泳法、电化学法方法和液滴微流体法，而且全面总结了基于荧光探针技术的新型活性检测方法。最后，考虑到当前世界各实验室对该家族成员的抗菌活性报道不一致，安排浙江大学的盛静浩副教授组织队伍，在同一实验条件下以半致死浓度评估了人源8个典型成员对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌活性，为正确认识该家族的抗菌活性提供了参考。 希望通过本专栏的文章，让大家更全面地认识核糖核酸酶A超家族成员的功能及其在临床诊疗、甚至疾病预警预防的应用前景，吸引更多的研究者投入到相关领域的研究中，以期全面、深入地解析该家族成员的生理病理功能。
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  核糖核酸酶A超家族:不仅仅是一组降解RNA的酶

  刘亚欣, 许正平

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 478-485. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.02.1475

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  核糖核酸酶A超家族(ribonuclease A superfamily;RNase A superfamily),也称脊椎动物分泌型核糖核酸酶超家族(vertebrate secreted ribonucleases superfamily),是二十世纪蛋白质结构、酶学和分子进化领域研究最多最广泛的核糖核酸酶家族。自上世纪初期从牛胰腺中分离鉴定第一个成员以来,已从哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鸟和鱼等几百种动物中鉴定了几千个成员。早期对该家族成员的研究不仅促进了蛋白质化学技术的发展,而且为现代生物学研究奠定了基础。目前已知人的核糖核酸酶A超家族成员包括8个典型成员(RNase 1 ~ RNase 8)和5个非典型成员(RNase 9 ~ RNase 13)。功能方面,曾一度以为该家族成员只具有降解核糖核酸的能力。随着血管生成素(angiogenin; RNase 5)、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素(eosinophils-derived neurotoxin, EDN; RNase 2)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophils cationic protein, ECP; RNase 3)的发现,人们意识到该家族成员除了消化核糖核酸外,还有依赖酶活性和不依赖酶活性的其他功能,包括宿主防御、免疫调节、血管生成和肿瘤抑制等,但仍了解不够全面。本文回顾了核糖核酸酶A超家族的研究历程,探讨了未来研究方向,特别呼吁要系统研究其除降解核糖核酸外的其他生理病理功能,希望能为该领域的研究提供思路。
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  人核糖核酸酶A家族生物学功能的结构基础

  张安静, 陆路

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 486-497. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.02.1450

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  人核糖核酸酶A(ribonuclease A, RNaseA)家族成员有13个,分别为RNase1-RNase13,它们具有很高的序列相似性,大多含有6～8个半胱氨酸并形成分子内二硫键,以维持特有的空间结构。其中,RNase1-RNase8具有多种生物活性,可概括为3类:涉及核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解;具有抗细菌、抗真菌和抗病毒活性;以及机体免疫调节作用。而RNase9-RNase13不具有核糖核酸酶活性。因此,本文将重点对RNaseA家族成员RNase1-RNase8的结构与功能研究进行综述,重点概述决定RNaseA生物学功能的结构特征,以期指导以RNaseA为基础的抗微生物药物开发及RNaseA在机体免疫中的功能研究。
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  核糖核酸酶A家族典型成员在肿瘤发生中的作用

  孙德森, 郭俊明

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 498-506. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.01.1462

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  人体中核糖核酸酶A(ribonuclease A,RNaseA)家族包含8个典型成员(RNase 1至RNase 8)。已有研究显示,除RNase 8外,该家族其它典型成员影响了胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌和皮肤癌等多种肿瘤的发生发展。在肿瘤发生过程中,特定RNase表达量及糖基化修饰会发生显著改变,是肿瘤诊断的潜在标志物;它们能以多种机制参与肿瘤发生、生长和转移等过程,有望成为肿瘤治疗的靶点;而部分成员则具有杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤发展的功能,存在临床开发成肿瘤治疗药物的可能。具体而言,RNase 1通过核糖核酸酶活性依赖的细胞毒性和细胞外RNA降解功能,发挥直接杀伤肿瘤细胞或降低局部炎症而抑制肿瘤生长的作用;RNase 1还能结合并激活促红细胞生成素,产生肝细胞癌受体相互作用蛋白A4 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor-interacting protein A4, EphA4)信号通路,促进乳腺癌的发生。RNase 2 和RNase 3是嗜酸性粒细胞颗粒蛋白质的重要成分,依赖于阳离子性及核糖核酸酶活性在抗肿瘤免疫防御中发挥重要作用。RNase 4和RNase 5则通过诱导血管生成、加快肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡等方式,促进肿瘤发生发展。其中RNase 5发挥作用的分子机制包括促进47 S前体rRNA转录和激活促肿瘤生长的信号通路,以及产生tRNA衍生的应激诱导的RNA(tRNA-derived stress-induced RNA,tiRNA)等。虽然RNase 6和RNase 7与肿瘤的发生存在相关性,但其具体作用及机制的研究仍较少。本文总结了RNase A 家族典型成员与肿瘤的相关性和作用机制,并对其临床应用前景进行了展望,以期为肿瘤治疗药物的开发提供新思路。
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  人核糖核酸酶A超家族抗微生物活性及其作用机制

  黄萍, 孟庆泰, 张凤民

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 507-515. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.10.1293

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  人核糖核酸酶A(human RNase A)超家族包含13个具有不同生物活性的成员(RNase 1~RNase 13),其蛋白质结构除具有催化保守序列外,还具有显著多样性的序列,决定了人类核糖核酸酶A可发挥核糖核酸酶活性之外的生物学功能。人核糖核酸酶A超家族成员在多种免疫细胞例如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中表达,并可被分泌以发挥多种多样的生物学功能,包括抗微生物活性、促进宿主防御、参与血管生成及精子成熟等。其中,人核糖核酸酶A超家族部分成员,可通过水解病毒RNA、抑制病毒复制、破坏细菌细胞壁、促进微生物凝集、损伤寄生虫细胞膜和线粒体膜等直接作用,以及通过宿主天然免疫细胞介导的间接作用,发挥抗微生物及寄生虫活性,参与宿主防御。本文对人核糖核酸酶A的抗微生物(包括病毒、细菌、真菌)和抗寄生虫活性及其作用机制进行综述,并对人核糖核酸酶A作为抗微生物活性物质和天然免疫分子,用于治疗严重和耐药微生物感染的前景进行展望。
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  RNase A活性检测及其在癌症靶向治疗中的应用

  覃艳, 陶雪晴, 刘斌

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 516-523. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.03.1609

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  核糖核酸酶 A(RNase A)是一种广泛应用于酶学、生物化学、结构生物学等领域研究的工具酶,能特异性水解 RNA 的胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)残基,能有效杀伤肿瘤细胞及抑制 HIV-1 病毒复制。研究表明,RNase A 家族成员参与细胞增殖、存活、发育和分化,迁移和入侵等多种生理和病理过程;人体内 RNase A 活性和蛋白质表达水平与胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌和甲状腺癌等肿瘤发病密切相关。准确监测 RNase A 水平有助于阐明肿瘤发病分子机制、药物筛选、临床诊断和预后评估;此外,RNase A还具有通过裂解细胞内 RNA 分子,诱导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞的功能,是一类具有广泛应用前景的抗肿瘤蛋白质药物。基于纳米技术将具有治疗功能的RNase A输送至细胞特定靶向部位,实现抗肿瘤功能的蛋白质靶向疗法,已表现出良好的应用前景。本文重点讨论RNase A 现有活性检测方法及其在靶向治疗相关疾病中的应用,旨在为RNase A临床应用和靶向药物筛选提供参考。
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  核糖核酸酶A超家族抗菌活性评价

  朱泽浩, 励航宇, 孙钧, 盛静浩

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 524-530. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.03.1548

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  抗菌肽是机体重要的免疫防御分子,具有广谱杀菌活性。核糖核酸酶A是脊椎动物特异性的分泌型蛋白质,在人基因组中包含8个经典成员(RNase1-8)。它们作为一类重要的抗菌肽,广泛分布于机体需要抵抗外界病原微生物的组织中,除了特有的生物学功能外,均具有一定的抗菌活性。然而,目前各实验室对它们抗菌活性的报道并不一致,有必要开展横向比较分析。为此,我们表达纯化了人核糖核酸酶A超家族8个成员的重组蛋白质,并在同一实验条件下以半致死浓度评估了它们对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抗菌活性。结果显示,RNase1-8重组蛋白质对大肠杆菌半数致死浓度分别为:0.081,0.046,0.008,0.250,2.028,0.072,0.001 μmol·L^-1和1.1416 μmol·L^-1;对金黄色葡萄球菌半数致死浓度分别为:3.427,1.856,2.211,5.188,8.274,4.356,2.502 μmol·L^-1和9.916 μmol·L^-1。该结果提示,RNase1-8对大肠杆菌的抗菌活性存在明显差异,其中RNase3和RNase7活性最强,且均显著高于各自对金黄色葡萄球菌的抗菌活性;8个成员对金黄色葡萄球菌的抗菌活性无明显差异。据此我们认为,核糖核酸酶A超家族对革兰氏阴性菌具有较好的杀伤活性,可用于革兰氏阴性菌抗菌产品的开发。
综述
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  α-突触核蛋白的结构生物学研究

  李冬青, 秦晓红, 米立志

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 531-544. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.07.1209

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  α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集形成纤维状结构,进而形成路易小体(Lewy bodies,LBs)。LBs是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)和路易小体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB)等神经退行性疾病的典型细胞病变特征,也是发病的一个关键环节。近年来,冷冻电镜技术的进步使解析高分辨率α-突触核蛋白原纤维结构成为可能。对α-突触核蛋白不同聚集形态的深入探究,能为理解神经退行性病变的分子机制、α-突触核蛋白毒性形式的性质以及α-突触核蛋白聚集影响的信号途径等提供帮助。本文综述目前已知的不同形态 α-突触核蛋白结构,阐述α-突触核蛋白单体、寡聚体和不同聚集形式原纤维的结构特征。α-突触核蛋白寡聚体由于其结构不稳定,目前尚无明确的结构信息。但目前已有多个α-突触核蛋白原纤维结构被解析,包括重组蛋白体外制备的和多系统萎缩(MSA)患者体内分离的原纤维。这些原纤维直径由5 nm的单股原纤维至10 nm的双股原纤维不等。不同的体外制备条件可生成不同构象与聚集形式的α-突触核蛋白原纤维,表现出结构异质性。部分家族性PD相关的α-突触核蛋白突变位点位于原纤丝间的相互作用界面。本文依据α-突触核蛋白原纤维中单体的结构和原纤维的组装形式,对α-突触核蛋白原纤维的结构进行分类归纳,以期为探索针对α-突触核蛋白结构的PD诊断与药物开发提供信息。
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  翻译后修饰介导的相分离在神经退行性疾病中的作用

  周洋洋, 孙星, 叶茂

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 545-552. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.09.1211

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  近几年,生物大分子的液-液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)的研究受到极大关注。相分离是指生物大分子在细胞内的一种特殊动态聚集状态,处于相分离态的生物大分子,例如蛋白质也被比作“无膜细胞器”。这类无膜细胞器介导细胞的各种生理活动和功能,对细胞的基因表达、信号传导、应激响应等有着重要的作用。在正常的生理状态下,体内相分离是动态变化且维持稳态性,一旦出现异常的相分离则预示着疾病的发生,包括神经退行性疾病、肿瘤和炎症等。神经退行性疾病是神经元和神经髓鞘功能异常或丧失进而出现认知、运动和语言障碍的一类疾病,这类疾病的发病机制主要包括基因突变、蛋白质异常聚集、氧化应激异常和线粒体功能异常等。神经退行性疾病中蛋白质异常聚集被证明是相分离现象,例如Tau(microtubule-associated protein-Tau)异常相分离诱发的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、FUS(fused in sarcoma/translocated in liposarcoma)相分离诱发的肌萎缩脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等。蛋白质的翻译后修饰(PTM)在调控细胞功能中具有重要作用,通过磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰影响蛋白质相分离的发生和进程。本文将从蛋白质相分离的概念、相分离发生的生物化学基础以及翻译后修饰调控的相分离在神经退行性疾病的作用进行阐述。
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  用于癌症免疫治疗的CAR-NK细胞递送技术

  张晓娟, 郭小刚, 吴东颖

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 553-561. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2022.05.1156

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  嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)工程化T (CAR-T)细胞在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得显著成功,成为肿瘤免疫治疗的临床热点。然而,CAR-T细胞在对抗实体恶性肿瘤方面并未表现出太大的优势,因此,需要寻找新的效应细胞作为CAR修饰的候选细胞进行研究。最近,自然杀伤(natural killer, NK)细胞已成为CAR工程化的安全有效平台。CAR-NK细胞可被设计成能够靶向多种抗原的工程化细胞,以增强体内增殖力和持久性,增加对实体瘤的浸润,克服耐药性肿瘤微环境,最终实现有效的抗肿瘤反应。尽管NK细胞具有巨大的潜力,但已被证明难以改造,对细胞凋亡具有高敏感性且基因表达水平低。因此,对基因导入NK细胞的方法进行优化,会促进CAR-NK在研究和临床中的广泛应用。本文综述近年来NK细胞基因工程递送技术的改进,以及为增强NK细胞效应功能而实施的策略,包括NK细胞生物学特性、高效和安全的CAR构建体的设计、递送含CAR转基因载体的种类分析及提高转导效率方法的优化,以更好地靶向恶性肿瘤或抑制肿瘤的微环境,并进一步探讨CAR-NK相关研究中存在的问题和挑战,为恶性肿瘤相关疾病的治疗提供新的思路和方向。
研究论文
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  GCNT3通过PI3K/Akt/mTOR和RhoA/ROCK/Cofilin途径促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

  刘丽, 王哲近, 潘邦伦, 刘林, 王刚林, 李伟, 金晶

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 562-572. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.02.1459

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  β-1,3-半乳糖- O -糖基-糖蛋白β-1,6- N -乙酰氨基葡萄糖转移酶(β-1,3-galactosyl-O-glycosyl-glycoprotein β-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase, GCNT3)是黏液蛋白质生物合成中不可缺少的一类N -乙酰葡萄糖转移酶。越来越多的证据表明,GCNT3的异常表达与肿瘤的侵袭以及病人的生存率有关,然而相关的研究仍较少报道。本研究旨在揭示GCNT3在调控肝细胞癌进程中的潜在机制。本研究首先利用高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)和癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas databases, TCGA)数据库分析肝癌和正常组织中GCNT3的 mRNA表达水平,结果表明,肝癌组织中GCNT3的 mRNA表达水平高于正常组织(P≤0.001)。同时利用免疫组化、Western印迹进一步分析了肝癌组织、癌旁组织、正常组织中GCNT3蛋白的表达,发现有30%肝癌组织GCNT3表达水平高于癌旁组织和正常组织。随后,在肝癌细胞系 HCCLM3 和 Huh7细胞中,采用CCK-8、平板克隆、划痕实验、Transwell实验分析GCNT3对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,结果显示,敲低GCNT3可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而过表达GCNT3发挥相反作用。细胞周期和Western印迹结果显示,GCNT3调控G_0/G₁期关键蛋白质的表达来促进肝癌细胞周期G₁/S的转换。进一步探究发现,GCNT3可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进细胞增殖;以及GCNT3上调RhoA/ROCK/Cofilin通路关键蛋白质的表达来促进F-肌动蛋白(F-actin)的形成,从而参与细胞的迁移和侵袭。总之,本研究通过对GCNT3在肝癌细胞中的功能分析,初步证明,GCNT3与肝癌细胞增殖、迁移和侵袭中的功能有关,证实了GCNT3在肝癌临床治疗中的潜在价值,为肝癌治疗和诊断提供了新思路。
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  果蝇翅芽特异表达Gal4的筛选及活力检测

  张徐波, 赵文婷, 付艺杰, 杨淑敏, 董玮

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 573-579. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.02.1505

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  筛选并鉴定在果蝇翅芽不同区域特异表达的Gal4,可为以果蝇翅为模型的相关研究提供更多的遗传工具。本研究对Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) 未见详细报道的Gal4品系进行筛选,将其中12个候选Gal4品系的雄虫与UAS-GFP基因型的处女蝇分别杂交,检测Gal4在子代幼虫翅芽的表达位置。经筛选重点关注3个Gal4,并以翅芽特异隔间标记物为参照,精确表征Gal4在翅芽的表达部位。结果显示:c563a-Gal4在前隔间翅囊区边缘及部分铰链区表达;c804-Gal4在围绕翅囊的环形区域以及A/P边界的细胞条带处表达;GMR11F02-Gal4在整个翅囊区表达;利用G-TRACE技术对上述Gal4的细胞发育谱系进行追踪,进一步揭示了翅芽发育历程中开启Gal4表达细胞的子代细胞分布区域;同时,通过驱动特定靶基因myc的表达,检测Gal4激活靶基因表达的活力。结果表明,3种Gal4都可以有效激活靶基因myc。其中,GMR11F02-Gal4的活力最强,c563a-Gal4最弱。本研究为翅芽相关研究提供新的遗传工具选项。
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  在不同形式的运动中,自噬可改善2型糖尿病小鼠认知功能障碍

  张源源, 张蒙, 朱悦, 钱帅伟, 寇现娟

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 580-590. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.02.1508

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  2型糖尿病(T2DM)是一种代谢性疾病,易造成认知功能障碍。T2DM小鼠脑内自噬水平与认知功能下降有关。运动可以改善T2DM认知水平,但具体机制仍不清楚。本研究旨在探讨自噬在不同形式的运动干预改善T2DM小鼠认知功能障碍中的作用及分子机制。取雄性4周龄C57BL/6小鼠随机分成:对照组(C)、T2DM模型组(DM)、T2DM运动组和T2DM自噬抑制剂组。T2DM小鼠通过高脂饲养联合腹腔注射STZ造模。运动组采取跑台(T)、爬梯(R)、跑台联合爬梯(M);抑制剂组采用腹腔注射氯喹(CQ)(10 mg/kg),分为T2DM单纯抑制剂组(DM+CQ)、T2DM+CQ+跑台干预组(DM+T+CQ)。免疫荧光染色显示,3种运动干预均可降低T2DM小鼠海马组织Iba-1阳性细胞数量及荧光强度(P＜0.05),降低小胶质细胞NLRP3荧光强度(P＜0.05)。Western印迹结果显示,3种运动干预均可降低T2DM小鼠海马iNOS、GFAP、Iba-1蛋白质表达,增加Arg-1蛋白质表达,其中M组均有显著性差异(P＜0.05);3种运动干预均可降低T2DM小鼠海马NLRP3复合物蛋白质表达,其中M组均有显著性差异(P＜0.05),T组除NLRP3蛋白外均有显著性差异(P＜0.05);3种运动干预均可降低T2DM小鼠海马Bax、p62蛋白质表达,增加Bcl-2、LC3蛋白质表达,其中M组与T组均有显著性差异(P＜0.05)。加入氯喹的水迷宫结果显示,抑制自噬加重T2DM小鼠认知障碍(P＜0.05),降低运动对T2DM小鼠认知的保护作用;免疫荧光染色及Western印迹显示,DM+T+CQ组较T组存在自噬功能障碍。Western印迹结果显示,与DM组相比,DM+CQ组iNOS、GFAP、NLRP3、切割胱天蛋白酶 1(cleaved caspase-1)蛋白质表达增加,Iba-1、胱天蛋白酶 1、Bax蛋白质显著增加(P＜0.05);与T组相比,DM+T+CQ组NLRP3、切割胱天蛋白酶1、Bax蛋白质显著增加(P＜0.05),Bcl-2蛋白显著减少(P＜0.05)。综上所述,不同形式的运动干预均能改善T2DM小鼠神经炎症及神经细胞凋亡,综合比较,有氧运动和有氧联合抗阻运动干预效果较好,其机制可能是运动激活神经元自噬、降低神经炎症与胶质细胞活化、抑制神经元凋亡。
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  海水酸化对贻贝外套膜蛋白质组的急性影响

  李迎澳, 王莹, 范孝俊, 刘菲, 梁泽玮, 张晓林, 严小军, 廖智

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 591-604. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.03.1547

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  海洋酸化是当前最主要的环境问题之一,对海洋生物的生存带来严重影响。为了解海洋酸化对贻贝的急性影响以及贻贝在海洋酸化条件下的分子应对策略,设置正常海水(pH 8.1)和酸化海水(pH7.3)2种条件对厚壳贻贝进行48 h急性培养,之后采用定量蛋白质组学手段,对贻贝外套膜在2种培养条件下的蛋白质组成及含量变化开展分析与比较。总计在厚壳贻贝外套膜中鉴定到蛋白质4 038种。其中,急性酸化导致395种蛋白质含量产生显著变化(表达量倍数差异>1.2,P<0.05)。其中上调蛋白质197种,下调蛋白质198种。差异蛋白质主要包括信号转导、蛋白质翻译及翻译后修饰、转录、氨基酸、脂质和碳水化合物的合成及转运等生物功能相关蛋白质。进一步对差异蛋白质开展GO和KEGG功能富集,分析结果表明,差异蛋白质主要富集于细胞骨架、免疫调节、氧化调节、以及生物矿化相关途径,且受酸化影响较大(P<0.05)。上述结果表明,厚壳贻贝外套膜在急性酸化条件下可能通过上调部分生物矿化,蛋白质折叠、渗透压调节以及免疫调节相关蛋白质来应对酸化的威胁。
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  恰玛古多糖联合顺铂对人肝癌细胞的协同抑制作用及中效原理评价

  孔涵蕊, 李欣奕, 张心慧, 陈赛翕, 刘政良, 努尔阿米乃·麦麦提, 李金玉

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 605-614. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.02.1536

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  采用中效原理评价恰玛古多糖(BRCPe)联合顺铂(cisplatin)对人肝癌细胞(HepG2)的协同抑制作用,并考察体外对HepG2凋亡、迁移等生物学行为的影响,阐明其可能的分子机制。用不同浓度的BRCPe、Cisplatin及二者联合用药作用于HepG2细胞24 h、48 h,MTT法检测药物对HepG2细胞的增殖抑制作用,根据中效原理分析两药联合作用的效应(fa)与联用指数(CI)的关系,探讨药物间的相互作用;细胞划痕实验考察药物单独或联用后对细胞迁移的影响;Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡形态;Western 印迹检测凋亡相关蛋白质表达水平。两种药物单独或联用均显著抑制了HepG2细胞的增殖;由中效原理计算得知,两药联用抑制HepG2细胞增殖作用增强,存在协同效应;划痕实验显示,两药联用对HepG2细胞的迁移抑制效果优于对照组和单独作用组;Hoechst 33258荧光染色揭示,联合用药组细胞核染色体凝聚现象加剧;Western 印迹分析结果显示,联合用药细胞内Bax,Cyt C,Cleaved Caspase-9/7/3,PARP表达上调,Bcl-2下调。BRCPe与Cisplatin联用对HepG2产生协同抑制效应,其协同机制与诱导线粒体途径介导的细胞凋亡有关。
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  负载丹皮酚外泌体对缺血性脑卒中大鼠线粒体功能障碍的保护作用

  齐梓彤, 刘薇, 雒慧钧, 黄纪安, 史一杰

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 615-621. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.01.1458

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  外泌体(exosome,EXO)作为一种天然的药物递送载体,具有穿透血脑屏障,细胞靶向性等优势,丹皮酚(paeonol, PAE)在线粒体保护方面具有潜力。然而,外泌体包裹丹皮酚(exosome-paeonol,EXO-PAE)是否能改善脑缺血再灌注损伤中神经元线粒体功能障碍尚不清楚。本研究旨在探讨EXO-PAE对受损神经元内线粒体功能的影响。本文以线栓法制备SD大鼠短暂性大脑中动脉缺血性模型(transient middle cerebral artery occlusion model, tMCAO)。大鼠清醒后出现同侧Horner综合征,出现向对侧转圈爬行等行为。本文采用超速离心法制备小胶质细胞衍生的外泌体,透射电子显微镜和Western 印迹结果表明,EXO-PAE中有特异性标志物Alix和CD63的表达,上清中则未表达。在细胞水平,EXO-PAE有效降低了细胞内ROS水平(P<0.01),提高了ATP的表达(P<0.05)和线粒体膜电位(P<0.01),表明EXO-PAE改善了神经元线粒体功能障碍。Tunel法与MTT的结果表明,EXO-PAE降低了神经元细胞凋亡(P<0.01)。Western印迹结果显示,EXO-PAE恢复线粒体融合蛋白质Mfn2(P<0.01)与Opa1(P<0.05)以及分裂蛋白质Drp1的表达(P<0.01),可能是改善线粒体功能障碍、降低神经元凋亡的重要机制。动物水平上,TTC染色检测大脑组织病理结果表明,EXO-PAE能有效地减少脑梗塞面积(P<0.001)。综上所述,该文初步成功构建了EXO-PAE递药系统,EXO-PAE可改善线粒体功能障碍,并有可能发挥治疗缺血性脑卒中的作用。
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  RNA结合蛋白Aly/REF输出因子通过上调Yes相关蛋白表达促进胃癌细胞的增殖和迁移

  李睿, 邵爽, 孟玮, 金丹, 郭纪伟

  中国生物化学与分子生物学报. 2023, 39(4): 622-630. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2023.02.1378

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  胃癌是一种常见的发病率高、起病隐匿、侵袭性强的消化道恶性肿瘤,其发病机制错综复杂。RNA结合蛋白Aly/REF输出因子(RNA binding protein Aly/REF export factor,ALYREF)作为一种RNA胞嘧啶的5-甲基化修饰(m⁵C)后的结合蛋白质,在调控RNA出核及稳定其表达的过程中具有关键作用;Yes相关蛋白(yes-associated protein, YAP)作为Hippo-YAP信号通路中的关键分子,调控各种恶性肿瘤的生长和转移。本文旨在探讨ALYREF与YAP在促进胃癌细胞增殖和迁移中是否存在相关性,并初步探索这两者之间的作用机制。本文在胃癌细胞AGS和MKN-45中运用RT-PCR和Western 印迹方法检测相关基因表达;CCK8试验检测细胞增殖;划痕试验和Trans-well试验分别检测细胞迁移和侵袭。结果显示,过表达ALYREF后YAP的表达增加(P＜0.05),并且促进细胞的增殖、迁移和上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)(P＜0.05);靶向敲低YAP,细胞的增殖、迁移和EMT能力显著抑制(P＜0.05);过表达ALYREF且靶向敲除YAP与单独过表达ALYREF相比,YAP的表达显著降低(P＜0.05),且细胞的增殖、迁移和EMT能力同样得到抑制(P＜0.05);靶向敲低ALYREF,细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力显著抑制(P＜0.01)。综上所述,ALYREF通过上调YAP表达进而促进胃癌细胞的增殖和迁移。