张敏,梁斌,杨志明
氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein, ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)损伤有助于动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发展。但ox-LDL对HUVECs自噬的影响及机制尚不清楚。为探究其机制,采用体外培养HUVECs,建立ox-LDL损伤模型。透射电子显微镜观察HUVECs中自噬体的变化;Western印迹法检测p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR及Beclin1、LC3-II、P62的表达。结果显示,与对照组比较,透射电子显微镜下观察到ox-LDL组的自噬体明显增多。Western印迹结果显示,与对照组比较,ox-LDL组Beclin1(0.81±0.04 vs. 1.83±0.11,P<0.01)、LC3-II(0.80±0.06 vs. 1.61±0.06, P<0.01)和P62(0.65±0.10 vs. 1.64±0.17, P<0.01)表达显著增高。ox-LDL和BafilomycinA1共同干预组Beclin-1(3.15±0.15 vs. 3.17±0.13, P>0.05)、LC3-II(2.95±0.12 vs. 2.96±0.12, P >0.05)和P62(3.26±0.15 vs. 3.19±0.15, P>0.05)表达与BafilomycinA1组无显著差异,ox-LDL未使自噬起始增加,可能是降解受损导致自噬体的积累。与对照组比较,ox-LDL增加p-AMPK (0.47±0.03 vs. 0.96±0.03, P<0.01)表达,并降低p-mTOR(0.86±0.04 vs. 0.25±0.05, P<0.01)表达。单独阻断mTOR时, Beclin-1(0.81±0.05 vs. 2.19±0.17, P<0.01)、LC3-II(0.76±0.13 vs 2.00±0.05, P<0.01)和P62(0.74±0.12 vs. 1.94±0.11, P<0.01)表达显著增加。亮氨酸(Leucine)可增加p-mTOR(0.87±0.11 vs. 1.67±0.07, P<0.01)表达,并降低Beclin-1(0.81±0.05 vs. 0.37±0.03, P<0.01)、LC3-II(0.76±0.13 vs. 0.41±0.02, P<0.01)和P62(0.76±0.10 vs. 0.44±0.04, P<0.01)表达,但ox-LDL可使Leucine预处理后的p-mTOR(1.67±0.11 vs. 0.82±0.02, P<0.01)表达显著降低,并且Beclin-1(0.37±0.03 vs. 0.78±0.04, P<0.01)、LC3-II(0.41±0.02 vs. 0.78±0.02, P<0.01)和P62(0.44±0.04 vs. 0.74±0.04, P<0.01)表达显著增加。说明mTOR参与ox-LDL诱导的自噬。与ox-LDL组相比,ox-LDL和Si-AMPK共同处理组p-mTOR(0.25±0.05 vs. 0.46±0.03, P<0.01)表达增加以及Beclin-1(1.97±0.04 vs. 1.26±0.12, P<0.01)、LC3-II(1.42±0.10 vs. 0.95±0.05, P<0.01)和P62(1.58±0.09 vs. 0.98±0.11, P<0.01)表达降低。以上结果表明,ox-LDL通过AMPK/mTOR途径诱导HUVECs发生自噬,并且导致自噬体的积累。