中国生物化学与分子生物学报

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尹长城

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 1-12. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.01

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最近，冷冻电镜技术的突破引起结构生物学发生了革命。这一革命导致2017年诺贝尔化学奖授予对冷冻电镜技术发展做出开创性贡献的3位科学家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson。本文将综述冷冻电镜的发展历程，导致结构生物学革命的冷冻电镜关键技术，包括电镜、图像记录装置和图像处理算法方面的突破，以及中国科学家应用冷冻电镜取得的重要科学成就，涵盖基因表达/调控、蛋白质合成/降解、膜蛋白、免疫、病毒等相关蛋白复合体。最后，对冷冻电镜的未来发展方向进行展望。

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与诺贝尔化学奖得主Joachim Frank对话：跨学科研究促进医学发展的时代已经到来

程佳祎

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 13-17. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.02

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我们高兴地看到，科学前沿与工程学技巧的结合将加强人类生物学知识的创造和积累。2017年度诺贝尔化学奖授予了三位生物物理学家：Jacques Dubochet，Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他们的突破性贡献——发展冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）用于测定溶液中生物分子的高分辨率结构。这项技术使得人们能够领略蛋白质的结构，并有望最终揭开生命活动机制的奥秘。 ......

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镁螯合酶的结构与功能

刘子琦，汪佳

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 18-24. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.03

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镁螯合酶（magnesium chelatase）是叶绿素合成过程中的关键酶，催化原卟啉IX与Mg2+螯合形成镁原卟啉IX。镁螯合酶由催化亚基H与AAA+亚基I、D组成。通过这3种亚基的协调配合，在ATP驱动下实现Mg2+与原卟啉IX的螯合，推动叶绿素的合成。在这一过程中，基因组解偶联基因4（GUN4）蛋白对其发挥重要的正调控作用。自上世纪90年代以来，镁螯合酶独特的结构及其作用机制一直吸引着研究者们的兴趣。本文结合最新的研究进展，阐述镁螯合酶的结构、酶促反应动力学及其催化机制等。另外，对于GUN4蛋白对镁螯合酶的调控也进行了概述。

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大肠杆菌抗酸碱环境的分子机制

乔佳鑫, 范丽菲, 姚远

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 25-31. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.04

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细胞抗酸碱机制是一个重要的分子生物学问题，也是当前国际上非常活跃的研究前沿领域。大肠杆菌的抗酸系统中，与代谢相关的抗酸机制是利用氨基酸脱羧酶消耗氨基酸特定的氢离子，产生胺类和CO2，最终提高pH值。周质空间的抗酸机制，主要是依靠分子伴侣来保护周质空间中蛋白质。细菌二元调控系统可以感知极端pH环境等外界刺激，激活或抑制靶基因的表达，使细胞做出应答。非编码小RNA的抗酸途径则通过增加RpoS或者降低HNS的翻译来实现。关于大肠杆菌抗碱机制的研究甚少，至今只发现gadC、rpoS、nhaA和tnaA四个基因可能帮助大肠杆菌细胞耐受极碱环境。揭示大肠杆菌抗酸碱途径的生物学机制，对人肠道致病菌的治疗和预防都有着积极的作用，也能为生物医药的研究提供可靠的分子依据和新药开发的新靶点。

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抗增殖蛋白2：一种线粒体和细胞核之间的重要媒介

时颖,李铁松，李庆伟

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 32-37. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.05

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抗增殖蛋白2 (prohibitin2, PHB2)是抗增殖蛋白(prohibitin, PHB)家族中的重要成员，是主要定位于线粒体内膜的多功能蛋白质，对维持线粒体形态和功能的稳定具有重要作用，同时也是细胞内稳态和细胞分化的重要调节因子。随着对PHB2的深入研究，已发现PHB2是一种线粒体和细胞核之间重要的媒介。PHB2是细胞中必不可少的，它直接参与多种细胞进程并发挥重要作用，如调节转录因子的转录活性、调节细胞的分化与凋亡、维持线粒体形态和功能的稳定、调节姐妹染色单体的结合、神经细胞的修复和再生、轴突的发育形成和增强细胞氧化应激耐受性。近年来，PHB2在病理生理学中的作用及其在疾病治疗中的药靶地位受到高度重视。本文对PHB2研究的最新进展进行综述。

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去泛素化酶活性的调控

梁超超, 程梦华, 刘石娟

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 38-44. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.06

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泛素化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，在细胞生命活动的各个方面发挥作用。泛素化修饰是可逆的过程，去泛素化酶通过催化去除底物蛋白质上的泛素从而逆转该过程。去泛素化酶是一类数量众多的蛋白水解酶家族，近年来不断有新的去泛素化酶被发现和报道。鉴于其在细胞功能中的重要作用，去泛素化酶活性受到严格的调控。目前的研究表明，影响去泛素化酶活性的因素很多。本文主要从转录水平的调控、翻译后修饰、蛋白质定位和蛋白质相互作用等调控方式进行论述，以期为研究和利用去泛素化酶治疗疾病提供新思路。

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翻译后修饰对转录因子NF-E2相关因子2功能的调控

张艺瀚，衣雨娇，顾玉超

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 45-52. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.07

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抗氧化反应组件（AREs）普遍存在于编码抗氧化和/或解毒酶基因的启动子区域，为这些基因的转录启动所必需；而这些基因的表达对维持细胞内氧化还原稳态，抵抗活性氧类（ROS）引起的细胞损伤发挥重要作用。转录因子NFE2相关因子2(nuclear factor erythroid2 related factor 2, NRF2)作为抗氧化反应中的关键转录因子，可以与ARE结合，启动其下游靶基因，在氧化应激及亲电子剂应激中发挥重要的调控作用，广泛参与炎症、增殖、凋亡、细胞分化、组织再生和代谢等过程；因此，激活NRF2有望成为治疗肿瘤及其他与氧化、炎症相关疾病的新策略。蛋白质的翻译后修饰，对蛋白质空间构象、稳定性及其与其他蛋白质间相互作用具有重要作用。因此，探究NRF2的翻译后修饰如磷酸化、乙酰化和泛素化的修饰过程等，对深入了解NRF2的功能及调控机制至关重要，并与某些疾病的发生发展密切相关。本文对近年来翻译后修饰对NRF2的活性及功能的调控进行综述。

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4-苯基丁酸钠通过抑制内质网应激减轻皮层神经元氧糖剥夺/再灌注损伤

谭婷，王岩，涂柳，陈笛

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 53-60. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.08

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4-苯基丁酸钠（4-phenylbutyric acid，4-PBA）是协助内质网中蛋白质转录后修饰和折叠的分子伴侣，故可减轻非折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）及其介导的细胞凋亡。既往研究表明，4-PBA可以减轻脑组织的缺血性损伤，但采用原代皮层神经元构建氧糖剥夺/再灌注（oxygenglucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）损伤模型，来研究4-PBA对神经元损伤的保护作用及其机制尚未见报道。本文采用原代培养的皮层神经元OGD/R损伤模型，同时给予4-PBA处理，探讨4-PBA对OGD/R诱导的神经元内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的作用及其机制。分别采用MTT、LDH和Hoechst 33342染色法检测神经元存活率、细胞膜完整性和细胞凋亡情况。Western印迹检测ERS标志物葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein 78，GRP78)，以及肌醇必需酶1（inositolrequiring enzyme 1, IRE1）通路相关蛋白质的表达。Western印迹结果显示，在OGD/R后0～48 h，GRP78的表达较对照组明显升高。MTT、LDH漏出率和Hoechst 33342染色法检测显示，4-PBA显著改善OGD/R所导致的神经元存活率下降、LDH漏出率升高和细胞凋亡增加，且具有明显的剂量依赖性。通过Western印迹检测发现，4-PBA显著逆转OGD/R所致GRP78蛋白表达水平的上调。此外，对肌醇必需酶1通路相关蛋白质的检测显示，4-PBA下调氧糖剥夺/再灌注组神经元pIRE1和pJNK的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl2表达。上述研究结果表明，4-PBA在氧糖剥夺/再灌注情况下对神经元具有保护作用，该保护作用可能是通过抑制肌醇必需酶1信号通路介导的非折叠蛋白反应和内质网应激实现的。

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基于PCR的质粒快速定点诱变方法建立与评价

陈凡,傅一勤,林梅西,汪少芸

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 61-68. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.09

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基因突变对生命的进化具有重要意义，针对质粒的DNA定点诱变技术也是基因工程、蛋白质工程研究中的重要手段之一。为了提高质粒定点诱变的效率，本研究利用引物部分重叠的设计方案，使用Tm值相对固定的引物设计模式，将同一引物分为重叠区（Tm=50±2℃）和非重叠区（Tm=60±2℃），并在严格控制模板用量（2 pg/kb）的基础上，通过20个PCR循环对目标质粒进行定点诱变扩增，随后取0.5 μL产物直接用于转化。在FastPfu Fly酶系中，利用此法构建了6个含碱基替换、缺失和插入的质粒，均获得成功，突变效率可达96%以上，阳性克隆获得数达70个以上。此外，利用4种不同PCR酶系对该法的适用性进行了评价，结果表明突变效率均可达93%以上，阳性克隆获得数均在10个以上。通过适当增加PCR模板用量（10 pg/kb）并使用纯化后的PCR产物进行转化，该法可适用于转化效率大于106（cfu/μg）的任意感受态细胞，对应的突变效率可大于91%，阳性克隆获得数大于20。根据本法的作用原理，该方案适合质粒中10～20 bp（因重叠区GC含量及碱基序列的不同而改变）以内的任意碱基替换和插入，以及任意长度的DNA片段缺失。且具有通用性强、耗时少、诱变成功率高、成本低、对感受态及转化效率无特殊要求等优点，适合各实验室的日常研究使用。

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基于HT-SELEX筛选的节球藻毒素-R适配体的鉴定

欧阳生群，胡波，周蓉，李振钢，焦炳华，王梁华

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 69-76. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.10

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节球藻毒素-R（nodularin-R，NOD-R）是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而，现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性，亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术结合高通量测序（HT-SELEX），筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体。生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）技术对适配体的鉴定结果表明，适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高，达到了168 nM。而且，该适配体不与其他毒素结合，具有较高的特异性。以上结果表明，适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件。

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嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶生物学活性的分子特征分析

段晓雷,刘娜女,付怡欣, 闵迅, 奚绪光

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 77-88. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.11

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已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用，且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性；然而迄今为止，嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道。本文运用生物化学与生物物理学前沿技术，系统地研究了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶（Defe.Pif1）结合活性与解旋活性的分子特征。通过原核表达纯化系统，本研究获得纯度95%以上、无标签的Defe.Pif1蛋白。利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性，揭示出Defe.Pif1优先结合ssDNA与G4 DNA，并对含3′-尾链的部分双链底物有较强亲和力，其结合反应底物特异性为：ssDNA > G4 DNA > 3′-ssDNA-dsDNA≈Y-structure > Other substrates。通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性，明确其最适解旋温度为50℃，最佳反应溶液为10 mmol/L NaCl、3 mmol/L DTT、3 mmol/L MgCl2及1 mmol/L ATP；进一步的解旋动力学特征分析结果显示，Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物，其解旋5′-G4dsDNA底物时的解旋幅度超过90%，解旋速率也与其解旋5′-ss-dsDNA底物的速率相近，提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式。此外，本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性：与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同，Defe.Pif1解旋12ntbubble底物的速率与幅度均较高，暗示12ntbubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物。上述结果证明，Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4 DNA等活性特征；而且作为嗜热细菌的解旋酶，它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性。本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略，为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础。

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Tcf7l2基因表达上调可抑制高糖诱导的β细胞去分化

张玲敏, 郑晓雅,谢欣, 任伟, 刘婵

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 89-95. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.12

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胰岛β细胞去分化是β细胞功能衰竭的主要机制之一。转录因子7类似物2（transcription factor 7-like 2，Tcf7l2）表达水平与β细胞的功能密切相关。但是，转录因子Tcf7l2表达水平与高糖诱导的β细胞去分化的关系目前尚未见报道。本研究通过Tcf7l2 的 RNA 干扰和过表达慢病毒转染MIN6细胞，分别下调和上调Tcf7l2 的表达。研究分为空载体对照组与 Tcf7l2 干扰组和Tcf7l2过表达组。高糖（35 mmol/L）干预48 h，采用qRT-PCR 和 Western印迹检测祖细胞标志基因和β细胞标志基因的表达变化。结果显示,干扰慢病毒转染 MIN6 细胞 12 h，慢病毒感染效率达 95%以上，与对照组比较，Tcf7l2 mRNA 的干扰率约为 83%，蛋白质水平的干扰率约为 49%。过表达慢病毒转染 MIN6 细胞 12 h 时，慢病毒转染效率达 95%以上。与对照组比较，Tcf7l2 mRNA水平增加16倍，蛋白质水平增加4倍。高糖干预细胞48 h，Tcf7l2干扰组的祖细胞标志基因表达明显高于对照组，β细胞标志基因表达明显低于对照组（P<0.05）。相反，Tcf7l2过表达组的祖细胞标志基因表达明显低于对照组，β细胞标志基因表达明显高于对照组（P<0.05）。上述结果提示，Tcf7l2的表达水平与β细胞去分化密切相关；Tcf7l2表达下调可增加高糖诱导的β细胞去分化，而Tcf7l2过表达可减少高糖诱导的β细胞去分化。

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早老素通过下调CDK4使HEK293T细胞周期阻滞

宋浩昌, 余辉, 刘新光, 陈维春

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 96-102. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.13

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早老素（progerin）的累积导致儿童早老症（HutchinsonGilford progeria syndrome, HGPS）的发生，并与正常衰老相关。早老素能使细胞内稳态失衡但分子机制仍有待深入研究。本研究旨在探讨早老素导入人胚胎肾293T细胞（human embryo kidney 293T cell, HEK293T）后细胞增殖、周期变化的分子机制。形态学观察发现过表达早老素的HEK293T细胞密度下降，(57±2.47)%细胞核形态皱缩。细胞增殖和周期实验证明早老素使细胞增殖减慢，发生G1/S期阻滞，G1细胞从 (42.3±1.31)%升至(47.2±1.26)%，而S期细胞从 (43.1±1.36)%降至 (38.5±1.42)%。Western印迹结果显示早老素的高表达引起p21蛋白表达上调（103.2±1.49）%，CDK4下调（63±1.52）%，而p53、ATM、CyclinE1以及p16等蛋白质水平均不变；HEK293T细胞中早老素的过表达导致γH2AX水平下调（53±1.36）%，H2O2处理后变化趋势不变。我们的研究结果提示，早老素通过上调p21和下调CDK4使细胞发生周期阻滞，不能增加HEK293T细胞的损伤及衰老。

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FLT4 调控羊驼黑色素细胞中黑色素生成

丁增峰，崔玉琮，范瑞文，董常生,耿建军

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 103-109. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.14

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血管内皮素生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR-3/FLT4）与黑色素瘤细胞的生长有关，其可能对毛色及黑色素生成有一定的调控作用。为探讨FLT4基因对羊驼毛色及黑色素生成的影响，本文采用免疫组织化学、qRT-PCR、Western印迹对FLT4在不同毛色羊驼皮肤毛囊中的表达进行了研究。结果显示，FLT4在不同毛色毛囊中外根鞘及毛乳头阳性表达不同，且棕色皮肤比白色皮肤阳性信号强；FLT4 mRNA在棕色羊驼皮肤的表达量明显高于白色羊驼皮肤 (P<0.01)；FLT4蛋白在棕色皮肤中的表达量明显高于白色皮肤(P<0.01)；为进一步研究FLT4对黑色素生成的影响；通过对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中添加不同浓度的FLT4蛋白（0, 1, 10, 50, 100 ng/mL），与对照组相比，添加FLT4蛋白后酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白-1(TYRP1)、受体酪氨酸激酶 c-KIT、小眼畸形相关转录因子(MITF)的 mRNA和蛋白质表达明显增加， 10 ng/mL组表达量最高(P<0.01)；黑色素含量测定结果表明，不同浓度的FLT4蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素含量比对照组明显升高，添加FLT4蛋白10 ng/mL表达量最高(P<0.01)。由此可知，FLT4可以通过调节毛色相关基因的表达进而引起黑色素细胞中黑色素含量的变化。

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聚乙二醇沉淀剂有效分离尿外泌体

吕春燕，汪弋力，丁维俊

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 110-116. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2018.01.15

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尿外泌体是病毒大小的胞外囊泡，是非侵入性获得肾及泌尿生殖道细胞生理病理信息的重要靶标。聚乙二醇沉淀剂可经济高效地分离富集血清等外泌体，但未见用于尿外泌体富集的详细报道。本研究采用聚乙二醇沉淀剂分离鉴定尿外泌体，并对其RNA组分进行检测，以期建立一个经济、高效、简便的尿外泌体分离富集方法。采集10例健康志愿者晨尿20 mL，聚乙二醇沉淀剂分离尿外泌体。透射电镜观察到直径30～100 nm双层膜包绕的囊性小泡，中央有直径5～15 nm高电子密度区。Western印迹检测到外泌体标记蛋白CD63、CD9、TSG101、ADAM10和内标蛋白β-肌动蛋白的表达。纳米粒径仪测定粒子直径介于30～130 nm，并可见25.37 nm和95.07 nm二个粒子峰。qRT-PCR扩增得到β-肌动蛋白和RNU6 RNA产物带。上述结果表明，聚乙二醇沉淀剂可分离富集尿外泌体，该法简单、高效，不需要超速离心机等昂贵设备，且采用该法富集到的外泌体可用于后续蛋白质与核酸分析。该方法可望加速液体活检应用，尤其是肾及泌尿生殖道病变的无创检测。

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向本刊2017年度审稿专家致谢

中国生物化学与分子生物学报. 2018, 34(1): 117-118.

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