中国生物化学与分子生物学报

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郭存财, 刘炎, 黄耀伟

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 967-975. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.01

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猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)能引起猪腹泻等肠道疾病，属于α属冠状病毒，它的爆发给很多国家养猪业造成了严重的经济损失。2010年以来，PEDV感染在中国出现大规模爆发，一种突变型PEDV也于2013年在美国出现并迅速传播。 RNA病毒能够通过Toll样受体通路3（TLR3）和RIG-I样受体通路（RLR）诱导I型干扰素的产生。但以往的研究表明，PEDV感染能抑制I型干扰素的合成。近年来有关PEDV调节宿主天然免疫应答的研究取得了很大进展。PEDV主要通过编码作为干扰素拮抗剂的病毒蛋白以及隐藏病毒自身病原相关分子模式（PAMP）等两种方式逃逸宿主天然免疫应答。目前已报道，PEDV非结构蛋白1可通过降解CBP阻碍干扰素调节因子3(IRF-3)组装成增强子复合体；木瓜蛋白酶样蛋白酶可通过其去泛素化酶活性阻断天然免疫信号通路传递；3C样蛋白酶可通过剪切NEMO发挥干扰素拮抗剂活性；核衣壳蛋白通过结合TBK1抑制I型干扰素产生。PEDV也可通过合成加帽酶隐藏其病原相关分子dsRNA来避免激活天然免疫通路。PEDV抗病毒天然免疫机制阐明为研究PEDV感染免疫和致病机制提供了重要的理论依据，为研发抗PEDV新型疫苗和药物提供了基础。

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自噬与小胶质细胞相关神经炎症

刘雨晴, 陈丰嘉, 吴海歌

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 976-983. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.02

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小胶质细胞是中枢神经系统中重要的神经免疫细胞，当中枢神经系统受到刺激后，小胶质细胞通过炎症反应来应对这种刺激，这种炎症反应在神经性疾病中具有重要作用。研究发现，小胶质细胞自噬在炎症的发生与发展中也发挥了重要作用，它能直接或间接地影响炎症反应，同时自身也被其他信号调控。自噬过程有利有弊，适当的自噬过程能促进疾病的恢复，自噬紊乱则使病情恶化，所以明确自噬的调控机制对治疗和预防相关疾病具有重要意义。本文综述了近年来自噬在小胶质细胞相关炎症中研究进展，以及其可能的调控机制，以期为相关研究人员提供一定帮助。

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CDR1as与疾病的相关性

陈延慧, 郭建林, 徐存拴

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 984-989. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.03

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环状RNA（circular RNA, circRNA）是存在于真核细胞中的一种非线性RNA，具有稳定性、特异性以及进化保守性等特征，通过发挥microRNA的海绵作用，对其靶基因进行调控。与线性RNA相比，环状RNA自身的闭合环状结构使其更具优越性。小脑变性相关蛋白1反义转录物 (cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as)作为一种竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)间接调控miR-7靶标，通过多种途径影响多种疾病的发生和发展。本文就CDR1as的发现、来源及特征、功能以及与不同疾病的相关性作一概述。

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真核生物mRNA非翻译区结构特征与mRNA翻译

潘昱婷, 徐麒麟, 康波

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 990-993. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.04

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真核生物中蛋白质合成通常在翻译水平受到调控，而mRNA非翻译区与mRNA翻译之间关系密切。真核生物mRNA非翻译区长度、mRNA二级结构、GC含量、顺式作用元件与反式作用因子、mRNA帽端结构和多聚腺苷酸尾等结构对翻译具有重要的调控作用。本文就真核生物mRNA非翻译区结构特征对其翻译的影响做一综述。

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Hedgehog信号通路与动物骨骼肌发育调控

夏博, 葛静, 史新娥

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 998-1003. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.05

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Hedgehog信号通路在动物胚胎期及出生后骨骼肌的生长发育过程中发挥着重要作用。本文综述了Hedgehog信号通路对骨骼肌细胞增殖分化及肌纤维特性的调控作用及其在骨骼肌发育过程中与其它信号通路交互作用最新研究进展，为畜禽肉品质改良和肌肉相关疾病治疗提供理论基础。

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自噬在发育及干细胞中的作用

任立鹏,华进联,彭莎

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 998-1003. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.06

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自噬是亚细胞膜结构发生动态变化并经溶酶体介导的细胞内蛋白质和细胞器降解的过程。通过平衡细胞内的合成和分解代谢，自噬可以维持细胞内环境稳态。干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，对组织器官再生和维持组织稳态有重要作用。近年的研究表明，自噬在维持干细胞功能方面有非常重要的作用，本文综述了自噬的形成过程和分子机制及其在发育及干细胞中的作用。

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大肠杆菌YacG锌指结构的金属结合及功能特性

杨娟娟,章丽和,苏晓璐,卢彬彬,纪松军,黄招竹,王伍

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1004-1011. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.07

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YacG蛋白是一种能够抑制大肠杆菌促旋酶（E.coli gyrase）活性的内源性小分子蛋白质，仅由65 个氨基酸残基组成。核磁共振(NMR)研究发现，YacG结构中含有1个Cys-X2-Cys-X15-Cys-X3-Cys序列的锌指结构域，然而其作用并不清楚。本研究发现,在添加外源锌或者铁的M9基础培养基中，表达并纯化得到分别含有锌和铁的YacG蛋白，而在同时添加铁和L-半胱氨酸的M9基础培养基中可以纯化得到含有铁硫簇的蛋白质。这表明，YacG不仅是一个锌指蛋白，也是铁结合或铁硫簇结合蛋白。定点突变实验发现，YacG锌指结构中的4个半胱氨酸残基突变后，其结合的锌、铁、铁硫簇的含量都显著下降。这提示，锌结合、铁结合以及铁硫簇结合的位点均位于锌指结构域中的4个半胱氨酸残基。体内YacG过表达实验显示，用IPTG在大肠杆菌体内诱导表达野生型YacG蛋白会导致其生长明显受到抑制，而过表达突变体蛋白（YacG-C12/28S）对其生长的抑制作用将会减弱。体外实验进一步发现，锌结合、铁结合以及铁硫簇结合形式的YacG蛋白对E.coli gyrase促DNA螺旋活性的抑制作用没有明显差别，但是锌指结构突变体蛋白（YacG-C12/28S）对gyrase活性的抑制作用显著减弱。这说明，完整的锌指结构对YacG抑制gyrase活性的功能具有重要作用。此研究有可能为gyrase抑制剂类抗生素药物的研发提供有用的线索。

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MiR-1297下调PTEN的表达参与子宫内膜癌变

马雪莲,徐国营,史小雨,郭蕾,冯力民

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1012-1019.

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已有研究证明，抑癌子PTEN（phosphatase and tensin homolog）缺失或表达下调可引起子宫内膜癌变；在喉鳞状细胞癌中miR-1297可下调PTEN的表达。然而，miR-1297下调PTEN的机制，以及是否miR-1297靶向抑制PTEN参与子宫内膜癌变尚未见报道。本研究证明，miR-1297靶向抑制PTEN基因的表达参与子宫内膜癌变。收集临床病理检查确诊为子宫内膜腺癌的癌组织及癌旁组织18例。实时定量PCR（RT-qPCR）及Western印迹结果显示，与癌旁子宫内膜比较，子宫内膜癌组织miR-1297高表达，而PTEN则呈低表达或缺失。内膜癌和癌旁内膜组织中，miR-1297与PTEN表达水平的散点图分析揭示，miR-1297的表达水平与PTEN的表达水平呈明显的负相关（内膜癌：miR-1297与PTEN的相关系数r=-0.6928，P=0.0438；癌旁组织：相关系数r=-0.4085，P < 0.0001)。报告酶活性测定显示，与对照比较，pGL3-PTEN-3′-UTR-1/2/3加miR-1297模拟物共转染后，荧光素酶活性在转染的Ishikawa和ECC-1细胞中分别降低了约21%（P=0.0196）和17%（P=0.0306）；相反，转染miR-1297抑制物后，两种细胞的荧光素酶活性分别升高约59%（Ishikawa：P=0.0014）和50%（ECC-1： P=0.0025）。结果提示，miR-1297可通过特异识别PTEN mRNA的3′-UTR，抑制PTEN的表达。基因转染结合Western印迹结果证明，在原代子宫内膜细胞中，过表达miR-1297模拟物导致PTEN蛋白表达下调，而其下游底物分子——磷酸化的AKT（p-AKT）表达上调；而过表达miR-1297抑制物后，PTEN表达上调，p-AKT表达下调。Connexin V/PI双染结合流式分析证明，与对照细胞（3%细胞凋亡）比较，在子宫内膜癌细胞系Ishikawa中，敲减miR-1297表达后细胞调亡明显增加（至10%），这可能与抑制miR-1297后PTEN的表达上调有关。上述结果提示，miR-1297在子宫内膜癌高表达，而PTEN低表达。上述结果还提示，miR-1297作为一个促癌子可通过特异识别PTEN mRNA的3′-UTR，抑制PTEN的表达，促进AKT磷酸化/激活，从而促进内膜癌的发生，这可能是子宫内膜癌变的发生原因之一。

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启动子荧光素酶报告系统检测低浓度过氧化氢激活神经肽PACAP特异受体PAC1-R启动子的作用

崔跃,余榕捷,彭星荷,刘红玉,郑丽君

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1020-1026. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.09

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垂体腺苷酸环化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide，PACAP）特异受体PAC1-R (PACAP receptor 1)是神经系统疾病药物开发的重要靶点。为了研究其表达的生物学机制，本研究克隆了PAC1-R基因转录起始位点上游从-2 500到+26的2 526 bp启动子片段，构建PAC1-R启动子驱动的荧光素酶基因报告载体pGL3-PAC1-Rp，并确证PAC1-R启动子荧光素酶报告系统在小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中工作正常。运用此PAC1-R启动子荧光素酶报告系统，首次发现低浓度过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）有效激活PAC1-R启动子，此作用可被转录因子特化蛋白1（specificity protein 1，SP1）抑制剂光神霉素A（mithramycin A）所抑制，提示SP1参与介导H2O2对PAC1-R启动子的激活作用。生物信息学分析显示，PAC1-R启动子含有多个SP1结合位点。PAC1-R启动子的荧光素酶报告系统的构建为深入探索PAC1-R高表达的作用与机制奠定了基础，低浓度H2O2对PAC1-R启动子激活作用的发现有助于深入诠释低浓度活性氧的生理学作用。

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EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移

孙志亮,张胜超,李洪利,尹崇高

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1027-1032. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.10

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EBP50通过抑制LIMK/cofilin信号通路和PI3K/Akt/mTOR/MMP信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。然而，EBP50是否可以通过其他机制抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移尚未可知。本研究发现，EBP50能通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响乳腺癌细胞的侵袭和转移。Western印迹结果显示，EBP50在低转移细胞株MCF-7和正常乳腺细胞株MCF-10A中高表达，而在高转移细胞株MDA-MB-231低表达。采用RNAi技术将小RNA质粒瞬时转染乳腺癌细胞株MCF-7，同时将质粒pcDNA3.1-EBP50转入乳腺癌细胞株MDA-MB-231。Western印迹结果显示，SiEBP50/MCF-7细胞组的EBP50表达水平明显下调，MDA231/EBP50细胞组的EBP50表达水平明显上调。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示，用Wnt3a刺激后，SiEBP50/MCF-7细胞组体外迁移和侵袭能力明显增强，MDA231/EBP50细胞组体外迁移和侵袭能力明显减弱。Western印迹结果显示，与未用Wnt3a或同时用Wnt3a和抑制剂Dkk1刺激的相比，SiEBP50/MCF-7细胞组上皮-钙粘蛋白(E-cadherin)下调，波形蛋白 (vimentin)上调，细胞核中β-联蛋白（β-catenin）的表达水平升高，而MDA231/EBP50细胞组上皮-钙粘蛋白上调，波形蛋白下调，细胞核中β-联蛋白表达下降。上述结果表明，EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响β-联蛋白的转核，抑制EMT的发生，进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。

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Lpa-miR-nov-66拮抗IGF1促羊驼黑色素细胞黑色素生成及细胞迁移作用

姬凯元,胡帅鹏,刘学贤,刘彧,杨姗姗,张俊珍,范瑞文,董常生

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1033-1039. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.11

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胰岛素样生长因子1（IGF1）能够促进细胞迁移。我们最近的研究发现，一种新发现的miRNA（lpa-miR-nov-66）可通过靶向抑制可溶性腺苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）抑制黑色素细胞产生黑色素。然而，当二者联合作用于黑色素细胞时，究竟如何影响黑色素细胞的黑色素产生及细胞迁移尚未见报道。本研究证明，lpa-miR-nov-66可拮抗IGF1的促黑色素细胞的黑色素生成及促细胞迁移作用。ELISA法检测结果揭示，与单纯IGF1处理比较，过表达lpa-miR-nov-66或过表达lpa-miR-nov-66联合IGF1处理可明显降低IGF1诱导羊驼黑色素细胞的cAMP生成水平。实时定量PCR和Western印迹证明，与单纯IGF1处理比较，过表达lpa-miR-nov-66或联合处理可明显降低毛色生成相关基因——MITF、TYR、和TYRP1在黑色素细胞的表达。此外，细胞增殖和细胞划痕实验显示，与单纯IGF1处理比较，过表达lpa-miR-nov-66或联合处理可显著抑制黑色素细胞的迁移。上述结果表明，lpa-miR-nov-66可以减少cAMP产生，抑制IGF1的促黑色素细胞产生黑色素的作用，并抑制IGF1对黑色素细胞增殖和迁移的促进作用。

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辣椒ATP硫酸化酶基因（CaATPS1）的克隆与逆境表达

朱磊,杨路明,孙守如,李严曼

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1040-1047. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.12

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采用 RT-PCR和RACE方法，克隆了叶绿体ATP硫酸化酶基因的全长序列，命名为CaATPS1，GenBank 登录号为KX009745。该基因包含1个长为1 377 bp的完整开放阅读框，编码 458个氨基酸，预测分子量51.11 kD，等电点6.74。氨基酸同源性分析表明，该基因与 GenBank 中登录的茄科植物烟草、马铃薯及其它物种中的ATPS1氨基酸序列具有较高的同源性；进化树分析表明，辣椒CaATPS1与同为茄科属的烟草、马铃薯和胡麻属的芝麻处于同一进化分枝上，而与十字花科植物进化关系较远；荧光定量PCR分析显示，CaATPS1能被低温、干旱、高盐、机械损伤、过氧化氢、水杨酸、乙烯利以及DC3000侵染等各种胁迫和信号分子诱导。

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CBX4与HOXA5在慢性粒细胞白血病中的表达及相互作用研究

熊凯,薛丽香

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1048-1053. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.13

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Polycomb group complex（PcG）作为发挥转录抑制作用的重要表观遗传调控复合物，参与发育、衰老以及肿瘤发生等重要病生理过程。PcG成员众多，分为PRC1与PRC2两种复合物，各组分间功能既协同，又不失特性。PRC1中的CBX4独特的结构域使其功能尤为特殊。近年发现，作为一类造血干细胞恶性克隆性疾病，白血病中常伴有PcG基因的异常表达或者突变。本研究通过qPCR发现，在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）患者外周血白细胞中存在CBX4的表达明显下调，而PcG经典靶基因HOX家族中的HOXA5则表现为上调。给予伊马替尼（Imatinib）治疗后，二者均向相反方向恢复至正常人的表达水平，并且CBX4的表达水平与CML的经典分子标志物BCRABL1融合基因有较好的相关性。上述结果提示，CBX4可以作为CML潜在的预后标志物。为了进一步揭示CBX4与HOXA5是否存在相互作用关系，本文通过双荧光素酶实验证实，CBX4能通过HOXA5的启动子而负调控其表达。本研究发现，CBX4与HOXA5在CML中存在负相关的异常表达，且证明CBX4可作为HOXA5的负调控因子。

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Hr突变体转基因小鼠的构建和表型分析

朱奎成,徐存拴,章金涛

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1054-1059. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.14

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无毛基因（Hr）定位于8p12，在染色体上跨越14 kb，包含19个外显子。无毛基因的自发突变能引起人和动物毛发脱落及相关毛发疾病的产生。为深入研究Hr基因的功能，本文利用Gateway技术构建Hr表达载体，在该基因的3 427位引入点突变(G→A)，通过显微注射建立转基因小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠，确定首建鼠，通过与C57BL/6小鼠回交后互交数代建系。观察转基因小鼠毛发生长发育规律。结果表明，成功构建了pRP(Exp)-EF1A>mHairless mutant>IRES/EGFP真核表达载体，通过与野生型小鼠杂交获得阳性子代，进行同窝交配，第2代小鼠出生后14 d开始脱发，30 d左右脱落的毛发重新长出。取部分皮肤组织做石蜡切片，皮肤组织学观察发现，脱毛期无毛小鼠毛囊瓦解，真皮内形成大小不等的包囊，毛发重新生长时，真皮内见大量新生的毛囊。蛋白印迹实验表明，转基因小鼠脱发时HR蛋白表达量明显高于同龄阴性小鼠。本文成功建立稳定遗传的Hr突变的转基因小鼠品系，推测无毛基因突变引发转基因小鼠的脱发，为研究Hr基因的功能提供了良好的动物模型。

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单染色体靶向富集方法的建立

谢德健,张田甜,师明磊,张彦,沈文龙,叶丙雨,李平,何超,张香媛,赵志虎

中国生物化学与分子生物学报. 2016, 32(9): 1060-1066. https://doi.org/10.13865/j.cnki.cjbmb.2016.09.15

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靶向富集技术具有良好的均一性、特异性和灵敏性，只需较低的测序覆盖度即可满足后续的分析。该技术被广泛应用于特定位点重测序和染色体构象等研究。为了靶向富集测序文库中特定的染色体DNA片段，本研究以21号染色体为例，采用人胚肝二倍体细胞CCC-HEL-1建立了一种单染色体靶向富集方法。具体步骤如下：（1）首先将人正常核型二倍体细胞同步化到G2/M 期，制备染色体悬液；然后流式分选出21号单染色体。（2）采用多重退火环形扩增技术（MALBAC）对21号染色体DNA进行扩增；用扩增的DNA产物构建文库。（3）利用体外转录合成、生物素标记的RNA探针与文库进行液相杂交，捕获并验证捕获效率。荧光定量PCR检测结果证明，特定的21号染色体呈上百倍的富集，而靶标文库则富集了近60 倍。结果提示，特异单染色体靶向富集方法成功建立。该法不仅可实现任一单染色体的靶向富集，用于单条染色体功能组学研究，而且还可能用于查找特定疾病相关的染色体异常（如DNA突变、异位、重复及倒置等），具有一定的实用意义。

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