成簇规律间隔短回文序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得的一种适应性免疫防御机制，该结构与一些功能相关的蛋白质（CRISPRassociated, Cas）合称CRISPRCas系统。由于其致突变效率高、操作简单及成本较低的特点，近年来对CRISPR/Cas系统的研究获得越来越广泛的关注。该系统迅速在各领域中得到广泛应用，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。但是，该系统存在脱靶效应、测序数据分析等挑战。为此，许多研究者开发出各种软件解决以上问题。本文着重从生物信息学的角度出发，对CRISPR/Cas系统中sgRNA的设计软件、CRISPR全基因组筛选功能基因的测序数据分析软件以及CRISPR在生物信息学中的运用作一系统综述。
长链非编码RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）可以在多个阶段干扰基因表达和信号途径。在心血管系统，内皮表达的lncRNAs，如MALAT1和Tie1AS可以调节血管生长和功能。平滑肌细胞和内皮细胞中富含的迁移或分化相关的lncRNAs可调控平滑肌细胞收缩表型。在严重心肌梗塞和心衰时，一些lncRNAs表达水平发生调节，如Novlnc6和Nhrt。还有一些lncRNAs参与调节心肌细胞肥大、线粒体功能和心肌细胞凋亡。本文总结了lncRNA在心血管疾病中的研究进展，期待为更有效的治疗心血管疾病开发新的方向。
雌激素或类雌激素活性物质通过细胞核雌激素受体（nuclear estrogen receptor, nER）通路发挥相应的生理性作用。当这些配体被nER的配体结合域（ligand binding domain, LBD）识别后进入疏水性配体结合空腔内并引起受体构象发生改变，使得原先处于高度活动性的helix 12(H12)被固定从而进一步稳定空腔结构|同时nER也能通过招募一系列辅助调节因子及其他共调节蛋白质，最终调控基因转录。但是，由于不同的配体和受体结合形成的晶体结构并不完全相同，导致这些复合体具有不同的性质，从而影响基因的转录活性。本文综述了nER配体结合域及结合配体后形成的相应晶体结构与活性以及不同配体对受体结构和基因转录的影响。
黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）是一种胞质非受体酪氨酸激酶。FAK和肿瘤密切相关，在多种癌细胞中高表达，促进癌细胞的发生、生长、存活、增殖、粘附、转移和侵袭以及血管生成等过程。肿瘤微环境包括肿瘤细胞、周围血管、免疫细胞、纤维母细胞、内皮细胞、信号分子和细胞外基质，它对癌症的发展和恶化具有重要作用。肿瘤细胞可以通过分泌细胞外信号影响微环境，使其有利于肿瘤生存和发展|肿瘤微环境中的基质细胞能通过产生趋化因子、基质降解酶和生长因子促进肿瘤侵袭和转移。本文综述肿瘤微环境在癌症发生发展过程中的作用及FAK在肿瘤微环境中的调控作用，为肿瘤疾病的治疗提供新思路。
心磷脂（cardiolipin, CL）是线粒体内膜的特征性磷脂，参与线粒体嵴的形成。心磷脂在线粒体内的合成伴随着特殊的分子重构过程，从而使其自身的4条酰基链形成特定的组成，以发挥其特殊的生理功能。研究发现，心磷脂重构对维持线粒体的形态及功能至关重要，其重构异常是大多数心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）共有的病理现象，相应的分子机制研究得到了广泛关注。本文主要对心磷脂的理化特性及其生物合成途径，以及心磷脂重构在巴氏综合征（Barth syndrome, BTHS）、糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）以及心力衰竭（heart failure, HF）等心血管疾病的病理生理过程研究中的进展进行综述，以期为与心磷脂重构相关的心血管疾病的病理生理基础研究和药物干预的分子机制研究提供参考。
Lin28为一种保守的RNA结合蛋白质，在细胞代谢、细胞周期和多能性维持中具有重要调控作用。近年来，发现Lin28在哺乳动物原始生殖细胞形成和分化、精原干细胞的形成、自我更新和分化调控中具有不可替代的作用。本文对Lin28作用及其对哺乳动物干细胞和生殖细胞发育分化影响的研究进展作一简述。
重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI）是一种来源于荞麦Potato Ⅰ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明，rBTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质，但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明，rBTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性，进而影响线虫的寿命，且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术，分别对rBTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变，获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的rBTI突变体，分别命名为rBTI-R45A，rBTI-R45F，rBTI-W53R和rBTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示，野生型rBTI可以明显延长C.elegans的寿命，且在0～10 μmol/L 范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比，10 μmol/L 野生型rBTI延长寿命幅度可达到14.5%，但是突变体rBTI-R45A，rBTI-R45F和rBTIW53R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现，野生型rBTI 可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致，4种 rBTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中，rBTI可增强长寿因子DAF16的转录活性，进而延长虫体寿命，且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发rBTI的功能提供了实验支持和理论基础。
蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前，已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子，但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法，我们引入了DNA展示系统。在该系统中，生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白（内含子C端-外显子-生物素结合蛋白）形成DNA蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体（Flag-内含子N端）发生剪接反应的DNA蛋白质连接体，才能被加上旗帜标签（Flag），从而被抗旗帜标签抗体纯化柱（Anti Flag antibody M2 agarose）筛选富集。为了验证该系统的可行性，实验构建了2个基因，即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明，人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质，而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA，并且形成的DNA蛋白质连接体可以被筛选富集，最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后，为了检测系统的富集效率，制备了人为的基因“突变库”，即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合，经过2轮筛选后，阳性基因IRC可以被10倍富集，进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持，也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。
冠状病毒（Coronavirus, CoV）3C样蛋白酶（3CLpro）在冠状病毒复制过程中起重要作用，是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一，但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病性冠状病毒 ——中东呼吸综合征冠状病毒（MERSCoV）为研究对象，探讨人类冠状病毒感染与细胞自噬的关系。通过免疫荧光法检测发现，MERS 3CLpro引起细胞内eGFP-LC3B绿色荧光点状聚集，同时MERS 3CLpro诱导自噬标志蛋白微管相关蛋白1-轻链3基 (LC3-II)表达增多，表明MERS 3CLpro可激活细胞自噬。进一步研究发现，MERS 3CLpro诱导细胞自噬体形成而阻断或抑制自噬溶酶体形成，即MERS 3CLpro诱导不完全细胞自噬效应，而且MERS 3CLpro诱导细胞自噬具有时间依赖性且不依赖于其蛋白酶催化活性。此外发现SARSCoV和NL63CoV等其它人类冠状病毒3CLpro也具有诱导细胞自噬效应，表明3CLpro诱导细胞自噬可能是人类冠状病毒所具有的一种普遍生物学特性。本研究首次发现冠状病毒蛋白酶3CLpro能诱导宿主细胞自噬，是一种新型冠状病毒来源的宿主细胞自噬诱导蛋白，这一发现拓展了对人类冠状病毒蛋白酶功能的新认识，为研究冠状病毒与宿主抗病毒天然免疫以及以病毒蛋白酶为靶标的抗病毒药物研究提供了理论基础。
本文利用SpyTag/SpyCatcher特性构建了三臂星型结构的类弹性蛋白多肽(elastinlike polypeptides, ELPs)，考察其在不同溶剂，如分子拥挤试剂、osmolytes及深共熔溶剂(deep eutectic solvents，DESs)中的相变温度及行为，并与含有相同ELPs重复数的线性ELPs120作对比。结果表明：在不同浓度拥挤试剂PEG2000作用下，两种结构的ELPs相变温度均降低，当其各自浓度均为25 μmol/L时，三臂星型ELPs相变温度降低3℃～13℃，而ELPs120相变温度仅降低1.5℃～10.8℃。此外，在添加PEG2000后，三臂星型ELPs相变缓慢;在不同类型和浓度的osmolytes溶液中，25 μmol/L三臂星型ELPs相变温度明显要比线性ELPs高8℃左右;在DESs体系中，三臂星型ELPs有类似与水溶液中的相变行为，且其相变温度受到抑制，另外三臂星型ELPs和ELPs120在DESs/PBS体系中，与在(氯化胆碱+尿素)/PBS体系中的相变行为一致，其中当DESs体积含量为50%，ELPs120相变温度是最低的。由于ELPs在非单一缓冲液体系中的相变行为不同，这丰富了ELPs作为纯化标签的应用，且在非单一缓冲液体系中因降低了相变温度，节约了纯化融合蛋白的经济成本，同时也为研究ELPs拓扑结构与其相变行为之间的关系奠定理论基础。
血管紧张素1-7（angiotensin 1-7, Ang1-7）在神经系统中发挥重要作用。已有研究发现，Ang1-7在脑缺血动物模型中发挥保护作用，但至今未见有关Ang1-7对氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/ reoxygenation, OGD/R）损伤神经元的保护作用及其机制的研究报道。本研究以厌氧培养及不含葡萄糖的EBSS培养基培养、建立新生大白鼠原代培养的海马神经元OGD/R模型模拟脑缺血环境，实验分为3组：正常对照组、实验对照组和Ang1-7处理组。倒置显微镜观察神经元形态显示，Ang1-7处理组的神经元形态明显改善|CCK8试剂盒检测发现，Ang1-7处理组的细胞活性提高|流式细胞术研究发现，Ang1-7处理组的神经元凋亡和坏死率降低、神经元内Ca2+及NO水平降低|Western印迹结果发现，Ang1-7处理组Bax表达降低，Bcl-2表达增加。以上结果说明，Ang1-7可降低OGD/R神经元中NO和Ca2+水平，降低Bax蛋白、增加Bcl-2蛋白的表达，减少OGD/R神经元凋亡和坏死率，对OGD/R神经元发挥了保护作用。本研究为进一步在神经元水平上研究Ang-1-7的保护机制奠定基础，对中风等脑缺血疾病的防治具有重要意义。
高温热应激条件下，凋亡蛋白表达量升高，生殖细胞凋亡增加。凋亡蛋白酶活化因子1（apoptosis protease activating factor 1，Apaf-1）和凋亡蛋白酶活化起始者含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9,(cysteine aspartic acid specific protease 9, Caspase-9）是细胞凋亡内源途径中的重要调节蛋白，热应激条件下猪睾丸Apaf-1和Caspase9的表达未见报道。本研究发现，夏季畜舍高温使Apaf-1和Caspase-9表达量升高。qRT-PCR和Western印迹结果显示，与对照组（正常舍温20℃）相比，短时热应激组（40～42℃,1 h/d, 7 d）和长时热应激组（40～42℃,1 h/d, 42 d），Apaf-1和Caspase-9 mRNA和蛋白的相对表达量均显著升高。免疫组织化学研究发现，Apaf-1在猪睾丸组织中免疫反应阳性物定位于间质细胞、支持细胞和各个发育阶段生精细胞。热应激处理导致精母细胞和精子细胞Apaf-1表达量升高。在各实验猪睾丸组织中，Caspase-9定位于间质细胞、支持细胞和各个发育阶段生精细胞的胞质中。与对照组相比，热应激处理导致减数分裂以后的生精细胞和支持细胞Caspase-9表达量升高。上述结果表明，高温热应激促进Apaf-1和Caspase-9的表达，提示Apaf-1和Caspase-9表达的变化可能与猪舍高温导致的猪精液品质下降存在关联。
肌抑素是肌肉增生的负调控因子，为改良家畜产肉性状的重要候选基因。本研究设计了Cas9/sgRNA表达载体与供体DNA，通过电转染方法将其导入猪PK15细胞，经G418抗性筛选和荧光蛋白标记甄别，筛选到带阳性标记的细胞克隆。通过跨界PCR、长距离PCR、Western印迹、Southern印迹及PCR产物测序，证明了猪肌抑素的第3外显子序列特异性同源重组事件的发生。在猪肌抑素的第3外显子区域找到了1个有效的CRISPR/Cas9打靶位点，带阳性标记的细胞克隆经过多次筛选分离,获得了肌抑素单等位基因失活的稳定细胞系,为深入研究肌抑素的功能提供了重要的实验材料。
目前，PCR引物设计主要依赖于软件对引物熔点的模拟计算，而PCR退火条件的优化需进行不同条件下的扩增实验。为开发一种可高效、精确评价引物和确定退火条件的方法，本研究采用高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）测定技术直接分析短链DNA的熔点，用于引物优劣性的评价，并为退火条件的优化提供参考。本文用HRM法直接测定了非完全互补的双链DNA以及DNA发卡结构的熔点，结果显示：（1）与完全互补的双链DNA相比，较为稳定的单碱基错配A?G、G?G和T?G的熔点只降低2℃ ~ 3℃，部分双碱基错配的熔点只降低4℃ ~ 6℃，单碱基突出熔点只降低4℃~ 5℃。因此，如果采用的退火温度不当，部分错配的非目的模板可能会被扩增。（2）即使发卡结构的茎干区只有6 bp，当其环区碱基少于10 nt时，其熔点也可达到60℃以上。此外，环区的长度对发卡熔点也有较大影响。根据本研究结果发现，引物设计时应尽量避免模板引物结合区同其邻近的30 nt碱基有6 bp以上的互补部分。综上所述，本研究证明HRM熔点法是一种高效评价引物及确定退火温度的方法。
