中国生物化学与分子生物学报

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陈勇军刘智勇沈萍萍

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 685-691.

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过氧化物酶体增殖物激活受体γ （peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）是一种配体依赖性核转录因子，它具有调控细胞分化、脂肪代谢、糖代谢及炎症等多种生物学功能. 机体对PPARγ转录活性的调控方式是多种多样的，包括蛋白表达水平、配体以及转录辅助因子等不同层次上的调控. 近年来众多证据揭示，蛋白翻译后修饰（posttranslational modifications, PTMs）是机体调节PPARγ转录活性的另一重要方式. 目前,已报道的PPARγ翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、SUMO化和亚硝基化等，它们能够改变蛋白构象、调控蛋白相互作用、改变受体与配体间的亲和力，从而调控PPARγ下游基因的转录. 重要的是，PPARγ的翻译后修饰与一些疾病如糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤等密切相关. 本文将主要围绕PPARγ的各种翻译后修饰及其在疾病的发生、发展和治疗中的意义作一综述.

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肥胖诱发胰岛素抵抗的炎性机制

杨永青杨明庆

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 692-699.

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肥胖可诱发一系列慢性代谢性疾病，如2型糖尿病、血脂障碍、高血压和非酒精性脂肪肝等.这些疾病构成了当今世界人类健康的极大威胁.胰岛素抵抗是这些疾病的共有特征.胰岛素抵抗的发生与慢性低度系统炎性密切相关，涉及多条炎性信号通路的激活和胰岛素信号转导的缺陷.本文综述了肥胖、炎性与胰岛素抵抗之间的本质联系，以及肥胖诱发胰岛素抵抗的炎性机制，以期为肥胖相关疾病的防治提供重要参考.

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小分子RNA在植物叶发育中的调控作用

孙宇哲查玉龙翁晓燕朱睦元韩凝

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 700-705.

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叶发育是叶原基细胞有序的分裂、生长和分化的过程,受到植物激素和多个转录因子的严格调控.近年的研究表明,在叶片发育的过程中,小分子RNA是基因调控网络的重要组分.小分子RNA通过对其中一些转录因子的抑制作用,影响其表达水平和空间分布,维持叶的正常发育.本综述介绍了小分子RNA及其靶基因调控模块在叶片发生、叶片形状、叶子极性发育和叶子衰老等过程中的调控作用,并展望了未来研究中新方向.

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果蝇长时程记忆缺陷型突变体的鉴定

王世清孙侃帅祎春王连章钟毅

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 706-712.

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长时程记忆作为依赖蛋白合成的记忆组分，对于了解高等认知活动的分子机制有着重要意义.与此同时，细胞粘连分子作为影响突触可塑性的重要因子在学习与记忆研究领域也日益得到重视.为探索作用于长时程记忆的细胞粘连分子，利用P因子在果蝇基因组随机插入制造突变体，并通过大规模行为筛选得到了一个可能的长时程记忆突变体RUO. 测序结果表明，突变体RUO的P因子位于果蝇中selectin超家族对应的furrowed同源基因功能片段和未知功能的CG1806基因编码片段之间，且更靠近furrowed片段.RT-PCR结果和互补遗传学实验均表明,突变体RUO主要影响furrowed基因的表达.为了进一步确认furrowed基因与长时程记忆的相关性，引入已知的furrowed基因突变体fw1.结果表明，fw1同样具有长时程记忆缺陷，同时具备正常的学习能力.荧光共聚焦扫描成像显示，该基因特异性的表达在果蝇大脑两个对称的未知神经元中.此项工作不仅证明了furrowed基因在果蝇长时程记忆中的重要作用，而且在解剖学上揭示了果蝇神经系统中可能参与长时程记忆形成的新的神经元.

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大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶110位天冬酰胺突变后的结构与功能

童文华张文彬马金成王海洪

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 713-721.

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3-酮基脂酰ACP还原酶催化3-酮基脂酰ACP还原为3-羟基脂酰ACP，是细菌脂肪酸合成反应的关键酶之一.为了明确该酶中110位的保守天冬酰胺残基在酶催化活性和酶结构中的作用，本研究采用基因定点突变和蛋白质表达纯化技术，获得了大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶FabG的两个突变蛋白：FabG N110Q和FabG N110L.圆二色谱结果显示,天冬酰胺残基的突变改变了FabG的空间结构，使突变蛋白的α螺旋结构明显增加.以3-酮脂酰ACP为底物的酶活性测定表明,突变蛋白的酶活性均有下降，但残存的酶活性达到了FabG的75%以上.突变蛋白FabG N110Q和FabG N110L具有3-酮基脂酰ACP还原酶的活性，能在体外重建细菌脂肪酸合成反应.对fabG温度敏感突变株的遗传互补分析表明,FabG蛋白110位天冬酰胺突变为谷氨酰胺或亮氨酸后，在一定的条件下仍能互补大肠杆菌的生长.本研究结果提示，FabG 110位的天冬酰胺残基不是参与3-酮基脂酰ACP还原酶催化反应的必需氨基酸，它只是作为结构氨基酸，在维持FabG的空间结构的稳定性方面起作用.

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过表达TRAF2降解外源性绿色荧光蛋白

张波周芳亮卢芳国严杰王成周建林张健

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 722-727.

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TRAF2是机体免疫与炎症反应中具有重要作用的蛋白，有E3连接酶活性；GFP是一种受到激发光照射后可产生绿色荧光的蛋白，常用于蛋白质的细胞共定位研究，并显示与GFP融合表达靶蛋白在细胞中的位置．我们实验发现共转染表达质粒pCMV-myc-TRAF2与pEGFP-C3，可引起转染细胞绿色荧光减弱．Western印迹实验证明TRAF2可以降解GFP，并且这种降解是通过蛋白酶体途径进行的．为进一步确定这种降解的特异性，在HEK293细胞中共转pCMV-myc-TRAF2与pEGFP-C3-LNX后，发现随着TRAF2表达量增加，融合蛋白GFP-LNX减少；而共转质粒pCMV-myc-TRAF2与pCMV-myc-LNX后，未发现LNX蛋白表达减少，表明TRAF2对GFP的降解具有相对特异性．GFP是人类细胞中并不存在的蛋白，TRAF2能够将其降解可能意味着TRAF2参与了细胞抗病原体感染的过程．

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微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12通过干扰微管蛋白酪氨酸硝基化促进Hep-2细胞生长

李雅冬张劲松杨凯张福军陈睿洪苏玲

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 728-732.

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硝基化酪氨酸与酪氨酸在结构上相似，它在病理情况下会出现,并在细胞内与微管蛋白结合，从而阻碍微管的正常功能. 硝基化酪氨酸在肿瘤中的作用，目前研究甚少.本文利用头颈鳞癌Hep-2细胞株，研究微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12（tubulin tyrosine ligase like 12，TTLL12）和硝基化酪氨酸对头颈鳞癌Hep-2生长的影响，通过Western 印迹试验和MTT试验发现，随着硝基化酪氨酸的浓度升高，细胞内生成的硝基化酪氨酸微管蛋白含量也增高，同时细胞生长受抑制的程度显著增高; 对建立的TTLL12高表达细胞株加入硝基化酪氨酸培养，结果显示，TTLL12高表达细胞株内的硝基化酪氨酸微管蛋白含量明显低于对照组细胞；对照组细胞的生长明显受到抑制，而高表达细胞株的生长无明显改变，两者的细胞生长有显著性差异（P＜0.05）.本研究结果提示，TTLL12可通过阻碍硝基化酪氨酸与微管蛋白的结合，使头颈鳞癌Hep-2细胞逃避硝基化酪氨酸的打击. 对这一调控机制的进一步研究，必将有助于控制肿瘤细胞的生长,为治疗肿瘤寻找到新的治疗靶点.

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敲减Wingless / Wnt1基因表达对赤拟谷盗发育中的影响

彭亚男李承军李斌李卓玉

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 733-738.

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Wnt信号通路是进化中高度保守的一条信号转导途径，在调控动物的胚胎轴向正常发育、胚胎分化、决定细胞极性、维持成体动态平衡等方面发挥重要作用. 该信号通路的异常激活还与肿瘤的发生密切相关. 本实验将体外人工合成的Wingless(Wg)/Wnt1基因dsRNA显微注射入赤拟谷盗晚期幼虫体内，研究Wingless/Wnt1蛋白在赤拟谷盗发育过程中发挥的作用. 实验结果显示，注射 Wingless(wg)/Wnt1基因dsRNA后，赤拟谷盗发育形成的蛹，翅膀宽度减小，翅间距明显增大，且羽化过程也受到严重影响. 此外，qPCR结果表明，赤拟谷盗Wingless(Wg)/Wnt1基因被沉默后，Cadherin-like 和 Smoothened (Smo)基因的表达显著上调，Armadillo-2基因略上调. 这些结果揭示，Wnt-1 信号通路和赤拟谷盗翅膀发育以及成虫羽化过程密切相关. 蛹翅宽减小，翅间距增大，可能是由于调控细胞粘连及细胞形态的Cadherin-like 和Armadillo-2基因的上调所引起.更重要的是，Smo基因的上调，表明了Wnt信号通路和Hedgehog信号通路在赤拟谷盗发育过程中有交互作用.

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HMG盒转录因子1(HBP1)参与H2O2诱导的细胞衰老过程

姜彬张晓伟

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 739-744.

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为探讨HMG盒转录因子1 (HBP1)在过氧化氢（H2O2）诱导的细胞衰老中所起的作用，通过慢病毒感染得到稳定表达HBP1的MDA-MB-231细胞，以H2O2处理细胞．采用Western免疫印迹杂交试验和实时PCR检测HBP1、p16和细胞周期蛋白D1（cyclinD1）表达水平的变化．用荧光免疫试验检测H2O2对HBP1表达的影响，以及HBP1在H2O2的诱导下对于p16和细胞周期蛋白D1启动子的影响．用细胞增殖试验检测H2O2对于细胞增殖的影响．用基因敲减实验和衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测在H2O2诱导的细胞衰老中HBP1所起的作用．Western和免疫荧光实验结果显示,细胞经H2O2处理后，HBP1表达增高的同时促进了p16的表达，降低了细胞周期蛋白D1的表达．细胞增殖实验结果显示,H2O2显著抑制了细胞的增殖．基因敲减实验和SA-β-Gal染色实验说明,H2O2可诱导HBP1表达正常的MDA-MB-231细胞衰老，而HBP1的敲减则抑制了H2O2诱导的细胞衰老过程．本研究结果提示,在H2O2诱导的衰老中，HBP1的表达显著增加，并通过促进衰老相关基因p16的表达和抑制生长因子cyclinD1的表达来阻碍细胞增殖，促进细胞衰老．HBP1在H2O2诱导的细胞衰老过程中起着重要作用,H2O2诱导的细胞衰老必须在HBP1存在的情况下才能发生．

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C24(28)-甾醇还原酶参与粗糙脉孢菌极性生长及早期发育

赵会珍吴迪陈志玲

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 745-750.

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麦角甾醇是真菌细胞膜的主要固醇类物质，其生物合成是一个复杂的酶促反应过程, 其中C24(28)-甾醇还原酶是麦角甾醇合成途径中的关键酶，对C24(28)-甾醇还原酶功能的研究有助于阐明麦角甾醇对真菌极性生长的影响.本文对粗糙脉胞菌C24(28)-甾醇还原酶蛋白（Erg-2基因编码）序列的同源性分析表明，在子囊菌门的3个物种中，C24(28)-甾醇还原酶具有很高的保守性.根据同源重组基因敲除原理，通过电转化、分生孢子过膜以及PCR鉴定的方法获得了Erg-2基因缺失突变株（Erg-2KO），进一步利用斜面生长法并结合细胞壁染色进行突变株表型分析发现，与野生型相比，Erg-2KO(Ku70RIP背景)在生长初期菌丝生长缓慢，而后期与野生型无显著差异.这些结果表明，C24(28)-甾醇还原酶对N. crassa早期的生长和发育至关重要.

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大鼠2/3肝切除72 h后再生肝脏质膜比较蛋白质组学研究

冯灿李江林曹锐陈平

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 751-760.

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大鼠2/3肝切除模型为研究肝细胞增殖和生理性血管生成提供了一个很好的活体内模型.为了揭示肝再生过程中与肝细胞增殖终止相关及与血管生成启动相关的质膜蛋白质，本研究对大鼠肝2/3部分切除72 h后的肝脏质膜进行了研究：利用两步蔗糖密度梯度离心法对切除组和假手术组的肝脏质膜进行纯化；然后通过双向电泳和质谱技术对肝切除样品进行了比较分析并对几个关键蛋白程序性凋亡相关蛋白-6和丝蛋白-A进行了免疫印迹验证.相对于假手术对照组(Sham组)，21种蛋白质在切除后72 h的肝脏中上调，15种蛋白质下调.所鉴定的差异表达蛋白参与了血管生成、细胞分裂增殖和凋亡、细胞分化调控、肝脏组织重新构建、代谢及应急反应.本研究为肝脏再生及其血管生成的研究提供了理论依据.

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抗MRP3单链抗体-sTRAIL融合蛋白诱导U251多形性胶质母细胞瘤凋亡

倪长伟赵辰阳郎悦苏静乐媛吕翠婷王梁华尹剑

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 761-767.

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采用重组PCR技术获得抗多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3, MRP3)的单链抗体(scFv)与人源可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(soluble TNF-related apoptosis inducing ligand, sTRAIL)的融合蛋白质的基因编码序列, 利用原核表达载体pMAL-c2,构建含麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)标签肽的antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白, 经亲和层析柱纯化. 获得纯化的antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白，用MRP3阳性U251多形性胶质母细胞瘤做增殖抑制实验、细胞凋亡诱导实验，结果均显示具有明显的活性, 而MBP无明显作用. 上述结果表明，成功表达了antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白, 该融合蛋白具有诱导U251多形性胶质母细胞瘤细胞凋亡的活性, 为开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础.

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快速筛选高水平稳定表达成纤维细胞生长因子-21真核细胞新株方法的建立

张雅坤王文飞何昆叶贤龙刘淼韩苗苗刘铭瑶李德山

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 768-774.

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成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员,其研究已成为世界糖尿病研究的新热点，并有望成为治疗2型糖尿病的新型药物.然而，应用真核表达系统，更加快速、高效生产更接近天然状态的FGF-21蛋白并对其生物学功能进行的研究，至今尚未报道，因此建立高效稳定的FGF-21真核表达系统至关重要.本研究以FGF-21为目的基因，利用谷氨酰胺合成酶基因（GS）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）作为筛选标记，分别构建了单基因表达载体Pee124-FGF-21-Pee64-EGFP（Peedual）、Pee124-FGF-21-IRES-EGFP（PeeIRES）和双基因的真核表达载体Pee124-FGF-21-IRES-EGFP-Pee64-FGF-21(Peedual-IRES)，分别转染CHO-K1SV细胞后，通过GS加压和流式细胞术（在488 nm波长的激发光下能检测到EGFP绿色荧光）双筛选系统快速有效获得了稳定高效表达目的蛋白的细胞系.应用SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测细胞系目的蛋白的表达及差异，并通过HepG-2细胞糖吸收模型进行蛋白活性检测.研究结果表明：两个筛选系统结合使用，更好更快地筛选到了稳定转染并高效表达目的蛋白的细胞系，而且与单基因的载体相比，双基因载体Peedual-IRES在操作条件一致的情况下，目的蛋白表达量显著提高且均具有生物活性.本研究建立了省时、高效的真核表达平台，为FGF-21在真核水平上的高表达提供了一个新的方法.立了省时、高效的真核表达平台，为FGF-21在真核水平上的高表达提供了一个新的方法.

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检测miRNA活性的双荧光素酶单载体

毕延震郑新民邵长伟潘雯姜黎欧阳辉武乔宪凤刘西梅

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(8): 775-780.

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本研究报道了微小RNA靶分子鉴定及其活性分析的内参内置型双荧光素酶单载体与其应用.利用非连接酶依赖的基因克隆技术，借助一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法，将萤火虫荧光素酶基因(Firefly luc)融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因(Renilla luc)和氨苄青霉素抗性基因之间，构建为两种荧光素酶基因表达框并置的单载体报告系统，命名为pMiSensor. 在海肾荧光素酶基因的3′非翻译区引入多克隆位点Xba I和Apa I，便于克隆目的基因的3′UTR.海肾荧光素酶为报告基因，萤火虫荧光素酶为内参基因.多种哺乳动物细胞系的转染实验证实,pMiSensor可同时有效表达两种报告基因，其酶活显示出宽广的线性范围.通过构建pMiSensor-CCNE1报告载体，证明pMiSensor能够重现miR16对细胞周期蛋白CCNE1的调控作用.通过转染miR16抑制剂，证明pMiSensor-CCNE1可作为一种灵敏的生物感应器，探测细胞内微小RNA的活性变化.该双荧光素酶单载体具有重复性高、操作简便、定量准确的优点，适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认, 也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.

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