中国生物化学与分子生物学报

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王新禹, 黄懿, 李礼, 魏群

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 489-495.

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目前在哺乳动物中发现6个肿瘤坏死因子受体作用因子（TNF receptor associated factors，TRAFs）家族成员，它们主要参与TNF受体家族信号通路. 这些TRAF成员在C末端有螺旋卷曲结构和保守的TRAF结构域.TRAF3是TRAF家族中功能最为多样化的成员之一.1996年对TRAF3基因敲除小鼠进行研究发现,小鼠在出生早期死亡，这阻碍了TRAF3的生物学功能进一步研究，另一方面也证实了TRAF3在出生后发育以及维持正常的免疫系统功能方面有着重要生物学功能.10年后研究发现,TRAF3的缺失能够导致非经典NF-κB信号通路激活，这使得TRAF3在该信号通路中的功能得到了进一步的阐述.最近研究表明,TRAF3不仅能够负向调节NF-κB和MAPK信号通路，还能够正向调节Ⅰ型干扰素的产生.通过研究还发现,TRAF3可能存在着负向调节钙调蛋白磷酸酶活性的新功能.因此,研究TRAF3在免疫信号通路中的作用以及与之相关的病毒疾病具有重要的意义.

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APOBEC3G与Vif在HIV-1感染中的作用

马寅佳, 杨怡姝, 曾毅

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 496-500.

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载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样（apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide-like，APOBEC）蛋白是一组胞嘧啶脱氨基酶，具有天然的抗病毒活性，对多种病毒具有抑制作用，特别是逆转录病毒. APOBEC3蛋白能够抑制人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的感染，其中APOBEC3G和APOBEC3F的作用最强. APOBEC3G能够通过胞嘧啶脱氨基作用和非胞嘧啶脱氨基作用抑制病毒感染. HIV-1病毒感染因子(Vif) 蛋白主要经泛素-蛋白酶体途径介导APOBEC3G降解，从而拮抗其抗病毒作用. APOBEC3G和Vif之间相互作用的研究对于寻求新的抗HIV治疗靶点具有重要意义.

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植物对低温的光合响应

陶宏征赵昶灵李唯奇

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 501-509.

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低温是影响植物生长和发育的主要环境因子之一.低温下，植物的许多生理生化过程受到影响，而其中光合作用是对低温最敏感的过程.光合作用是地球上最重要的生理生化过程，所以研究光合作用在低温下的响应机制具有重要意义.本文系统地总结了当前国内外最新研究进展，综述了低温下植物的光合响应，主要内容包括影响低温下光合响应的因素、低温下光合响应的关键问题——能量平衡的调节，以及植物的低温光合响应信号通路，并展望了低温光合响应研究的新方向.

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siRNA与固有免疫

周文涛, 郭军

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 509-513.

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转染小干扰RNA片段（small interfering RNA, siRNA）被广泛用于沉默基因表达.外源性核酸短链的进入能激活Toll样受体，触发免疫应答，促进机体炎症因子的表达与释放. siRNA还能活化双链RNA依赖性蛋白激酶（dsRNA-dependent protein kinase,PKR）等胞内模式识别受体，通过免疫反应引起机体功能障碍.siRNA的免疫效应与其核苷酸链的长短、碱基序列、核糖结构等密切相关，相应的化学修饰能阻断其激活模式识别受体，抑制固有免疫应答.本文综述了近年来siRNA对固有免疫应答的分子机制，为改善基因沉默效应和拓展该技术的临床应用提供有益帮助.

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蛋白质O-GlcNAc修饰的检测技术

丛琦, 顾玉超, 于文功

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 514-521.

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O-连接的N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰是位于细胞浆和细胞核蛋白质的丝氨酸或苏氨酸上的一种翻译后修饰，在高等真核生物细胞中广泛存在.越来越多的研究表明,O-GlcNAc修饰在代谢调控、压力应激、细胞周期、凋亡、糖尿病、心血管疾病和癌症等多种生理和病理过程中发挥重要作用，因此, O-GlcNAc修饰已受到众多生命科学领域研究人员的关注.然而,由于O-GlcNAc修饰与传统的N聚糖和O聚糖修饰有所不同，常规糖基化修饰的检测方法并不适用于O-GlcNAc.本文对O-GlcNAc修饰的检测及其修饰位点的确定方法进行了综述，并分析了各种方法的优缺点.

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POMP与SuFu相互作用调控Hedgehog信号通路的活性

黄璇, 李勇, 汪玲芳, 邵佳, 罗时文

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 522-530.

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Hedgehog信号通路在胚胎发育、组织再生中发挥重要的作用，且与癌症发生发展密切相关. 其胞内调控组分Suppressor of Fused（SuFu）蛋白通过结合转录因子Gli(s)，负调控该信号通路，但其作用的分子机制仍不甚清楚. 在本项研究中，以人SuFu作为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术成功地筛选到1个新的相互作用因子—蛋白酶体成熟蛋白（POMP）. 通过免疫共沉淀、体外GST pull-down和免疫细胞化学实验验证其相互作用. 为了探究POMP与SuFu的相互作用对Hedgehog信号通路的影响，构建了POMP的过表达质粒和干扰质粒（miR-RNAi）以及转录因子Gli活性检测系统，即荧光素酶报告基因法，结果显示，过表达SuFu蛋白时POMP正调控Hedgehog信号通路，而下调POMP的表达则抑制Gli的活性. 该研究结果揭示了POMP新的生物学功能，为阐明Hedgehog信号通路的具体分子机制提供了新的线索.

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日本七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白Lj-RGD1抑制血小板聚集及抗血管新生功能

王继红, 于凤, 韩晓曦, 吕莉, 刘欣, 李庆伟

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 531-537.

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Lj-RGD1来源于日本七鳃鳗口腔腺,富含半胱氨酸并具有RGD(Arg-Gly-Asp)模体.为了验证Lj-RGD1是否具有抑制血小板聚集、抗血管新生等去整合素样典型功能，本文对七鳃鳗Lj-RGD1进行了克隆表达及活性测定.提取七鳃鳗口腔腺中总RNA进行RT-PCR扩增，获得Lj-RGD1的420 bp cDNA.对其进行克隆、表达及组氨酸亲和层析纯化后，获得分子量为169 kD的可溶性蛋白rLj-RGD1.活性测定结果显示，rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制ADP诱导的兔血小板聚集，IC50为123 μmol/L；血管新生抑制实验结果表明，rLj-RGD1能够诱导ECV304细胞凋亡，抑制ECV304细胞增殖和管状物形成，并呈剂量依赖性方式抑制鸡胚胎绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）血管新生.由此可见，Lj-RGD1具有去整合素样生物活性，在血栓或血管异常新生类疾病治疗中具有应用前景.

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色氨酸残基在碳-碳水解酶催化中的关键作用

杨秀清, 沈翀, 高冲

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 538-545.

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碳-碳水解酶（C-C水解酶）作为α/β水解酶超家族中的一员，负责催化环裂产物C-C键的断裂，该反应是细菌降解芳香族化合物途径中的关键步骤. 为了解水解酶的催化特性，本文对该酶部分氨基酸进行了定点突变，并对突变体的动力学参数，化学修饰剂对突变体活性的影响以及突变体的二级结构进行了测定.各突变体的动力学参数特征为：突变体S110A，H265A和D237A的催化效率为野生型的1/104~1/103；突变体W85A和W219A催化效率分别为野生型的5/18和1/3，而同为色氨酸的突变体，W266A的催化效率只有野生型的1/104. 化学修饰剂对突变体S110A，H265A，D237A和W266A的酶活性几乎没有影响；而对突变体W85A和W219A却有较大的影响，修饰后，其相对活性仅为对照的10%~30%. 突变体的圆二色谱（CD谱）分析表明,与野生型相比，突变体的二级结构没有发生改变. 证明了Ser110，Asp237，His265是2-羟基-6-氧-6-苯基己-2,4-二烯酸水解酶（HOPDA hydrolase, HOPDA水解酶）催化反应所必需的氨基酸，并提出了Trp266在催化反应中也同样起到了非常关键的作用.

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超表达Cdc20基因不影响牛卵母细胞第一极体排出

杨文琳, 安鹏, 李伟, 赵贵民, 史芸安, 雷安民

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 546-554.

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CDC20（cell division cycle 20）是后期促进复合物 (anaphase-promoting complex，APC)的共激活剂之一，也是纺锤体组装检查点 (spindle assembly checkpoint，SAC)的靶点，在细胞周期调控中扮演重要角色. 为探讨Cdc20在第一极体排出(first polar body extrusion, PBE I)中的作用，Cdc20基因被成功克隆并构建了真核表达载体pCdc20-Venus，随后用T7 Mmessage Mmachine Kit (Ambion)以线性化pCdc20-Venus为模板体外转录（in vitro transcription）获得带帽的Cdc20- Venus mRNA，将Ccdc20-Venus mRNA 显微注射到体外培养的牛卵母细胞胞质中进行超量表达. 结果表明,真核表达载体pCdc20-Venus转染HeLa细胞后能够正常表达，绿色荧光在细胞核周围呈弥散状分布；将Cdc20-Venus mRNA 注射到牛卵母细胞胞质后，胞质内有绿色荧光出现. Cdc20-Venus mRNA 注射组卵母细胞的PBE I率(48.9%)与Venus mRNA注射组卵母细胞的PBE I率(50.9%)和未注射组卵母细胞的PBE I率相比均没有显著差异（P＞0.05）. 通过Cdc20在牛卵母细胞内的超量表达，结果显示,超量表达Cdc20基因对牛卵母细胞PBE I没有显著影响（P＞0.05）.

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SAHA抑制间充质干细胞C3H10T1/2的增殖与成脂分化

王奎栋, 李智耀, 吴伟, 龚雨琴, 季煜华

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 555-560.

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本文研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）对间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) C3H10T1/2增殖和成脂分化的影响及其可能的作用机制.用Western印迹验证SAHA对细胞内蛋白乙酰化的影响；用MTT和流式细胞术检测细胞活性和细胞周期；利用油红O染色检测细胞成脂分化，实时定量PCR检测PPARγ2和成脂分化标志物Fabp4、perilipin以及adipoq mRNA的转录.Western印迹结果显示,SAHA可促进细胞内蛋白的乙酰化.MTT和流式细胞术结果显示,SAHA对C3H10T1/2细胞活性的抑制呈浓度依赖性，随着SAHA浓度增加，细胞形态趋向于展平，并将细胞周期抑制在G0/G1期；SAHA可呈浓度依赖性抑制C3H10T1/2 细胞的成脂分化作用.同时实时定量PCR结果显示,SAHA抑制成脂关键转录因子PPARγ2，脂肪因子Fabp4、perilipin和adipoq mRNA的转录.综上所述，SAHA可影响间充质干细胞C3H10T1/2细胞形态，并呈剂量依赖性地抑制其增殖和成脂分化.

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低功率2 450 MHz射频磁场对神经元延迟整流钾通道的抑制作用

郑羽, 张洋, 张子钊, 王金海, 李刚, 程立君

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 561-566.

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由于电子设备的广泛使用，人类已经越来越多地暴露在射频磁场的辐射下，但射频磁场的辐射效应却一直不明确．采用全细胞膜片钳技术，记录2 450 MHz射频磁场辐射对小鼠脑皮层神经元延迟整流钾电流IK的影响．利用Ansoft HFSS软件对6 dB全向天线建模仿真，验证距天线2~3 cm处磁场分布均匀，使用Agilent E5070B网络分析仪经该天线发射出2 450 MHz输出功率为39.81 mW电磁场，对细胞进行刺激．实验发现，2 450 MHz低功率射频磁场暴露5、10和15 min对IK均有明显的抑制作用；显著影响IK激活特性，对照组与磁场暴露组半数激活电压分别为（－1.13±2.32）mV和（19.52±1.03）mV(n=10, P <0.05)；斜率因子分别为（23.21±3.29）mV和（13.95±1.27）mV(n=10, P <0.05)．结果表明，低功率射频磁场通过减小延迟整流钾通道电流，影响神经元的生理功能，为进一步研究电磁辐射所引发的生物学效应提供了一种新的方法．

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激光显微切割分选少量胃癌细胞中PSCA基因的SNP分析

杨祎, 郭妍, 赵小东, 刘炳亚, 邵志峰

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 567-573.

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随着基因组关联分析方法的应用，越来越多与胃癌相关的易感基因被发现．易感基因的多态性检测已逐步进入胃癌临床诊断和研究．然而，利用少量胃粘膜细胞开展单核苷酸多态性（SNP）分析对胃癌进行早期诊断常遇下述困难，一是少量胃癌细胞混杂在多种细胞中，异常信号常易被淹没，二是细胞量极少，因此获得的基因组DNA量微，进行多位点或全基因组分析存在困难. 本文利用激光显微切割技术分选少量胃癌细胞，结合全基因组放大技术，进行胃癌相关的前列腺干细胞抗原基因(PSCA)的SNP分析．通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和克隆测序方法分析，在分选的胃癌细胞中检测到PSCA的rs2976392位点胃癌相关的“A”等位与rs2294008位点胃癌相关的“T”等位．研究结果表明，所采用的全基因组放大方法保真性高，经过分选的胃癌细胞中SNP位点的检测灵敏度和可靠性大为提高．所建立的少量细胞基因多位点检测方法将同样应用于其它肿瘤和组织的少量细胞研究中，全基因组放大产物也可进行高通量的基因芯片和第二代测序研究．

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绵羊类胚胎干细胞长期培养中增殖、凋亡、多能性相关基因的表达动力学

周川, 赵云程, 林嘉鹏, 汪立芹, 张秀华, 金贤华, 黄俊成

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 574-579.

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已报道的家畜类胚胎干细胞(embryonic stem-like cell, ESC-like)均无法实现长期培养，这制约了家畜ESC的研究．通过检测本实验室建系的绵羊类胚胎干细胞oESC-like，探究导致oESC-like无法持续培养的原因，为以后的研究打下基础. 实验观察了oESC-like形态变化，检测了AKP的表达，使用免疫荧光技术检测了PCNA、Bcl-2、Bax、Sox-2、Oct-4蛋白的表达，并用软件Image-Pro Plus 60计算蛋白表达水平．结果显示，oESC-like在长期培养过程中其形态具备ESC的典型形态特征；AKP持续表达；Sox-2和Oct-4的表达有不同程度的提高，增殖能力无明显变化；Bax表达水平逐代提高，Bcl-2的表达水平在5、10代显著高于Bax的表达水平可抑制Bax的活化，而从15代开始Bcl-2表达水平下降，低于Bax的表达水平，不能有效地抑制Bax的活化；Bcl-2/Bax表达水平的比值逐代下降，说明oESC-like在长期培养过程中逐渐走向凋亡.为解决绵羊类胚胎干细胞能够体外长期培养的科学问题，针对本实验室已有研究成果和存在的问题，进行逆向思维找出突破口，为遗传育种、基因工程、医疗等方面在实践上提供理论基础.

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绵羊基因组MHC ClassⅢ区段部分基因的分离与鉴定

杨小亮, 高剑峰, 白大章, 邱巍, 董慧琴, 李大全, 陈芳, 马润林, Hugh T Blair

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(6): 580-586.

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绵羊基因组MHC段分为ClassⅠ、Class Ⅲ和ClassⅡ（含Ⅱa和Ⅱb两个亚区）3个区段，与另外2个区段相比，Class Ⅲ区的基因信息远少于ClassⅠ和ClassⅡ区.为丰富绵羊基因组 MHC Class Ⅲ 区段基因信息. 本研究用位于中国美利奴羊基因组BAC文库中 MHC ClassⅢ 区段4个BAC克隆的酶切片段制备32P 标记探针，继而采用噬菌斑原位杂交筛选法筛选中国美利奴羊混合组织cDNA 文库，并对分离到的cDNA 阳性克隆进行全序列测定及生物信息学分析.本实验共筛选出 31 个 cDNA 阳性克隆，对其序列进行了测定及分析，确定了序列在ClassⅢ 区段上的位置，并通过在NCBI中的同源检索对其功能做了初步鉴定.由实验可知，利用BAC 文库与 cDNA 文库杂交筛选法对较大区段基因的筛选和分离是有效的.同时，对分离到的表达序列结合生物信息学进行分析，这将有助于对该序列功能的深入研究.

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