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• 2012年, 28卷, 第5期
  刊出日期：2012-05-23

    

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  综述
  研究论文
  技术与方法
  
  

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综述
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  siRNA与miRNA在生物基因调控中的沉默机制比较

  张超, 庞全海

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 393-398.

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  siRNA和miRNA的沉默机制是生物基因调控的重要手段之一. 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）是RNA干扰的引发物，激发与之互补的目标mRNA沉默. 非编码RNA中的微小RNA（microRNA，miRNA），能够识别特定的目标mRNA，通过与mRNAs的3′ 非翻译区结合，影响该目标蛋白的翻译水平. siRNA和miRNA的基因调控机制对生物学研究及疾病的病因和治疗等有直接影响. 本文主要对siRNAs和miRNAs的生物起源及沉默机制进行比较性论述：提出Dicers酶蛋白、Ago蛋白以及20 nt~25 nt的双链RNAs的 3类大分子是RNA沉默的特征结构，并进行了说明性论述|总结性叙述了siRNA和miRNA的2类小分子经典沉默机制，并提出其异同点. 最后，本文根据近期研究进展，对siRNA和miRNA的生物起源及沉默机制提出了新的疑问.
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  HIV-1 Tat蛋白与艾滋病脑病

  周勤华, 姚鑫, 惠斌

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 399-404.

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  Tat 蛋白是HIV-1 编码的反式转录激活因子，其主要功能是反式激活HIV-1病毒基因组转录的起始和延伸，启动病毒复制.近年来研究发现，Tat 蛋白在HIV-1感染所引起的严重中枢神经系统（CNS）并发症——艾滋病脑病中起重要作用，是艾滋病脑病发生与发展的重要致病因子.本文就HIV-1 Tat蛋白在艾滋病脑病中的研究进展作一综述.
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  死亡相关蛋白激酶（DAPK）是负调控还是正调控自噬?

  文敏, 张海涛

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 405-411.

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  自噬(autophagy)是1个严谨调控的代谢途径. 哺乳动物细胞通过自噬能够降解和循环利用大分子和某些细胞器.自噬作为一种适应的机制，保护有机体对抗各种病理病变，包括感染、癌症、退行性病变、衰老和心脏疾病等.在移除蛋白聚集体、以及受损或过剩细胞器时，自噬发挥着很关键的作用，从而能够维持细胞能量平衡并适应环境压力.当自噬不足或过剩时，自噬也可作为一种促死亡的机制.在不同的情况下,自噬活化的程度通过自噬信号通路网络而精确地调节.死亡相关蛋白激酶(DAPK)是1个刺激调节蛋白激酶，它由几个功能结构域组成.这些结构域能让它参与广泛的信号通路中，包括凋亡、自噬和膜泡.DAPK在调节自噬中发挥着关键的作用.本文综述了在不同的情况下DAPK负调控或是正调控自噬的路径.
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  细菌核糖体的拯救机制

  谢兆辉

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 412-418.

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  蛋白质翻译过程中，很多因素可能导致核糖体在mRNA上熄火，这对细胞的危害很大，因为这不仅占用了核糖体、氨基酸和tRNA，而且还可能产生有害的蛋白质.细菌进化出了多种核糖体拯救机制，释放熄火的核糖体，清除异常的mRNA，以规避毒害，如：① tmRNA·SmpB介导的拯救机制，又称为反式翻译介导的拯救机制|② ArfA(YhdL)介导的拯救机制|③ YaeJ(ArfB)介导的拯救机制.这些机制对于细菌的生理和繁殖都非常重要，但却在真核生物进化过程中消失了，使这些机制有可能成为抗菌药物靶点.本文主要就细菌核糖体的拯救机制做一概述，并对这些机制的应用前景进行了展望.
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  自噬 -- 凋亡之后的新理念

  丁渭, 张玉林, 陈德喜

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 419-423.

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  自噬(autophagy)是细胞重复利用胞质和处置多余或有缺陷细胞器的过程.自噬相关蛋白的发现使得这一领域成为研究的焦点.酵母中自噬基因及其它有机体同源基因的发现揭示了真核生物自噬机制的保守性，这也使得在不同模型系统中利用分子遗传学和生物学技术研究自噬过程成为可能.但是,自噬在疾病过程中究竟起到促进作用还是保护作用目前还不清楚.这里我们就自噬在健康与疾病中所起作用的最新研究进展做一综述.
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  淋巴道转移相关标志物与癌

  刘淑清, 宗军卫, 郭春梅, 孙明忠

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 424-432.

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  肿瘤早期的淋巴道转移是恶性肿瘤患者高死亡率的主要原因，其机制复杂，一直是肿瘤研究的难点. 肿瘤淋巴道转移特异性蛋白标记物的发现有助于揭示恶性肿瘤早期发病机制、早期临床诊断和治疗. 本文综述了近年来肝癌、胃癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和前列腺癌淋巴道转移研究所取得的蛋白质组学成果，并对发现的与以上几种肿瘤淋巴道转移相关的蛋白标记物及其在肿瘤的发生、浸润、转移及病人预后中作用及机制进行了探讨.
研究论文
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  鼠疫耶尔森菌毒力蛋白YopE新功能的初步研究

  李典镕, 杨慧盈, 柯岳华, 唐留军, 詹轶群, 葛志强, 于淼

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 433-441.

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  鼠疫耶尔森菌外部蛋白E（YopE）是鼠疫耶尔森菌的6种分泌蛋白之一，主要通过其144位的”精氨酸手指”结构与细胞膜耦联蛋白RhoGTP酶相互作用发挥功能.本文构建YopE及其144位突变体YopE(R144A)的可诱导表达系统，并优化了诱导条件. 用该系统结合流式细胞技术检测YopE和YopE(R144A)对细胞凋亡、细胞周期和细胞活性氧(ROS)水平的影响.结果显示：YopE(R144A)促进HeLa细胞凋亡|使G0/G1期细胞比例上升,G2/M期细胞比例下降;随着YopE(R144A)表达量增加，p21蛋白的表达量也增加| YopE(R144A)也能抑制细胞ROS的产生.研究结果提示,YopE在细胞内可能存在新的致病靶点.
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  胆固醇致人血管内皮细胞DNA损伤

  汪慧星, 杨一峻, 钱民章

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 442-448.

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  本文研究胆固醇是否通过氧化应激机制损伤人内皮细胞DNA.实验用125 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L胆固醇作用于人内皮细胞12 h,用免疫荧光法观察到不同浓度的胆固醇均可诱导细胞内γH2AX形成焦点,随着胆固醇浓度的增加,γH2AX焦点的荧光强度也逐渐增强.利用Western印迹及流式细胞术检测到细胞内γH2AX的量和ROS水平也随胆固醇浓度增大而增加.彗星电泳实验检测到细胞内拖尾DNA量随胆固醇浓度逐渐增加,DNA损伤加重.用抗氧化剂10 mmol/L N乙酰半胱氨酸(NAC)预作用细胞1 h后,再用50 mg/L胆固醇作用细胞12 h,细胞内γH2AX焦点的荧光强度明显减弱,γH2AX量减少,ROS的水平下降.结果表明,胆固醇可诱导人脐静脉内皮细胞中ROS升高,导致DNA损伤.
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  大脑胰岛素信号途径受损导致2型糖尿病时阿尔茨海默病发病风险增高

  杨雁, 王玉萍, 谢君辉, 姜腾, 胡蜀红

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 449-454.

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  大脑胰岛素不仅可调节血糖，而且可改善记忆和认知，而大脑胰岛素缺乏常导致Alzheimer病（Alzheimer’s disease, AD）的发生. 本研究检测了正常及2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）大鼠外周及大脑胰岛素信号传导途径，以探讨T2D时由于大脑胰岛素异常导致AD发病的可能性.以同龄正常SD大鼠为对照（CTL组），高糖、高脂、高蛋白饮食加链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）腹腔注射建造T2D大鼠模型（T2D组）.葡萄糖氧化酶法检测血浆血糖，放免法检测脑脊液及血浆胰岛素，免疫印迹技术检测大脑海马tau蛋白上部分位点磷酸化水平，大脑及肝脏、肌肉组织胰岛素信号传导途径中磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K）/ 蛋白激酶B（protein kinase B，Akt)、糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase3β, GSK 3β）活性. 结果显示：和对照组相比，T2D大鼠血浆葡萄糖水平及胰岛素水平显著升高，脑脊液胰岛素水平显著降低，大脑海马组织tau蛋白上所检测位点均呈过度磷酸化改变，海马及外周组织（肝脏、肌肉）胰岛素信号传导途径PI3K/Akt活性均显著下降，GSK3β活性升高. 研究结果表明：2型糖尿病大鼠大脑胰岛素缺乏及其信号传导途径下调可能是导致阿尔茨海默病发病的重要原因.
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  猪SFRP4基因的表达规律及sp600125对前体脂肪细胞分化的影响

  关华, 郑加盟, 陈宗正, 宋子仪, 杨浩, 杨公社

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 455-463.

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  分泌型卷曲相关蛋白（SFRP4, secreted frizzled-related protein 4）是Wnt信号通路可溶解的调控子.本研究通过高通量测序（Solexa）技术、实时定量PCR（RT-qPCR）对瘦肉型和脂肪型猪不同生长阶段脂肪组织中SFRP4表达规律进行研究；用western免疫印迹及RT-PCR技术对脂肪细胞分化过程中SFRP4蛋白表达和mRNA表达进行检测；用JNK信号通路特异性抑制剂sp600125处理猪原代前体脂肪细胞，研究抑制JNK信号通路对猪前体脂肪分化以及SFRP4 mRNA和蛋白表达的影响.结果显示，SFRP4 在脂肪型猪脂肪组织表达量显著高于瘦肉型猪(P<0.01)；不同组织检测结果发现，SFRP4广泛表达于各个组织，并高表达于脂肪组织；前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中SFRP4表达量逐渐升高；sp600125促进了前体脂肪细胞分化，引起了 PPARγ、FABP4 、ATGL、Perilipin的显著升高(P<0.01)，而SFRP4的表达被显著抑制.本研究为调控脂肪细胞分化关键基因的筛选提供新的理论参考.
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  不同细胞中STAT元件对刺激因子的特异性应答

  黄晓敏, 李冰

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 464-468.

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  以高通量药物筛选为目的，构建转录因子STAT元件驱动的萤火虫荧光素酶报告载体，并进行功能初步验证.人工合成含IRF－1和C－FOS基因上游调控序列中的2个STAT元件的DNA片段，克隆于pGL3－promoter报道质粒作为报道载体pSTATluc|为检测其对不同有效因子刺激的反应性，该报道载体与荧光内参照载体pRL－SV40瞬时共转染不同细胞，在各种因子刺激条件下，双荧光素酶检测系统测定化学发光强度. 结果显示，pSTAT－luc的报道基因载体符合预期设计|该载体转染细胞实验显示，在STAT途径阳性的HeLa、A549和MCF7细胞中，特异刺激因子INF－γ和抑瘤素OSM处理能够剂量依赖性的引起细胞内萤火虫荧光素酶的升高|在STAT途径阴性的PC－12细胞，上述因子不能引起荧光素酶的活性改变|以非该途径因子刺激时，HeLa、A549和MCF－7细胞未见发光水平的改变.结果表明，构建的报道系统具有阳性细胞反应特异性以及阳性刺激反应特异性，能够用于建立靶向STAT信号通路的高通量药物筛选平台.
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  鞘氨醇-1-磷酸对人脐带间充质干细胞增殖及表面标记物表达的影响

  赵宏伟, 怡荣, 那仁格日勒, 高锦, 陈曦, 阿拉坦高勒

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 469-476.

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  鞘氨醇－1－磷酸（sphingosine－1phosphate, S1P）是一种脂质信号分子，与细胞增殖、凋亡和迁移等有密切关系．本研究发现,S1P促进人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC－MSCs)增殖，但目前关于其作用信号通路及S1P对hUC－MSCs表面标记表达的影响尚不十分清楚．Real－time PCR检测hUC－MSCs中S1P受体mRNA表达情况，发现在hUC－MSCs中优势表达S1PR13，而S1PR4、S1PR5的表达很少．MTT法检测S1PR1/3拮抗剂VPC23019、S1PR2拮抗剂JTE013、S1PR3拮抗剂CAY10444、Gi蛋白抑制剂PTX和ERK抑制剂PD98059对S1P诱导hUC－MSCs增殖的影响．结果显示，VPC23019完全抑制S1P诱导的hUCMSCs增殖，JTE013对此没有明显影响，CAY10444部分抑制S1P诱导的hUCMSCs增殖，PTX、PD98059完全抑制S1P诱导hUC－MSCs增殖．进一步用Western印迹检测ERK1/2磷酸化水平揭示,S1P通过促进ERK1/2磷酸化进而促进hUCMSCs增殖．流式细胞术检测发现,S1P对hUCMSCs表面标记物(CD45、CD34、CD90、CD29、CD105、CD44、CD73、CD71)表达没有明显影响．本研究证明，S1P通过S1PR1/3、Gi偶联蛋白及ERK1/2信号通路促进hUCMSCs增殖，而对hUCMSCs表面标记物表达无明显影响．
技术与方法
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  人核糖体蛋白基因启动子区域的转录调控元件分析

  李慧敏, 陈丹

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 477-483.

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  一些调控人核糖体蛋白（ribosomal protein，RP）基因转录的元件（如Sp1、YY1 和 GABP结合位点）已被发现，但人RP基因中很可能含有未知转录调控元件.为进一步了解RP基因的转录调控规律，利用频率比较分析方法和Zscore统计量，在人RP基因启动子序列中抽提出一批高频出现（over－represented）的DNA词（亦称模体）. 其中大部分模体与TRANSFAC数据库中收集的人基因转录因子结合位点（transcriptional factor binding sites，TFBSs）吻合.分析表明，这些模体主要富含碱基C、G或CG与AT含量相当.考察模体与基因转录起始位点（transcription start sites, TSS）的距离发现：超过60%的模体与TSS距离在400 bp以内，只有不到10%的模体与TSS距离900 bp以上.我们推测,抽提到的模体可能与人RP基因的转录调控有关.这些结果为进一步研究哺乳动物RP基因中的转录调控模式和构建基因调控网络具有理论指导意义.
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  利用SMART技术构建疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体文库及芋螺毒素新基因的克隆

  李宝珠, 高炳淼, 吴勇, 于津鹏, 吴潇洒, 罗素兰, 长孙东亭

  中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(5): 484-488.

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  利用RNA 5′末端移动反转录（switching mechanism at 5′ end RNA transcription，SMART）技术构建及鉴定疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体文库，克隆新型芋螺毒素基因.提取疣缟芋螺毒管总RNA，用RT－PC反转录成单链cDNA（single－stranded cDNA，ss－cDNA），长距离PCR（long－distance PCR，LD－PCR）扩增合成双链cDNA（double－stranded cDNA，ds－cDNA），依次用蛋白酶K和SfiⅠ酶进行酶切孵育，用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离.得到的ds－cDNA与λTripIE×2噬菌体载体体外连接并体外包装，感染大肠杆菌E.coli XL1－blue，测定原始文库滴度和重组率.进行文库扩增，测定扩增文库滴度.用PCR鉴定插入cDNA片段的大小，构建的疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体原始文库滴度为1.47×106 pfu/mL，重组率为90.72%，扩增文库的滴度为4.07×108 pfu/mL，插入cDNA片段为200~1 200 bp.利用SMART技术成功构建了疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体文库并克隆出新型芋螺毒素基因，为芋螺毒素基因的筛选和鉴定奠定了基础.