中国生物化学与分子生物学报

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吴艳青, 陈丽云, 黄晓红, 王正朝

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 297-303.

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一氧化氮（NO）作为气体明星分子和信号分子，在哺乳动物体内不同的生理调节过程中具有非常重要的作用，尤其是哺乳动物卵巢功能的调控.一氧化氮合酶（NOS）是NO合成的限速酶，是调节NO合成的关键环节，也是NO依赖性功能调控的重要环节.因此，调节NOS转录/合成的信号通路对哺乳动物卵巢NO依赖性功能具有至关重要的调控作用.最近的研究发现，缺氧诱导因子（HIF）作为转录因子，参与许多与缺氧相关靶基因的转录调控，如NOS和血管内皮生长因子（VEGF）等.本文一方面描述了NO合成及其调控的分子机制，另一方面阐明了HIF作为转录因子对NOS的转录调控，从而揭示HIF在NO依赖性卵巢功能调控中的重要作用，同时为进一步研究哺乳动物卵巢功能的调控提供新的研究方向和理论基础.

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Polycomb蛋白复合体对细胞衰老的表观遗传学调控

姚响云王萌薛丽香

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 304-309.

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细胞衰老在表观遗传学上的调控越来越受到人们的关注.Polycomb蛋白复合体(polycomb group proteins)通过对组蛋白的修饰，尤其是甲基化修饰发挥对靶基因的沉默作用，并因此广泛参与到发育、增殖、分化以及肿瘤发生等重要生命过程.目前，有一系列的研究报道了polycomb的各组份参与了细胞衰老的调控.本文对polycomb发挥基因沉默作用机制的最新研究进展进行了归纳总结，并以衰老过程中的重要分子p16为重点，详细介绍了polycomb调节p16表达，影响细胞衰老进程的机制.研究表明，多种polycomb成员同时结合在p16INK4a基因座，它们的结合表现出相互依赖的同时又有各自的作用.这为进一步深入理解细胞衰老提供了表观遗传学的证据.

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成骨不全的分子机制

徐超,韩金祥,鲁艳芹

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 310-315.

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成骨不全是一类临床表现为骨质脆弱、易骨折等特征的罕见遗传性疾病.绝大多数（90%以上）显性患者发病系由Ⅰ型前胶原α链COL1A1和COL1A2基因突变引起胶原合成量不足，或结构改变.少数隐性患者发病为其他相关基因突变导致胶原翻译后过度修饰、折叠、装配和分泌过程异常.本文就成骨不全发病的遗传学及分子生物学机制作一综述.

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与耳聋相关的线粒体12S rRNA突变

张婷,曾爱平,郑静,管敏鑫

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 316-325.

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线粒体DNA突变是引起听力损伤的重要原因之一. 其中，线粒体12S rRNA基因突变与综合征型耳聋和非综合征型耳聋相关. 导致综合征型耳聋的线粒体DNA突变多为异质性，然而对于非综合征型耳聋突变则多以同质性或高度异质性存在，说明这种分子致病性需要较高的阈值. 位于12S rRNA解码区的A1555G和C1494T突变是造成氨基糖甙类抗生素耳毒性和非综合征型耳聋常见的分子机制. 这些突变可能造成12S rRNA二级结构的改变，影响线粒体蛋白质的合成，降低细胞内ATP的产生，由此引起的线粒体功能障碍导致耳聋. 但是多数基因突变的致病机制还仅处于推测阶段. 其它修饰因子如氨基糖甙类抗生素、线粒体单体型、核修饰基因参与了线粒体12S rRNA基因A1555G和C1494T突变相关的耳聋表型表达.

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Nanos3与生殖细胞发育分化

于萌,廉智敏,华进联

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 326-3310.

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小鼠Nanos3基因是果蝇Nanos的同源基因，是Nanos基因家族的一员. Nanos3是一种RNA结合蛋白，靠近其C端有两个非常保守且连续的Cys-Cys-His-Cys特异锌指结构域.研究显示，Nanos3在小鼠生殖细胞中特异表达，不仅在原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）的维持方面发挥重要作用,而且是一种启动雄性生殖细胞分化程序的内源性因子，其在精子发生中的重要作用已引起越来越多的关注.探讨Nanos3的生物学功能，有助于了解生殖细胞发育过程中的部分重要机制.本文就Nanos3维持生殖细胞更新和原始生殖细胞的维持等作用作一综述.

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激活mGlu5通过MAPK信号通路调节肝癌细胞HepG2生长

武永乐,谷利,杨荟敏,刘莉,张红

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 332-338.

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代谢型谷氨酸受体5（mGlu5）与神经元存活及脑肿瘤发生关系密切.近年发现,mGlu5在肝组织中有表达，并且在肝的病理过程中发挥重要的调节作用.而 mGlu5 是否在肝癌中起作用，目前尚未见报道.本研究选用代谢型谷氨酸受体特异性激动剂二羟基苯甘氨酸(dihydroxyphenylglycine，DHPG)处理肝癌细胞HepG2，从而探讨激活mGlu5对肝癌细胞生长的影响及其机制.结果显示,激活mGlu5能够促进HepG2细胞生长，并激活ERK/JNK通路,抑制p38通路，进而激活转录因子CREB/Elk1和NF-κB.本文揭示了MAPK通路可能参与mGlu5对肝癌细胞生长的调控，为临床提供以mGlu5作为药物靶位点的肝癌治疗新思路.

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与细胞周期G2/M期进程相关的H2AX磷酸化

涂文志,尚增甫,李兵,刘晓丹,王豫,徐勤枝,让蔚清,周平坤

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 339-345.

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γH2AX焦点(foci)被普遍当做DNA双链断裂（DSB）损伤的分子标志物.为探讨细胞周期进程相关的H2AX磷酸化规律特征，采用胸腺嘧啶双阻滞结合噻氨酯哒唑(nocodazole)的后续处理，将HeLa细胞同步于有丝分裂的前中期．然后，用流式细胞仪检测细胞周期、Western印迹和免疫荧光法,观察γH2AX表达和γH2AX焦点的形成．结果显示,细胞进入G2/M期和有丝分裂过程中，γH2AX水平显著增加；在无DNA DSB发生的情况下，部分M期细胞中也存在大量的γH2AX焦点．随着细胞完成有丝分裂从M期退出再进入G1期，γH2AX的表达水平逐渐降低．这种 γH2AX表达变化特征与G2/M期密切关联的PLK1和Cyclin B1的表达规律相类似．在4 Gy大剂量照射下，HeLa细胞于照后8 到12 h出现明显的G2/M期阻滞．γH2AX 焦点数在照后1 h达高峰，随后降低，照后8 h又上升,出现了第2个峰值．与之不同的是，在1 Gy低剂量照射下，细胞的G2/M期阻滞微弱，γH2AX焦点数在照后 0.5 h最高，随后下降，且无反弹，符合DNA DSB的修复动力学特征．因此，将γ H2AX当做DNA DSB分子标志物时，还需要考虑细胞周期变化的影响．γH2AX适合作为1 Gy以下照射的DNA双链断裂损伤的分子标志．

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Potato I型蛋白酶抑制剂 rBTI及其突变体的表达、纯化和活性研究

崔晓东,李玉英,李晨,王转花

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 346-351.

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荞麦胰蛋白酶抑制剂(BTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂Potato I家族，典型构象中有1段暴露在分子外侧的结合区，该区内P1′、P2、P6′与P8′位的氨基酸残基具有高度保守性.本文依据近期解析的rBTI晶体结构以及rBTI与胰蛋白酶复合物晶体结构信息，对rBTI 中的P2和P8′位氨基酸进行突变，构建了pExSecI- Bti-P44T 和 pExSecI-Bti-W53R 重组质粒，转入大肠杆菌 BL21（DE3）中进行表达，通过Resource Q阴离子交换层析和Superdex G 75 HR 10/300凝胶柱进行分离纯化后，测定了rBTI及其突变体对胰蛋白酶的抑制常数，以及它们对HepG2 细胞内的蛋白酶体和细胞增殖的抑制作用. 实验结果显示，rBTI 的44和53位分别突变为 Thr和Arg后，Ki 分别为2.91×10-9mol/L和2.97 ×10-7mol /L，前者较rBTI（Ki = 3.56×10-8 mol/L）降低1个数量级，而后者较rBTI升高1个数量级.功能分析显示，rBTI及2种突变体对HepG2细胞内的蛋白酶体基本没有抑制作用，但是它们都保留了对HepG2细胞增殖的抑制活性.这些结果揭示，作为一种特异的胰蛋白酶抑制剂，rBTI分子中的保守区域氨基酸残基虽然对胰蛋白酶的抑制作用有显著影响，但并不影响其抑制肿瘤细胞的增殖，仍能发挥其原有的生物学功能.

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维甲酸促进小鼠F9细胞中STAT1的反式激活作用

吴海波, 吴勇延, 郜原, 杜娟, 艾志营, 郭泽坤

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 352-358.

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维甲酸能促进肿瘤细胞的凋亡，诱导体外胚胎干细胞的分化，但作用机制的不明使其应用受到极大限制.因此,更多更全面地了解维甲酸的作用机制具有重要意义.本文构建了信号传导与转录激活因子（STAT1和STAT3）的真核表达载体，通过免疫荧光染色、电泳迁移率实验以及双荧光素酶报告基因检测系统证明，维甲酸诱导可以激活转录因子STAT1促使其进入细胞核，并且增强STAT1蛋白与靶基因启动子的结合能力，从而发挥基因表达调控作用.本文结合后续的STAT1功能分析，试图建立起一种“维甲酸-转录因子-靶基因”的研究模式，有助于维甲酸作用机制的全面、系统的研究.这为临床上使用维甲酸作为抗肿瘤药提供理论基础，同时也为胚胎干细胞多能性调控机制研究提供新思路.

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转录因子HBP1抑制骨肉瘤细胞增殖

董威, 王文恭

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 359-364.

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转录因子HBP1(HMG-box containing protein 1, HBP1)属HMG家族，是1个含有513个氨基酸残基的多肽，可与RB蛋白结合，抑制许多癌基因的表达，从而抑制细胞的增殖. 本工作构建了HBP1慢病毒表达载体，病毒包装后感染骨肉瘤细胞U2OS细胞.Western印迹结果显示,感染细胞cyclin D1、c-Myc蛋白质水平降低，而p53蛋白质水平增加；Real-time PCR检测cyclin D1、c-Myc及p53 mRNA水平与蛋白质检测结果一致. HBP1表达载体（pEFBOS-HBP1）和报告基因载体（含 cyclin D1、c-Myc或p53 promoter）共转染U2OS细胞后的荧光素酶分析发现，HBP1可抑制cyclin D1、c-Myc启动子转录激活，促进p53启动子转录激活，并且这种抑制或激活作用具有HBP1剂量依赖性. 以细胞代龄群体倍增值PD （population doubling）为指标测试细胞生长结合软琼脂集落形成实验证明，HBP1慢病毒感染的U2OS细胞生长速度减缓、集落形成能力下降. 上述结果提示，HBP1可能通过调控细胞增殖相关基因的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖.

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人FUT4基因近端启动子结构的初步分析

杨雪松, 刘帅, 燕秋

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 365-369.

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LeY是一种双岩藻糖化寡糖，在大多数上皮来源的肿瘤细胞（包括乳腺癌、卵巢癌等）中高表达.岩藻糖基转移酶Ⅳ（fucosyltransferase Ⅳ, FUT4）是合成LeY的关键酶. 前期工作发现,FUT4通过增加LeY糖的合成来促进细胞的增殖. 但有关FUT4的转录调控机制尚不清楚. 本文通过对人FUT4基因近端启动子进行生物信息学分析，并构建不同长度启动子序列荧光虫荧光素酶报告基因表达载体，分析其转录活性. 使用First EF程序分析并获得FUT4近端启动子序列，采用PCR 法扩增FUT4基因近端不同长度的启动子序列，定向克隆，获得不同长度的启动子重组质粒. 重组质粒经双酶切及测序鉴定正确. 荧光素酶活性分析不同长度的FUT4 基因启动子片段的转录活性.结果显示,pGL6-FUT4-1.2 kb在MCF-7和MDA- MB-231细胞中转录活性明显升高（P<0.05）.说明FUT4基因启动子区域定位于转录起始位点上游的-800～-1 600 bp的区域内.

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利用体外血脑屏障模型结合高压液相-质谱技术筛选传统中药——朝鲜淫羊藿有

包宇, 孙润广

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 370-374.

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血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)是位于中枢神经系统(central nervous system, CNS)和中枢系统环境间的一层生理保护屏障. 凡是作用于CNS 的药物，必须先通过BBB. 为了寻找能够进入CNS的药物，通过细胞培养时间优化和跨膜电阻测定等，建立了ECV304/C6共培养通过BBB药物筛选模型. 并将该模型应用于从传统中药淫羊藿的提取物中，筛选可能作用于CNS的活性成分，结合高压液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)，对筛选出的化合物进行鉴定分析. 研究结果表明，淫羊藿提取物中至少有13种成分能够穿越BBB模型，其中2种成分被确认为淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ，为CNS药物开发的早期快速筛选提供了实验依据.

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降落-重叠PCR法四重融合构建平菇同源重组片段

柴冉, 孙强, 邱立友

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 375-379.

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对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法. 本文提出一种新的融合PCR策略，即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序，减少不适当的退火温度和PCR产物3′端额外碱基A对片段融合、扩增的影响，提高正确融合与扩增的效率. 结果表明，为构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列，在4个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp和1 008 bp的片段进行融合时，在重叠PCR的第1步加上退火温度61.5 ℃～57.5 ℃、每降落0.5 ℃进行1个循环的降落PCR程序，在重叠PCR的第2步加上退火温度60 ℃～56 ℃、每降落0.5 ℃进行1个循环的降落PCR程序，经过1次PCR即获得顺序正确的全长融合片段. 测序结果与4个片段序列的一致性达到98.5%，降落-重叠PCR法对多个长片段的基因融合具有较高的应用价值.

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利用微波-热效应进行限制性内切核酸酶反应的可行性验证

穆慧敏, 姜华, 王艳丽, 孙国昌

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 380-384.

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限制性内切酶催化的酶解反应是分子生物学实验中的常用技术.鉴于酶切反应时间长，有人提出采用微波释放的热效应催化限制性内切酶解反应，以期缩短酶解时间.但微波是否能代替传统酶切反应还需验证.本研究设计了一系列的酶切试验，验证微波酶切是否有效.结果表明：短时间（2 min）微波炉高火处理未导致DNA降解及内切酶失活.对于质粒的单酶切和部分双酶切，短时间（2 min）微波炉处理可替代水浴加热完成酶解反应.对于部分双酶切体系，微波炉处理酶切不完全，不能替代温水浴.使用微波酶解需严格控制时间，切勿时间过长.

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棘孢木霉（Trichoderma asperellum）几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析

汤伟, 夏伟, 李雅华, 丛大鹏, 咸洪泉

中国生物化学与分子生物学报. 2012, 28(4): 385-392.

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几丁质酶作为木霉菌防治植物病虫害的主要因子，在生物防治和环境保护等领域发挥着重要的作用.为了研究棘孢木霉（Trichoderma asperellum）的生防机制并获得与其相关的功能基因，本研究通过RT-PCR、3′-RACE及5′-TAIL- PCR技术克隆了T. asperellum 1个几丁质酶基因Tachi1，对该基因进行了生物信息学分析，并利用毕赤酵母表达系统进行表达验证. Tachi1的DNA序列长1 635 bp，含有3个内含子，包含1 275 bp的开放阅读框，编码424个氨基酸；Tachi1属于糖基水解酶18家族内切几丁质酶，包含SIGGW底物结合位点和FDGIDXDWE活性中心位点，信号肽长度为22个氨基酸，成熟肽分子量为44 kD，二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件，三级结构为(α/β)8的圆桶形结构. 转Tachi1基因酵母工程菌可高效分泌表达几丁质酶Tachi1，甲醇诱导培养8 d几丁质酶酶活可达9.25 U/mL.

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