中国生物化学与分子生物学报

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王小爽, 张俊武

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 293-299.

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微RNA（MicroRNA,miRNA）是一类长18~25 nt的非编码RNA，主要通过与靶基因mRNA 3′UTR上的互补区域结合后在转录后水平（RNA切割或翻译抑制）负性调控靶基因的表达. 现已发现,miRNA参与了多种正常细胞过程以及肿瘤发生的调控. miRNA也在造血链系分化和相关白血病中发挥重要作用.急性髓系白血病（AML）是一种涉及多种遗传学变异的造血恶性肿瘤,在中国的髓系白血病中发病率最高.在不同遗传学特征的AML中，miRNAs具有差异表达谱, 这种差异表达谱可作为AML临床诊断和预后的依据.一些在白血病中表达异常的miRNAs的致癌作用机制已被阐明, 今后有望开发针对这些miRNAs的药物，从而为白血病的治疗提供新的靶点.

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支架蛋白Gab2信号调控与乳腺癌

张珊珊, 柯越海

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 300-304.

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Gab2是支架蛋白Gabs家族中的重要成员.该家族蛋白通过介导膜受体与信号转运蛋白间的偶联及各信号分子间的整合参与信号传导.作为支架蛋白，Gab2可被酪氨酸激酶磷酸化激活，接受胞外多种因子刺激，招募富含SH2结构域的信号转运分子，活化下游SHP2/Ras/ERK和PI3K/AKT等一系列信号传导途径,在细胞增殖、分化、凋亡及迁移等生理过程中发挥重要作用.近年研究发现，GAB2在人类早期肿瘤及乳腺癌细胞系中高表达，并与其它原癌基因(ErbB2/Neu) 共同协作参与调控乳腺癌发生及转移.本文就Gab2蛋白的结构、信号调控机制及在乳腺癌中的最新研究进展进行综述.

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Krüppel样转录因子8(KLF8)的结构及功能

万伟峰, 朱继*, 方升, 籍新潮, 吕国伟

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 305-309.

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Krüppel样转录因子8(Krüppel-like factor 8, KLF8)是KLFs家族中的一员.KLF8在羧基端含有3个保守的C2H2锌指结构域，用于与DNA结合. KLF8的转录受粘着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）、KLF1(erythroid krüppel-like factor1)、KLF3(basic Krüppel-like factor)的调控.类泛素化是KLF8翻译后主要的修饰方式. KLF8 在氨基端含有特定的PVALS/T基序，与辅助抑制因子C末端结合蛋白（C-terminal binding protein, CtBP）相互作用，抑制调节区含CACCC元件的基因表达.此外,还可以通过招募辅助激活因子p300和p300/CBP相关因子（P/CAF）辅助激活靶基因的表达. 同时, KLF8在细胞周期循环、细胞侵袭和上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）、细胞致癌性转化及肿瘤发生发展中发挥作用.

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癌表观遗传调控与癌症治疗

刘志坚, 孙英丽*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 310-315.

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基因功能与表达模式异常是癌症的主要特征.日益增多的研究表明,DNA甲基化（DNA methylation）、组蛋白修饰（histone modification）、染色质重塑（chromatin remodeling）以及microRNAs介导的基因沉默等表观遗传调控方式的异常与癌症的发生发展密切相关.阐明癌症发生发展过程中的表观遗传学调控改变并籍此设计、开发治疗癌症的有效药物已受到高度重视.本文综述了癌症表观调控研究领域的相关进展，并着重讨论了应用表观遗传调控的方法治疗癌症的现状和前景.

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稳定转染MiR-499对P19CL6细胞向心肌细胞分化的影响

李贤慧1), 贾竹青1), 崔庆华2), 马康涛1), 周春燕1)*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 316-322.

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小鼠miR-499基因包含在心肌重链肌球蛋白Myh7b基因的第19内含子中，并且在心肌细胞中特异表达，然而其在心肌细胞中表达的生物学功能和意义尚不清楚. 利用可体外分化为心肌细胞的P19CL6细胞建立稳定表达miR-499的细胞株对研究 miR-499的生物学功能具有重要意义.根据小鼠miR499基因序列，设计PCR引物并将扩增产物定向克隆到pcDNA3.1中构建为真核表达载体并转染小鼠P19CL6细胞，经G418筛选建立了稳定转染的P19CL6-miR-499细胞株.用TaqMan探针实时定量 PCR检测表明, P19CL6-miR-499细胞可成功表达成熟的miR-499. 经1％DMSO诱导分化，RT-PCR、 real-time PCR和激光共聚焦显微镜免疫荧光分析，结果表明,稳定转染miR-499对细胞分化早期的分子标志Isl1和Tbx5的表达没有明显影响，但是对分化晚期的特异性分子心肌α肌动蛋白(αcardiac actin)和心肌肌钙蛋白(troponin I)的表达有明显抑制作用，这提示miR499主要对心肌细胞分化晚期有影响.

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下调窖蛋白-1表达抑制小鼠肝癌H22细胞侵袭能力

汪淑晶1), 樊建慧1), 于生金2), 张嘉宁1)*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 323-329.

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窖蛋白-1在不同肿瘤中发挥作用不同. 本研究以小鼠肝癌细胞H22为研究对象，观察下调窖蛋白-1表达对H22细胞侵袭能力的影响，并探讨其可能的分子机制. 利用RT－PCR和Western印迹法检测了窖蛋白-1在H22及小鼠正常肝细胞IAR20中的表达.结果显示，窖蛋白1在H22中的表达高于其在IAR20中的表达，提示窖蛋白 -1高表达可能与H22细胞恶性表型有关. RNA干扰和凝集素印记实验结果显示，窖蛋白-1－siRNA能够有效抑制窖蛋白－1mRNA和蛋白表达，并抑制细胞表面N－聚糖 β1,6GlcNAc分支形成. Transwell细胞迁移和侵袭实验结果显示，与未转染组和 siRNA 对照组比较，转染窖蛋白-1siRNA的H22细胞迁移和侵袭数目明显减少. 本研究证明，下调窖蛋白－1表达可抑制H22细胞表面N聚糖β1,6GlcNAc分支形成，从而抑制细胞迁移和侵袭能力.

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一种用作阴性对照的siRNA可诱导人K562细胞向红系分化

范翠青, 朱宁, 沈岩, 陈梅红*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 330-336.

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我们发现，一种在RNA干扰实验中用作阴性对照的商业化siRNA具有明显的诱导人慢性髓性白血病K562细胞系向红系方向分化的作用.它表现为K562细胞瞬时转染该siRNA后，红系分化的特异表面标志CD235及ε、γ和β珠蛋白的表达升高，GATA-2的表达降低，细胞增殖速度减慢，软琼脂克隆形成率降低，并且此过程不伴随细胞凋亡. 而生物信息学分析显示,该siRNA序列与目前所有已知人类基因均无明显同源性.研究结果提示，该siRNA不适于用作红系分化实验中的阴性对照. siRNA的作用远比人们目前所知的要复杂得多，siRNA的脱靶效应应当引起研究者的足够重视，在RNA干扰实验中阴性对照siRNA的选择会极大地影响对实验结果的判读.

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Pkh1/2-Pil1信号调节酵母细胞内吞

刘莹毕强王国丽徐鸿翾刘楠启

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 337-340.

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酵母细胞中Pkh1/2信号影响细胞内吞功能.Pil1因与Pkh1/2形成复合物并可被其磷酸化引起关注.新近发现一个大分子复合物eisosome 是内吞的标志性位点，而Pil1是其主要成分.前期研究发现，Pil1的磷酸化状态对eisosome结构完整至关重要.本研究通过检测Pkh1/2突变菌的生长和萤光黄（LY）染料在空泡聚集情况，发现由于Pkh1/2突变导致的生长抑制和液相内吞功能丧失,可部分由过表达的 Pil1补偿，得出结论是Pkh1/2-Pil1信号在一定程度上调节细胞内吞.

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双靶向MMP-14和金属离子的结合肽筛选与分子模拟

梁志娟**, 黄敬双**, 崔健, 熊莉丽, 茆灿泉*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 341-349.

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以基质金属蛋白酶-14(MMP-14)催化结构域为靶标，通过噬菌体随机十二肽库筛选和分子模拟、细胞免疫荧光、金属离子亲和层析以及体外细胞作用测定等技术，进行了双靶向MMP-14和金属离子小分子结合多肽的筛选与研究.经4轮筛选，噬菌体得到有效富集并获得13条不同的多肽序列.序列分析显示,可能的一致序列有：AHQLH、HHXH、EI/LPLL/I.分子模拟与对接进一步确认一致序列AHQLH、HHTH 、LPLL与MMP-14催化结构域的氨基酸120~125区域良好分子对接并具有一定的专一性，多条MMP-14结合肽不仅靶向MMP-14,同时结合金属离子.细胞生物学研究确认,所测定的结合肽噬菌体对MMP-14诱导表达的MG63细胞具有良好的结合作用，揭示结合肽对MMP-14的靶向结合特性，并且合成的AHQLH、LPLL一致序列多肽对MG63 细胞活力具有一定的抑制能力.这些新的和具有一定MMP-14专一性的一致序列可望用于靶向MMP-14抗肿瘤药物的研发和利用.

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海南产桶形芋螺蛋白质二硫键异构酶的鉴定

彭超, 高炳淼, 郑晓冬, 张容鹄, 长孙东亭, 张本, 罗素兰*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 350-355.

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蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶.在热带药用海洋生物芋螺的毒液中富含PDI酶，该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内氧化折叠至关重要.本研究主要采用凝胶过滤层析和制备型Rotofor液相等电聚焦电泳等多种方法，从海南产桶形芋螺（Conus betulinus Linnaeus）毒管中分离纯化天然的PDI酶蛋白，经电泳和MALDI-TOF MS质谱鉴定分析确证获得了高纯度的桶形芋螺PDI酶，建立了天然芋螺PDI酶分离纯化的技术方法. 以芋螺毒素线性肽K412为底物进行了PDI酶活性鉴定.结果表明,该分离纯化的PDI酶能够促进K412 的氧化折叠.由于芋螺毒素的氧化折叠非常复杂，且氧化折叠后具有正确二硫键连接方式的芋螺毒素才具有各种药理活性，因此，本研究结果为后续PDI酶在种类繁多的芋螺毒素氧化折叠中的应用及其作用机制研究提供了重要的物质基础.

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人PRR11启动子的结构与功能初步分析

艾青1),2), 卜友泉1),2)*, 刘竹1),2), 兰欢1),2）, 吉颖1),2）, 杜刚1),2), 杨正梅3), 刘革力1),2), 宋方洲1),

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 356-363.

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PRR11（proline-rich protein 11，PRR11）是我们最近发现的一个新的肿瘤相关基因.初步研究表明, PRR11参与细胞增殖、细胞周期和细胞癌变等多种生物学过程．为了进一步研究PRR11基因的转录调控机制并全面解析其功能，本研究对PRR11基因的启动子进行了克隆鉴定和初步分析．首先,应用5' RACE（rapid amplification of cDNA ends，cDNA末端快速扩增）技术鉴定了PRR 11基因的转录起始位点，发现了其具有多个转录起始位点．通过PCR定向克隆和DNA blunting 技术，构建了6个相互重叠并覆盖PRR 11基因转录起始位点附近约2.0 kb区域的 PRR 11基因启动子荧光素酶报告基因重组体．启动子活性分析表明，PRR 11基因启动子主要定位于转录起始位点附近-563 bp～+341 bp的区域内．采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明，PRR 11基因启动子缺乏典型的TATA盒，但含有典型的GC盒、CCAAT盒以及潜在的经典转录因子E2F1和MYB的结合位点，提示Sp1、 NF-Y、E2F1和MYB等经典转录因子可能参与PRR 11基因的转录调控．

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蔗糖调节拟南芥花青素的生物合成

杨少华, 王丽, 穆春, 王翔, 何静辉, 赵静尧, 王林嵩*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 364-369.

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为了探讨糖在花青素合成过程中的调节作用，采用蔗糖和其代谢糖（葡萄糖和果糖）组合处理拟南芥幼苗.实验结果表明,60 mmol/L蔗糖处理显著提高拟南芥幼苗的花青素、还原糖含量,并上调花青素合成相关基因（CHS, FLS-1, DFR, LDOX, BANYULS）的转录，对叶绿素含量和UGT78D2基因的转录无影响；20 mmol/L 葡萄糖+20 mmol/L果糖处理,对花青素、叶绿素和还原糖的含量无影响，对花青素合成相关基因转录影响不一；20 mmol/L蔗糖+20 mmol/L葡萄糖+20 mmol/L果糖处理后，花青素和还原糖含量介于前两个处理之间,也上调花青素合成相关基因的转录;但和蔗糖处理组相比，上调UGT78D2基因转录，下调FLS-1基因转录.在不同处理组之间，花青素含量变化和还原糖含量变化趋势相同，有可能糖在调节花青素合成的同时也调节还原糖含量.因此，蔗糖既可以通过蔗糖特异信号途径,也可以和其代谢糖通过其他途径共同调节拟南芥花青素的生物合成.

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过表达外源ST3Gal I增加MCF-7细胞与胞外基质粘附和侵袭能力

崔红霞1),2), 岳丽玲1), 刘吉成1)*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 370-376.

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为探讨过表达外源α2,3-唾液酸转移酶（ST3Gal Ⅰ）对乳腺癌MCF-7细胞粘附和侵袭能力的影响，构建pEGFP-N1-ST3Gal I真核表达载体.采用GenEscortTM Ⅱ包裹后转染MCF-7细胞. MCF-7细胞为3组：未转染组 (M)、转染空质粒组 (P) 和转染ST3Gal I组 (ST3); 荧光显微镜观察融合蛋白EGFPST3Gal I的表达.采用半定量RT-PCR、Western印迹法分析转染后MCF-7细胞ST3Gal Ⅰ基因mRNA水平和蛋白表达水平;流式细胞术分析ST3Gal Ⅰ下游产物细胞表面α2,3-唾液酸含量；采用细胞粘附实验及transwell小室检测转染前后细胞与基质胶Matrigel粘附、迁移和侵袭运动能力的变化.结果表明, 荧光显微镜下P组细胞内绿色荧光呈弥散分布，而ST3组绿色荧光主要集中在细胞质中，RT-PCR与Western印迹也证实了外源 ST3Gal Ⅰ基因mRNA和蛋白表达均明显增加（P<0.05），其下游产物细胞表面 α2,3-唾液酸含量明显增加（P<0.05）；与M、P组相比，ST3组表现为粘附、迁移和侵袭能力明显增强（P<0.05）.利用转染技术可明显提高外源ST3Gal Ⅰ在MCF -7细胞表达，明显增加MCF-7细胞与胞外基质（ECM）粘附、迁移和侵袭能力，可形成肿瘤入侵表型，将有望成为治疗乳腺癌转移的新靶点.

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利用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的病毒编码蛋白

肖静, 胡嘉淼, 肖小平, 员月明, 刘明亮, 曾宝娟, 李婧惠, 周天鸿, 冉艳红, 李弘剑*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 377-383.

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人巨细胞病毒(HCMV) UL23基因编码病毒皮层蛋白,该基因缺失时,病毒在人包皮成纤维细胞(HFF)中的繁殖速度加快.为进一步阐述HCMV UL23基因编码产物 pUL23的功能及调控机制,采用鸟枪法构建了融合于GAL4活性区域的HCMV Towne株基因组随机表达文库.利用酵母双杂交技术,以pGBKT7 -UL23为诱饵质粒,从构建的HCMV基因组表达文库中筛选到与pUL23相互作用的病毒编码蛋白pUL24. GST-pull down实验和免疫共沉淀实验进一步确认两种病毒蛋白之间的相互作用.结果表明,构建的HCMV基因组表达文库能够用于GAL4酵母双杂交系统筛选与诱饵蛋白相互作用的病毒自身编码蛋白.病毒蛋白pUL23和pUL24之间具有相互作用,这为进一步阐述pUL23在HCMV感染过程中的功能提供依据.该研究为揭示HCMV病毒感染机制奠定了基础.

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基于卡那霉素抗性建立的研究I类内含子结构与功能关系的系统

殷伟, 林瑛, 孟清*

中国生物化学与分子生物学报. 2011, 27(4): 384-389.

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Ⅰ类内含子（group I intron）是研究RNAs结构与功能关系的理想元件, 在解释RNA折叠理论、催化机制等方面起着重要作用；对其结构与功能关系的研究也因此成为一个非常重要的课题. 本研究建立了一个基于卡那霉素抗性进行Ⅰ类内含子结构与功能关系研究系统,将源于海洋蓝细菌Nostoc punctiforme（Npu）核糖核酸还原酶基因（ribonucleotide reductase，Rir）中的1个Ⅰ类内含子插入到pDrive质粒的卡那霉素抗性基因（kanamycin resistance gene,KanR）内构建得pKR12质粒并转化大肠杆菌（E.coli）. 只有内含子剪接的阳性克隆才能生成 KanR蛋白并在Kan抗性平板上生长. 结果显示,pKR12转入E.coli后不能在Kan抗性平板上生长, RT-PCR检测仅可见前体带, 表明插入到KanR中的Npu Rir内含子没有发生剪接. 随后通过易错PCR建立内含子的随机突变库并用Kan抗性筛选进行定向演化, 产生有剪接活性的内含子突变体, RT-PCR检测显示剪接发生. 由于内含子剪接活性的改变可通过Kan抗性变化在LB平板上得以反映, 因此该系统有望成为简单快速地研究Ⅰ类内含子结构与功能关系的有利工具.

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