中国生物化学与分子生物学报

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冯晨, 冯磊

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 683-689.

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棕榈酰化是一种可逆的翻译后修饰,其对蛋白质的定位和功能具有重要的调节意义.离子型谷氨酸受体有N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体、α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体和人海藻酸受体.近期研究发现,它们的棕榈酰化修饰对其膜表面分布和内化均具有重要的意义.其中NMDA受体在其C末端有2个不同的棕榈酰化位点.1个位于C末端近膜区（Cys cluster Ⅰ）,它的棕榈酰化可以增高酪氨酸的磷酸化水平,增加受体膜表面分布,影响神经元中NMDA受体的组构性内化；另1个位于C末端中部（Cys cluster Ⅱ）,它受到蛋白质酰基转移酶GODZ的调节,使得受体在高尔基体大量积聚,从而影响受体的膜表面分布. 与NMDA受体相似,AMPA受体也存在2个棕榈酰化位点.1个位于在第2跨膜域,受蛋白质酰基转移酶GODZ的调节,能导致AMPA受体在高尔基体的积聚.另1个位点在受体C末端近膜区,它的棕榈酰化能降低AMPA受体和4.1N蛋白的相互作用,并调节受体的内化.这两种离子型谷氨酸受体在棕榈酰化机制上虽然存在差异,但均对受体的运输、膜表面分布和内化具有十分重要的作用.

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黑色素瘤发生发展中的表观遗传学调控

胡滔,何永蜀,朱月春

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 690-696.

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人恶性黑色素瘤（malignant melanoma）是近年来高发病率和高死亡率的肿瘤之一. 目前尚缺乏有效的治疗方法. 而表观遗传如DNA甲基化（DNA methylation）、组蛋白修饰（histone modification）、染色质重塑（chromatin remodeling）及RNA干扰（RNA interference, RNAi）等改变在人黑色素瘤的发生、发展和转移中有重要作用. 阐明黑色素瘤发生发展的表观遗传学机制已引起了学者的普遍关注. 本文综述了人类黑色素瘤发生发展中所特异的表观遗传改变：CpG岛的异常甲基化修饰、组蛋白甲基化和乙酰化修饰、染色质重塑以及microRNA在黑色素瘤发生和转移中的作用，并对应用表观遗传修饰治疗人类黑色素瘤进行了探讨.

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分枝杆菌分泌系统

李武, 王洪海, 谢建平

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 697-704.

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分泌系统对于具有特殊细胞被膜结构的分枝杆菌，尤其是致病性分枝杆菌的存活和毒力非常重要. 不少重要的致病因子或存活因子都通过特定的分泌系统进入环境，包括宿主体内. 本文从分泌系统的基因、结构组成、分泌底物、转运机制及其与致病菌毒力的关系等几个方面介绍了分枝杆菌(mycobacteria)通用型分泌系统（general secretion pathway, SecA1）、替代型分泌系统（accessory Sec system, SecA2）、双精氨酸分泌系统（twin-arginine translocation, Tat）和Ⅶ型分泌系统（type Ⅶ secretion systems, T7S system or ESX）4种分泌系统，并重点分析了Tat分泌系统. 这些知识有利于从分泌系统及其底物的角度揭示结核分枝杆菌等胞内致病菌存活和逃避宿主免疫的机理，将为研发新的结核病控制措施提供依据.

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植物中的核质转运相关蛋白

高英, 赵开军, 郭建强, 赵金凤

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 705-711.

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细胞内各个生命过程的有序进行需要生物大分子在细胞核与细胞质之间有选择、有控制地转运.而细胞核膜的存在为大分子的自由穿梭设置了屏障,因此生物大分子在细胞核与细胞质之间的转运要依赖于一些受体蛋白.输入蛋白β（importin β）是首先从人类细胞中发现的生物大分子向细胞核输入的受体,其后相继鉴定出多个与输入蛋白β具有同源性的细胞核转运受体,命名为类输入蛋白β.这些转运受体介导的转运过程在生物有机体之间高度保守,在动物及酵母中调控核质穿梭以及各个信号过程的组分与分子机制研究较为清楚,但在植物中相对匮乏.本文在介绍细胞核转运受体共有结构特点和转运机制基础上,重点综述了植物细胞核转运受体的最新研究进展以及这些受体在植物信号转导中的重要调节作用.

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过表达EoRPL11下调HEK293T细胞中蛋白质的翻译活性

张国强,张志云,柴宝峰,王伟,梁爱华

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 712-719.

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核糖体蛋白L11（RPL11)是真核生物核糖体的重要组成部分. RPL11参与核糖体的生物发生及其它的一些细胞调控过程. 本研究在人细胞中研究了游仆虫RPL11（EoRPL11）的亚细胞定位及对蛋白质合成的调控功能. 通过激光共聚焦显微镜观察发现,融合绿色荧光蛋白的EoRPL11分布于细胞核中, 并集中于核仁上；将EoRPL11和海肾荧光素酶报告基因共转染HEK293T细胞后发现, 细胞内海肾荧光素酶的酶活性明显下降, 并呈现一种剂量依赖性关系；实时定量PCR分析则表明,海肾荧光素酶的mRNA水平并没有明显改变；同时，细胞的增殖也受到了一定的抑制. 以上结果表明,EoRPL11是核蛋白，并且其过表达可能在翻译水平上抑制细胞内总蛋白质的合成.

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vWF-ΔPro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FVIII基因转移

朱甫祥,杨树德,刘泽隆,屈慧鸽,迟晓艳

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 720-726.

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多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除．前肽缺失突变体vWF (vWF-ΔPro)不能形成多聚体，但可以结合FⅧ蛋白．为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响，将vWF-ΔPro基因和融合Ssp DnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达，用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式，并检测了其对FⅧ的结合力；用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ，并用Coatest法检测由其产生的生物活性．结果显示，vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式，其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近；vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21 ng/mL，活性为1.78±0.18 IU/mL，明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12 ng/mL和1.05±0.13 IU/mL)，与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19 ng/mL和1.95±0.22 IU/mL)，表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性．为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据．

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敲除AMP1基因可以提高干旱响应基因的表达量从而增强拟南芥的抗旱能力

夏金婵,田丽丽,刘维仲,何奕昆

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 727-733.

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干旱严重影响植物的生长发育及农作物产量，因此研究植物的干旱反应机制显得至关重要.我们发现在拟南芥中一个推测的谷氨酸羧肽酶, AMP1, 其缺失突变体amp1的抗旱能力大大增强.基因芯片分析表明,amp1突变体抗旱能力的提高与许多干旱响应基因的高表达息息相关，例如，在amp1突变体中2个干旱诱导表达的转录因子基因，DREB2A和DREB1A的表达量升高；AT1G61340 (LEA 蛋白)的表达量也升高了很多，它在干旱条件下具有解毒和缓解细胞伤害的作用.而且，在amp1突变体中DREB2A 转录因子的2个下游基因RD29A 和COR47受干旱诱导的表达量和时间都比野生型中高和早. 在突变体中一些参与蛋白代谢、糖代谢和脂代谢的基因上调，一些保护和解毒相关基因表达量也升高，这些都可以给突变体在抗旱反应过程提供一定的保护作用.因此，我们认为AMP1基因在干旱胁迫反应中对干旱响应基因的表达起到一个负调控作用.实验中我们还发现, amp1突变体具有较低的水势与非常发达的根系,这也可能在抗旱反应中起到了一定作用.

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可磷酸化短肽偶联壳聚糖促进CS/DNA转染效率

任玉平,赵荣兰,孙蓓, 左爱军,梁东春

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 734-739.

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合成基序为LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的短肽(pSP)，其中含有两个可被JaK2蛋白激酶磷酸化的酪氨酸残基. 将此短肽与壳聚糖(CS)相偶联，体外磷酸化及DNA释放实验检测哺乳动物细胞裂解液对短肽的磷酸化及pSP-CS/DNA复合物中DNA释放的影响. 放射性标记DNA转移实验验证pSP-CS/DNA复合物的入胞能力后，将荷荧光素酶或GFP报告基因的质粒与pSP-CS制成pSP-CS/DNA复合物，转染体外培养的C2C12小鼠成肌细胞，观察GFP的分布及细胞裂解液中的荧光素酶活性以表征转染效率.继而进行多种细胞系的转染，衡量pSP偶联的壳聚糖对不同种属细胞的转染效率.结果表明，哺乳动物细胞裂解液可有效地使短肽发生磷酸化，并藉此促进DNA与壳聚糖载体的解离.以pSP修饰的壳聚糖进行转染时，细胞裂解液的荧光素酶活性可达普通壳聚糖转染的两倍, 细胞中GFP的含量也明显增加.据此推论，短肽被磷酸化后产生电荷属性的改变，促进DNA与壳聚糖载体的解离从而显著提高壳聚糖的转染效率.

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顺乌头酸酶基因在杀雄剂 SQ-1诱导小麦雄性不育花药中的表达分析

张明珠, 袁蕾, 王俊生, 张改生, 郭文江, 张龙雨

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 740-748.

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采用RT-PCR技术，克隆了小麦胞质顺乌头酸酶基因（cACO）部分cDNA序列. 该cDNA序列长1 368 bp，编码456个氨基酸，GenBank登录号为GU475062.半定量RT-PCR结果表明，在生理型不育和可育花药发育的单核早期至三核期，cACO基因的表达水平均表现为先升后降；在生理型不育花药发育的单核晚期cACO基因表达水平与同期可育花药相比显著升高，到二核期和三核期明显降低，ACO酶活性变化表现出相同趋势.这反映出在小麦生理型不育系中，cACO基因在花药败育关键期异常表达可能影响了花药发育过程中正常的能量供应和物质代谢，导致花粉发育能量不足和所需物质匮乏，从而导致了非遗传型花药败育现象.

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ADAM17通过EGFR-PI3K/Akt/p27通路调控前列腺癌细胞增殖

吴琦 , 冯田 , 孙希财 , 林平 , 边淑玲 , 赵雪飞 , 李聪 , 于晓光

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 749-755.

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ADAM 17是金属蛋白酶家族（ADAMs）成员之一，研究发现ADAM17可以通过水解细胞表面蛋白的胞外结构域导致肿瘤细胞的增殖和转移．本课题前期研究结果显示，与LNCap细胞相比，ADAM17在DU145细胞中高表达，且与细胞增殖相关．为了研究ADAM17与前列腺癌细胞增殖相关基因p27表达的关系及调控机制，我们采用RNAi技术下调ADAM17的表达，加入PMA（一种ADAM17的激活剂）上调ADAM17的表达，通过细胞计数和CCK-8方法检测细胞增殖，RT-PCR检测p27mRNA的表达，Western印迹检测ADAM17的表达；进一步阻断EGFR和PI3K/Akt信号转导，RT-PCR方法检测p27mRNA的表达，Western印迹检测ADAM17、EGFR、pEGFR、Akt 和pAkt的表达．结果显示ADAM17的表达与前列腺癌细胞的增殖呈正相关（P<0.05）；p27 mRNA的表达与ADAM17的表达呈负相关（P<0.05）；分别阻断EGFR和PI3K/Akt信号转导通路，同时使ADAM17表达增加，与对照组（单独PMA处理组）相比，p27mRNA的表达均增加（P<0.05）．提示ADAM17调控前列腺癌细胞增殖相关基因p27表达是通过EGFR-PI3K/Akt信号通路实现的．

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鸡Visfatin基因9 bp indel杂合突变异源双链DNA的鉴定

韩瑞丽,康相涛,魏杨,李国喜,蓝贤勇,陈宏

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 756-761.

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内脂素(Visfatin)是脂肪细胞因子家族的新成员，主要由内脏脂肪组织产生.研究表明内脂素具有类胰岛素样作用. 在检测固始鸡-安卡鸡资源群体3代（亲本，F1，F2）964只鸡Visfatin基因9 bp 插入/缺失(9 bp‘TAACCTGTG’ insertion-deletion)多态的过程中，发现其杂合子的变性和非变性聚丙烯酰胺胶上除2条同源双链DNA（282 bp和273 bp）外有2条未知条带（命名为A 和 B）. A，B条带经回收、二次PCR、再次聚丙烯酰胺凝胶电泳及DNA测序表明：Visfatin基因第10内含子中9 bp insertion-deletion突变杂合子的PCR产物中，本身包含2种同源双链DNA片段和2种异源双链DNA片段，不需要经过额外的变性、退火处理，其PCR产物可以直接进行突变检测，在229个杂合突变中异源双链DNA的检出率为100%. 因此，通过异源双链DNA这一标示物作为基因分型时的依照或者参考，建立适当的异源双链DNA分析法可进行基因中几个核苷酸插入／缺失多态的检测.

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HPV6 L1/ Ct MOMP多表位融合基因在COS-7细胞的表达及其在小鼠的免疫效果观察

许文,石朝辉,朱珊丽,陆丽君,孟锐峰,李玲,张丽芳

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 762-767.

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研究人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）6b 结构蛋白L1（HPV 6b L1）基因佐剂增强沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）主要外膜蛋白（MOMP）多表位（Ct MOMP 168）DNA 疫苗的免疫效果的可能性. 构建pcDNA3.1(+)/ HPV6b L1/Ct MOMP 168 融合重组质粒，转染COS-7细胞，用RT-PCR、激光共聚焦显微技术及Western 印迹技术检测其表达. 分别用pcDNA3.1(+)/ HPV6b L1/Ct MOMP 168、pcDNA3.1(+)/Ct MOMP 168 及pcDNA3.1(+)质粒肌肉免疫BALB/c 小鼠,ELISA检测外周血中IgG及阴道分泌物中sIgA. 结果表明，pcDNA3.1(+)/ HPV6b L1/Ct MOMP 168可在COS-7细胞中表达；Ct MOMP168组和HPV6b L1/Ct MOMP 168 组均可刺激小鼠产生抗Ct MOMP特异性的抗体，抗体滴度随免疫次数增加而升高，且HPV6b L1/Ct MOMP 168组小鼠产生的抗体滴度明显高于Ct MOMP 168 组（P<0.05）.结果提示，分子佐剂HPV6b L1 与Ct MOMP多表位基因融合能够显著增强Ct MOMP多表位DNA 疫苗的体液免疫应答.

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中华根瘤菌NP1氨单加氧酶基因的克隆与功能鉴定

刘钰莹,邱枫,宋琴,窦鑫,许雷

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 768-775.

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以中华根瘤菌NP1 （Sinorhizobium sp. NP1）为原始菌株，通过同源克隆与Tail-PCR方法，获得1 089 bp的氨单加氧酶基因(amo)全长序列.该基因编码362个氨基酸，其二级结构与Sinorhizobium meliloti 1021 AMO的二级结构相似，该蛋白有9个跨膜区段.以自杀穿梭质粒pJQ200SK为原始载体，构建NP1 amo基因敲除质粒pJQ200SK-amo-Tc.采用三亲本杂交的方法将该质粒转入原始菌株NP1中，获得amo基因敲除菌株NP1∷amo.通过本贝洛氏（Berthelot）法对氨氮进行测定，发现NP1∷amo的脱氮效率比原始菌株NP1下降约35%.该结果表明,本实验中所克隆的氨单加氧酶基因为脱氮关键酶基因.

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基于PLP-LDR-HRCA策略进行微量DNA分析——rs17750303位点分型

陈宝生,张振,王保捷

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(8): 776-782.

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增强PCR和全基因组扩增是当前微量DNA分析的主要策略，但是，由于DNA模板量过少，受随机效应影响显著，往往不能得到可靠的DNA分型结果.本文提出一种新的检验策略：PLP-LDR-HRCA，尝试微量DNA检材的SNPs分型研究.选择rs17750303位点，并设计等位基因特异性锁式探针，采用连接酶检测反应来识别等位基因，而后采用超分支滚环扩增反应来放大检测信号.结果表明，PLP-LDR-HRCA反应特异性好，灵敏度高，能够直接鉴别微量基因组DNA模板中待测SNP位点，rs17750303纯合型样品（AA型或CC型）和杂合型样品（AC型）准确分型所需最少模板量分别为20 pg 和30 pg.对于增强PCR和全基因组扩增技术不能有效检验的微量检材，PLP-LDR-PCR策略独具优势，可能具有较大的开发价值.

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