中国生物化学与分子生物学报

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郑婕, 董韬, 冯永君*

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 587-595.

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兼职功能蛋白（moonlighting proteins）是指一类具有两种或两种以上功能的蛋白，且这些功能间没有直接相关性，此类蛋白能够通过多种形式转换其功能. 随着科学研究的深入，越来越多的已知功能的蛋白被发现具有新型兼职功能且兼职功能对生物体的意义绝不亚于其所谓本职功能，兼职功能蛋白的发现大大拓展了基因、蛋白质与生理功能一一对应的传统观念；特别是最近研究发现一类叫做无固有结构蛋白（intrinsically unstructured proteins，IUPs）表现出多功能性，向“蛋白质的功能等视于确定的三维结构”的经典定律发起了挑战. 本文对兼职功能蛋白的功能转换机制、进化历程、研究方法等方面的最新研究进展进行了综述，同时对兼职功能蛋白给生命科学研究带来的新思路和新挑战进行了深入讨论.

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转录辅助活化因子PGC-1家族的生物学特性及功能

吉红, 卢荣华, 常志光, 杨公社

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 596-603.

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过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1（PGC-1）家族共有PGC-1α，PGC-1β和PRC（PGC-1相关因子）3个成员,该家族在机体诸多代谢过程中发挥重要作用,包括调节机体适应性产热、线粒体的生成、脂质代谢、调节血糖平衡及葡萄糖转运、激活糖异生的关键酶和影响肌纤维类型的转换等．成员间功能也存在差异，PGC-1α 的上述功能表现的较为明显，而PGC-1β在调节脂肪细胞分化及脂类代谢中具有独特的功能，PRC则仅发现其在调节线粒体的生物合成及细胞增殖中有作用．研究认为，通过调节PGC-1家族的生理功能，可治疗肥胖及糖尿病等疾病，尤其PGC-1β可作为改善机体胰岛素抵抗的新药物靶点．本文就PGC-1家族的特征、生理功能及相互作用研究进行简要综述．

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骨髓间充质干细胞成肌和成脂分化的调控

黄月琴, 王松波

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 604-610.

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骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于骨髓基质的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞.因其具有容易获取、体外扩增方便迅速、移植排斥反应较弱等优点而成为临床应用的理想细胞模型. 骨髓间充质干细胞向成肌和成脂的分化对动物机体内肌肉和脂肪的组成具有直接影响，因而与肉品质及人类健康息息相关.本文综述了骨髓间充质干细胞定向分化为骨骼肌细胞和脂肪细胞的过程及其调控机制，并重点分析了关键调控因子PRDM16(PR domain-containing 16)和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）在骨髓间充质干细胞成肌和成脂分化中的作用.

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CC趋化因子配体2与肝疾病

邢雪琨, 徐存拴, 张富春

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 611-616.

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近年来趋化因子2（chemokine2，CCL2）在肝脏疾病发病机制中的作用越来越受到重视.大量研究表明CCL2在各种肝损伤中表达上调.通过应用CCL2抑制剂、CCL2缺陷动物模型等方法使CCL2与单核细胞往炎症部位迁移的关系得以证实.高表达的CCL2能激活肝星形细胞参与肝纤维化甚至肝硬化的形成.由于CCL2有促进肿瘤转移和血管生成的作用，其与肿瘤的关系也成为研究的热点.本文将阐述CCL2与病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌的研究进展.

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GWAS在2型糖尿病相关基因研究中的应用

杨雨晗, 李亚

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 617-621.

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2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）是一种常见的复杂疾病，其发病受到遗传和环境因素的共同作用. 全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)是一种可在全基因组范围筛查疾病相关的序列变异的新型群体关联研究方法.近年来，采用GWAS以及在此基础上展开的meta分析，已分别在TCF7L2、HHEX-IDE、SLC30A8、CDKAL1、CDKN2A-CDKN2B、IGF2BP2、NOTCH2、CDC123-CAMK1D、 ADAMTS9、THADA、TSPAN8-LGR5、JAZF1等12个基因区域鉴定出多个T2D相关的多态位点. 已有的研究提示,上述多个基因可能在胰岛β细胞发育和功能维持方面扮演着重要角色.本文集中介绍了GWAS的原理及其在T2D研究中的优势；回顾了GWAS在T2D研究中的主要发现；并对运用GWAS在T2D研究中尚需解决的问题进行了总结和展望.

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ΦC31位点特异性整合酶DNA结合功能域的鉴定

辛清婷, 马金芳, 王玮, 刘绍辉, 李荣秀, 朱焕章

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 622-629.

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DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键，而对酶DNA结合结构域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法. 为了鉴定ΦC31位点特异性整合酶的DNA结合功能域，本研究依据对ΦC31整合酶的二级结构预测，利用PCR和克隆技术在pET22b原核表达载体上构建ΦC31整合酶重组截短突变体表达质粒，将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3) 菌株扩大培养并用 IPTG诱导融合蛋白的表达，经镍柱纯化获得了纯度达90%以上的重组蛋白，分子量也与预期大小一致， Western blotting 确定了重组蛋白的特异性. 凝胶迁移滞后实验显示出野生型以及截短突变体蛋白ΦC311-528、ΦC311-472、ΦC311-413能与细菌附着位点DNA attB和噬菌体附着位点DNA attP结合的条带，而截短突变体ΦC311-353、ΦC311-279、ΦC311-120观察不到相应的结合条带. 6个截短突变体质粒在体内重组活性蓝白斑实验中均表现为蓝斑，显示出皆丧失体内重组活性. 本研究证实ΦC31整合酶半胱氨酸富集域（第353-413位氨基酸）具有DNA结合的功能，而C末端缬氨酸富集区（第528-613位氨基酸）也与其重组活性相关. 这为进一步了解ΦC31整合酶的结构与功能，最终引导其结构进化，提高其特异性和整合效率奠定了基础.

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慢病毒介导RNA干扰SOCS3基因在猪前体脂肪细胞和成肌细胞中的表达

徐成权, 杨双娟, 吴江维, 杨公社

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 630-636.

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构建细胞信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)慢病毒干扰载体，获得有感染性的病毒颗粒，侵染猪前体脂肪细胞和成肌细胞，并检测其对前体脂肪细胞的干扰效率.首先设计合成3对针对目的基因SOCS3的siRNA序列，退火后连接于LentiH1上，测序验证后，与包装质粒△8.9和vsv-g共转染到293T细胞中进行包装和浓缩，纯化后测定病毒滴度,然后感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞.重组慢病毒载体LentiH1-siRNA经酶切和测序鉴定正确，病毒滴度为3×107 tu/ml，感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞后，可见报告基因GFP的表达；RT-PCR和Western bloting检测到前体脂肪细胞中SOCS3的表达显著下调, 其中LentiH1-siRNA3介导对SOCS3基因mRNA和蛋白的干扰效率分别达53%和71%.本研究成功构建了猪SOCS3慢病毒干扰载体，感染猪前体脂肪细胞能稳定沉默SOCS3蛋白的表达，为深入研究SOCS3的功能奠定了基础.

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Cwc15 家族同源基因mED1在小鼠早期胚胎发育中的表达模式

端家忠, 张靖溥, 朱少侠, 李勇

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 637-642.

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RNA选择性剪接机制涉及基因表达模式的多样性、胚胎发育的调控和疾病的发展与转归．Cwf15/Cwc15蛋白家族与RNA剪接体的功能相关，其基因序列在很多物种之间是十分保守的．然而，在哺乳类，Cwf15/Cwc15基因的表达模式和生物学功能研究至今未见实验性研究报道．本文首次报道了Cwc15家族同源基因mED1在小鼠早期胚胎发育过程中的表达规律．RT-PCR结果表明，mED1基因的转录水平从小鼠桑葚胚到器官形成期呈逐渐上升趋势；整体原位杂交结果显示mED1基因主要在小鼠6.5-dpc胚胎的ICM、8.5-dpc胚胎的神经褶衍生物和10.5-dpc的头部、鳃弓和体节中表达．说明mED1基因参与了小鼠胚胎的早期发育．此外，GFP-融合蛋白的亚细胞定位实验表明，mED1蛋白具有核定位的功能（剪接体蛋白的必要特性），验证了其核定位序列（NLS）的预测．本文是关于Cwc15家族基因的首次实验研究报道．

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小鼠胚胎干细胞分化心肌细胞血管紧张素II 1型和2型受体的表达特征

崔京京, 杨洪涛, 贾竹青, 阎丽辉, 张晨光, 杨黄恬, 周春燕, 张永珍

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 643-650.

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胚胎干细胞（ESC）具有无限增殖和分化为体内3个胚层来源的各种类型组织细胞的潜能，经过体外诱导能够分化为心肌细胞，亦称为胚胎干细胞分化心肌细胞（ESCM）．本研究探讨了ESC诱导分化心肌细胞过程中血管紧张素Ⅱ受体（ATR）的亚型 AT1R和AT2R的表达特征． 10-4 mol/L维生素C体外诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为自发搏动的心肌细胞，用免疫荧光法检测分化后的细胞表达心肌细胞特异性标志物α辅肌动蛋白．小鼠胚胎干细胞在诱导分化为心肌细胞以后, 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)方法检测到ESCM表达AT1R，并且呈时间依赖性逐渐增加的特点，在第14 d达到高峰．Western印记法检测AT1R表达特征与RT-PCR结果相符．Western印记法的结果显示，血管紧张素Ⅱ (10-6 mol/L)可作为AT1R激动剂激活AT1R，并使其下游的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)磷酸化水平上调，预孵育AT1R抑制剂Losartan (10-6 mol/L), 此作用被抑制．RT-PCR方法显示，与新生小鼠心室肌细胞相比，ESCM的AT2R表达水平较低．

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低盐度可诱导鲈鱼胞浆型PEPCK基因表达

钱云霞, 杨孙孝, 童丽娟, 宋娟娟, 钱伦

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 651-658.

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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径的第1个限速酶．本研究用SMART RACE技术从鲈鱼肝脏中分离克隆了PEPCK基因的全长cDNA序列．该基因全长2 215 bp，包含1个123 bp的5′非翻译区和217 bp的3′非翻译区，开放阅读框为1 875 bp，编码1个由624个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白理论分子量为69.1 kD，等电点为5.87．氨基酸序列分析表明，与其它动物的胞浆型PEPCK 相似性很高，与黑鲷为94.2 %，与大西洋鲑为86.4%，与人为75.9%，而与该鱼线粒体型PEPCK氨基酸同源性只有70.6%．系统发育分析显示，该蛋白首先与其它动物的cPEPCK聚成一支，然后再与鱼类的mPEPCK成簇，认为该PEPCK属于胞浆型．同时用RT-PCR分析了PEPCK基因在10个组织中的表达，结果表明只有在肝脏、消化道和肾脏有较高的表达．将鲈鱼从盐度为25的海水转入盐度为12的海水48 h后，肝脏和肾脏的PEPCK基因表达有增加．实验结果表明，本实验克隆的为鲈鱼胞浆型PEPCK, 低盐度可诱导其表达．

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MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS液质联用分析大鼠脑脉络丛的多肽组

杨帆, 敬海明, 张拓, 原剑, 赵超英, 马玲, 甄蓓, 李国君, 魏开华

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 659-671.

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脉络丛（choroid plexus, CP）位于血液与脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)之间，不仅是CSF的重要来源，而且是构成血液-脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier, BCB)的组织基础. CP参与脑组织中一些血源性多肽的输送以及自身多肽合成的生理过程，在维持脑微环境动态平衡和调节中枢神经系统的正常功能方面起到非常重要的作用.本研究分别运用MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS液质联用系统分析了成年SD大鼠血液-脑脊液屏障（即脉络丛组织）中的多肽组.共鉴定到163个多肽（P<0.001）,这些多肽为69种蛋白质的降解肽段，其中ATP合酶(ATP synthase)，细胞色素c(cytochrome c)，血红蛋白(hemoglobin)，NADH-辅酶Q氧化还原酶(NADH-ubiquinone oxidoreductase)，β珠蛋白(beta-globin)这5种蛋白质的肽段数占总肽段数的50%以上，并且部分多肽序列相似度高，类似其前体蛋白的逐步降解片段，而这些前体蛋白质的分子量多数在10 kD至20 kD之间.上述研究结果为SD大鼠脉络丛组织的生理功能研究及组织多肽组学的研究方法提供了有价值的科学资料.

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密闭培养条件下小鼠早期胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化状态分析

陈海燕, 马保华, 刘洁, 赵晓娥, 曹宇静, 雷晓华

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 672-677.

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胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件.本文主要研究密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育过程中印迹基因Igf2/H19的印迹调控区(ICR)甲基化水平的影响.应用亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析小鼠2-细胞胚胎在密闭条件下分别培养24 h、48 h和72 h后,相对应的发育阶段胚胎Igf2/H19的 ICR甲基化水平，以常规体外培养和体内发育的各阶段胚胎为对照.结果显示,密闭培养条件下，小鼠8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚的Igf2/H19的 ICR甲基化水平都低于常规体外培养的结果，且更明显低于体内发育的结果；同时发现,小鼠8-细胞胚胎密闭培养时，Igf2/H19的 ICR甲基化水平最低.由此可见，密闭培养会引起小鼠植入前各发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平降低，并证明Igf2/H19的ICR甲基化水平可以作为监测哺乳动物早期胚胎发育状况的分子指标.

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截短的人精子特异性乳酸脱氢酶L178X突变体丧失催化活性

颜水堤, 张朵, 曾健, 富显果, 柯龙凤, 兰风华*

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(7): 678-682.

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精子特异性乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶C4,LDH-C4）是精子能量代谢的关键酶类之一．为了研究前期发现的1个LDH-C4基因突变（L178X）对LDH-C4功能的影响，在已构建的LDH-C4原核表达载体pET-28a(+)-hLDHC的基础上，利用PCR定点诱变技术，制备了L178X突变体的原核表达载体pET- 28a(+)-hLDHC/L178X,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，诱导其表达．对该载体进行限制性酶切表明，插入的LDHC基因cDNA约1 000 bp；序列分析表明,该插入片段读框正确，带L178X突变．SDS-PAGE及免疫印迹显示，携带该载体的菌体可表达分子量约25 kD的蛋白质，后者可被兔抗LDH-C4血清特异识别．乳酸脱氢酶（LDH）活性测定及活性染色表明,所表达的产物没有LDH活性.本研究成功进行了LDH-C4的 1个突变体的原核表达，为研究LDHC基因突变对LDH-C4功能以及男性生育的影响奠定了基础.

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