中国生物化学与分子生物学报

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迟毓婧, 李晶, 管又飞, 杨吉春*

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 879-885.

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磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）作为酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的主要下游分子，通过催化产生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）并激活Akt、糖原合酶激酶-3（GSK-3）、Forkhead转录因子FoxO1、mTOR（mammalian target of rapamycin）等下游分子，将多种生长因子及细胞因子的信号传递到细胞内，从而对细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种生物过程起重要的调节作用. PTEN (phosphatase and tensin homologue)是PI3K信号通路的重要负调节因子. 本文将对PI3K-Akt信号通路在糖代谢中的作用予以简要综述

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TAR RNA结合蛋白在HIV-1感染中的作用

林晓燕, 杨怡姝*, 曾毅

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 886-891.

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TAR RNA结合蛋白是细胞中双链RNA结合蛋白家族成员之一.它可以结合HIV-1 TAR RNA，并与Tat协同作用激活LTR表达，进而促进病毒的转录与翻译.TRBP也是将干扰素抗病毒通路与RNA干扰免疫通路相连的一种细胞蛋白.在干扰素诱生的PKR反应中，TRBP通过直接抑制PKR的自磷酸化、与PKR竞争通用的RNA底物或与PACT形成异源二聚体等机制抑制细胞内的PKR反应，从而降低了PKR介导的对病毒表达的抑制作用.TRBP与Dicer和Ago2等组成的RNA诱导沉默复合体，在RNA干扰中发挥着关键作用并调控随后的序列特异性降解.在HIV-1感染中，TRBP更倾向于促进病毒的表达与复制，因此TRBP也成为控制HIV-1感染的新靶点.

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转录因子与microRNA在基因表达调控中的功能联系及差异

闫晓红, 王宁*

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 892-897.

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转录因子和微RNA （microRNA）是最大的两类反式作用因子，它们是基因表达调控的重要调控因子.它们协调发挥调控作用，精细调控基因的表达，在细胞分化和动物生长发育过程中发挥重要的作用.随着对转录因子和microRNA研究的深入，人们发现转录因子和microRNA在基因表达调控网络中关系紧密，它们的分子作用机制有许多相似之处，两者都通过各自的顺式作用元件调控基因表达，且作用的方式类似.但转录因子和microRNA也存在不同之处，转录因子既可以激活基因表达，也可抑制基因表达，而microRNA主要是抑制基因表达.另外，转录因子调控区的复杂性一般高于microRNA的调控区域.本文综述了转录因子和microRNA的异同点，并提出了未来转录因子和microRNA的研究方向.

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与2型糖尿病相关糖复合物中糖链结构变化

王培培, 于广利*, 郝杰杰

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 898-902.

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2型糖尿病是一种全球性严重危害人类健康的慢性代谢性疾病.在2型糖尿病患者和动物的血液、尿液及受损组织中,糖链的结构均发生了不同程度的变化. 本文对近年来有关2型糖尿病发生、发展过程中糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂中糖链的结构变化进行综述，为2型糖尿病的诊断及其相关药物的研发提供有用的参考.

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DUF784基因在花粉管导向中的功能分析

陈艳红1）*, 杜菊萍1）, 刘建胜1）, 祝燕飞1）, 邹明学2）

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 903-910.

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花粉管导向是高等植物完成双受精过程的重要环节，是受多重信号调控的复杂过程.最近的研究揭示,配子体阶段花粉管导向的诱导信号分子是一类具多态性的富含半胱氨酸的防卫素类似蛋白，如来自玉米的ZmEA1和蓝猪耳草中的LUREs在吸引花粉管进入珠孔起重要作用. 但是拟南芥及其它植物中此类信号未知.转录组学分析表明,一组DUF784基因可能在花粉管导向中起到重要作用.通过RNAi技术降低一组DUF784基因的表达，分析发现在RNAi转基因植株中，出现胚珠败育现象，花粉管导向出现异常，一部分花粉管不能进入珠孔.另外,用MYB98基因的启动子携带1个DUF基因的编码区，然后转化ccg突变体，发现ccg转基因株系中胚胎败育率下降，即DUF基因能部分互补ccg突变体的表型；从这两方面证实了DUF784基因在花粉管定向导入过程中的作用.

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人胚肺二倍体成纤维细胞衰老过程中Wnt信号抑制因子DKK4的表达

崔明, 李国栋, 童坦君*

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 911-917.

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Dickkopf家族蛋白DKK4是经典Wnt信号通路的抑制因子.为研究其在人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）复制性衰老过程中的作用机制及生理学意义，使用Wnt/β-联蛋白通路的激活剂氯化锂(LiCl）和抑制剂DKK1作用于2BS，同时利用免疫荧光技术分析衰老过程中细胞因子的定位.结果显示,在2BS复制性衰老的过程中，DKK4表达水平下降，而这种下降是β-联蛋白/TCF介导完成的.而在衰老过程或较高的过氧化物水平下，细胞核内转录因子FoxO4增多.由此得出结论：在衰老过程中，β-联蛋白/TCF下游靶基因DKK4 表达下调，降低了对经典Wnt通路的抑制，使胞内β-联蛋白处于较高水平.较高水平的β-联蛋白在高过氧化物的微环境中，与FOXO家族转录因子相互作用，激活其下游靶基因，促进了衰老的发生发展.

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有丝分裂诱导基因6（MIG-6）可诱导人成纤维细胞发生提前衰老

赵林, 卓德祥, 毛泽斌*

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 918-922.

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年老细胞许多基因表达发生变化,其中有些基因的表达可以诱导成纤维细胞早衰. 癌基因诱导的衰老（oncogene-induced senescence，OIS）是由一些连续癌症基因的信号，以阻止细胞增殖造成的反应. 有丝分裂诱导基因6 (mitogen-inducible gene-6,MIG-6)是一个抑癌基因, 是ErbB RTK 通路的负调控因子，抑制肿瘤细胞增殖.本文以人胚肺二倍体成纤维细胞为对象，研究MIG-6蛋白在细胞衰老中的作用. 通过Western印迹发现，在老年细胞中MIG-6表达升高. 利用逆转录病毒载体将MIG-6基因转入年轻的人胚肺二倍体成纤维细胞中，通过Western印迹方法检测是否过表达MIG-6，然后通过SA-β-gal染色检测其阳性率,发现转染MIG-6基因后的成纤维细胞SA-β-gal染色率明显高于对照组，生长缓慢.实验结果证实,MIG-6蛋白可以诱导人二倍体成纤维细胞提前衰老.

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羊布鲁氏菌非编码小RNA分子BSR-2的预测与鉴定

王同坤1), 王立贵2), 陈泽良2), 杜昕颖2), 汪舟佳2), 黄留玉2), 刘波1)*, 王玉飞2)

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 923-929.

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利用RT-PCR和RACE等方法对生物信息学预测的羊布鲁氏菌非编码小RNA（small non-coding RNA，sRNA）BSR-2进行了实验鉴定，并通过分析BSR-2在胞内生存缺陷株中的转录情况以及预测BSR-2的靶标基因对BSR-2的功能进行初步探讨．RT-PCR结果表明，BSR-2在羊布鲁氏菌的总RNA中存在转录本，而且在不同的应激条件下转录水平不同．RACE结果表明,BSR-2长224 nt，位于Ⅱ号染色体的BMEII0742和BMEII0743之间的基因间区．进一步的实验结果表明，BSR-2可能与布鲁氏菌的胞内生存能力相关．

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抗TNF-α单链抗体噬菌体展示文库的建立和鉴定

杨涛1), 柴蔚然2), 杨利军1), 程牛亮1), 解军1), 牛勃1)*

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 930-936.

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应用噬菌体展示技术构建抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)单链抗体(single chain Fv, scFv)文库，从中筛选抗TNF-α scFv并进行鉴定. 利用重组人TNF-α (rhTNF- α)免疫小鼠，分别扩增小鼠VH和VL基因，经重叠延伸反应将VH和VL基因拼接成scFv基因，以SfiⅠ/NotⅠ位点定向插入pCANTAB 5E噬菌粒载体，转化E.coli TG1，构建了库容为4.6×108的抗TNF-α单链抗体库. 对抗体库进行3轮富集筛选后，ELISA检测阳性克隆的抗原特异性，取1株阳性克隆进行测序分析.结果表明，抗TNF-α scFv基因序列长774 bp，编码258个氨基酸. 将此阳性克隆转化E.coli HB2151，IPTG诱导可溶性scFv的表达，经SDS-PAGE和Western 印迹分析，scFv的分子量约为28 kD. 经亲和纯化后的scFv可与rhTNF-α结合，并可中和由rhTNF-α引起的L929细胞毒性. 本文利用噬菌体抗体库筛选到了高亲和力的抗TNF-α scFv，为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础.

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HCV内部核糖体进入位点（IRES）结构域Ⅲ中连接点的位置对其三级结构形成的影响

宁俊红1)*, 孙文夏2）

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 937-942.

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丙型肝炎病毒（HCV）结构含有一个内部核糖体进入位点（IRES）；该位点是一段高度保守序列，坐落于mRNA的5′-非翻译区域（5′-UTR）.目前, 对IRES的三级结构及相关功能研究较少.本实验通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射显影技术，研究在不同离子浓度、不同RNA浓度条件下，IRES结构域Ⅲ的连接点（junction）在不同位置时对结构域Ⅲ形成的影响，以及不同的结构域Ⅱ与结构域Ⅲ的相互作用关系. 实验结果表明，HCV的IRES结构域Ⅲ连接点位置对结构域Ⅲ的形成至关重要，连接点位置不同，则结构域Ⅲ形成的结构不同. 因此，在HCV的疫苗和相关药物设计中，可以针对结构域Ⅲ连接点进行研究，使之成为疫苗或药物作用靶点.

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过表达Snail增强肺癌细胞A549的体外侵袭能力

李洪利1), 尹崇高2), 李文通3)*, 孙永红4), 钟延美5)

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 943-948.

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用锌指转录因子Snail诱导肺癌细胞A549发生上皮细胞-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），检测肺癌发生EMT后细胞侵袭能力的变化，为临床筛选分子靶向药物提供依据．构建pcDNA3.1-snail载体，用pcDNA3.1-snail及空pcDNA3.1载体转染肺癌A549细胞后,进行G418筛选；光镜观察培养后细胞形态学的改变、免疫细胞化学与免疫荧光检测细胞表达E-钙黏着蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）的改变，Western印迹检测细胞中E-钙黏着蛋白和波形蛋白的改变，Transwell侵袭小室法进行细胞体外侵袭能力检测．采用pcDNA3.1-snail转染细胞后，A549细胞变得细长，细胞融合度降低．免疫细胞化学、免疫荧光、Western印迹结果显示,E-钙黏着蛋白表达降低，波形蛋白表达升高；transwell侵袭小室法结果显示,过表达Snail的A549细胞穿透matrigel胶的细胞数明显增多．结果提示，Snail能有效诱导肺癌发生EMT，并且能增强肺癌的体外侵袭能力．

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磷脂酶D对ParA1诱导的烟草的细胞死亡和过氧化氢及莨菪亭积累的影响

魏芳芳, 王蕾, 梁元存,* 王玉军

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 949-954.

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利用药理学方法，研究了烟草寄生疫霉（Phytophthora parasitica）分泌的蛋白激发子ParA1诱导烟草悬浮细胞后，磷脂酶D对ParA1诱导的过敏细胞死亡和其它防卫反应的影响.用100 nmol/L ParA1处理烟草悬浮细胞后能够诱导细胞死亡、过氧化氢和莨菪亭的积累.磷脂酶D抑制剂正丁醇能够抑制ParA1诱导的这些防卫反应，仲丁醇所起的抑制作用比正丁醇小，正丁醇和仲丁醇产生的抑制效果具有浓度依赖效应.而叔丁醇不能抑制ParA1诱导的这些反应.结果表明，磷脂酶D 参与了ParA1诱导烟草悬浮细胞的信号传导过程.

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人A4GNT基因5′调控区的结构和功能分析

张牧霞*, 张瑶, 赵萌, 郭晓华, 谷玮玮

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 953-961.

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为探索人α1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶（α1,4-N-acetylglucosaminyltransferase, A4GNT)基因表达的调控机制，应用5′cDNA末端快速扩增法和引物延伸法确定了A4GNT基因的转录起始位点.在生物信息学分析的基础上,构建了系列5′缺失荧光素酶报告基因载体和定点突变载体.瞬时转染胃癌细胞MKN45和AGS.荧光素酶活性分析表明,A4GNT基因转录的核心启动子在-141 bp～+116 bp区域，该区域缺乏典型的TATA盒，但含有CCAAT盒、Sp1和ETS-1等转录因子潜在结合位点. 突变分析显示,-136 bp～-131 bp的Sp1结合位点及-93 bp～-89 bp正向CCAAT序列对A4GNT启动子转录激活至关重要. 电泳迁移率变动分析表明,这两个顺式作用元件能够与转录因子Sp1和NF-Y结合.另外,在-1 464 bp～-771 bp 区域可能含有与基因的特异性表达相关的调控元件.

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小鼠骨髓细胞中p16 和Ralb基因启动区CpG岛的甲基化位点分析

田金凤, 曹培, 于秀远, 彭春华, 杨新军, 闫洪涛*

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 962-967.

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抑癌基因p16和白血病致癌因子Ralb与白血病的发生密切相关，其启动子区CpG岛的甲基化对基因表达具有重要作用. 本文旨在分析p16、Ralb基因启动子区CpG岛甲基化位点信息，并比较这两个基因在小鼠骨髓细胞和原代培养的骨髓细胞中甲基化状态的差异.运用“MethPrimer”软件预测p16、Ralb基因启动子区的CpG岛，设计甲基化特异性引物.利用重亚硫酸盐测序法（BSP）检测甲基化位点信息. 结果显示,p16有1个CpG岛，岛上21个CpG位点全部未发生甲基化；Ralb有2个CpG岛，CpG岛1上的5个CpG位点全部呈甲基化状态，而CpG岛2上的17个CpG位点全部呈非甲基化状态，且小鼠骨髓细胞和体外原代培养的骨髓细胞中两基因的甲基化状态一致. 表明p16、Ralb基因甲基化状态未受外界培养条件的影响而改变，提示在与两基因甲基化相关的研究中体外试验可替代体内试验.

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实时荧光PCR结果的四维杂交的核酸技术分析

窦亚玲1）*, 倪安平1）, 高奔2）, 李倩1）, 钟敏1）, 徐英春1）

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(10): 968-973.

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本研究采用四维杂交试剂，测定PCR产物的特征熔点温度（temperature of melting point，Tmp），对实时荧光定量PCR所获得阳性信号（特异性的或非特异性的）的结果进行分析和确认，以使检测结论更客观.将荧光探针模式的实时荧光PCR检测后的标本再进行熔解曲线温度扫描，然后在4 ℃冰箱冷却5 min，向反应管加入1μL四维杂交液，再按照温度扫描程序做熔解曲线实验.结果显示,加四维杂交试剂之后的熔解曲线中信号峰值是收敛的，且信噪比增大.相同扩增产物的Tmp的误差是在±1 ℃之内.实验结果证明,四维杂交试剂对荧光探针模式实时荧光PCR结果可进行更精细的分析和确认.

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