中国生物化学与分子生物学报

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章婷，张志明,赵本华，张智仁，苏艳华

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 195-202.

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机体损伤后通过诱导组织细胞产生复杂而又相互调控的系列反应，来促进损伤组织的再生.不同细胞因子、生长因子及细胞之间的协调平衡对于组织再生的调节非常重要,免疫系统在此过程中起着极其重要的作用. Toll 样受体( Toll-like receptors，TLRs)可识别微生物病原体，在触发机体防御性抗病原微生物免疫反应中发挥着重要作用，是先天免疫系统中必不可少的重要成分，TLRs内源性配体的存在提示TLRs不仅可诱导机体防御性的抗微生物免疫反应，同时还是机体损伤后启动组织再生修复的敏感监测系统. 本文概述了TLRs及其内源性配体，以及TLRs 在诱导损伤后组织再生中的作用. TLR内源性配体及其在组织再生过程中的作用为促进机体损伤组织的再生修复提供了新的思路策略.

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FoxO1转录因子及其翻译后修饰的生物学意义

钟茜,邓宇斌

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 203-208.

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FoxO1转录因子属于Fox家族成员，主要参与细胞凋亡、应激、DNA损伤/修复、肿瘤发生、血管生成和糖代谢等生命过程. PI-3K和Akt信号通路可磷酸化FoxO1，使其由胞核转运至胞质，导致转录活性灭活，从而抑制FoxO1所调控的下游基因表达. FoxO1的乙酰化可削弱FoxO1结合同源DNA序列的能力，同时加强FoxO1的磷酸化，进一步降低其转录活性. 正是由于FoxO1本身的翻译后修饰可调节FoxO1的功能，使得其在肿瘤发生、免疫反应、细胞周期、分化、代谢、应激和凋亡中都起着重要的作用. 本文对FoxO1及其翻译后修饰的生物学意义进行综述.

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无脊椎动物免疫分子多态性

章跃陵，，赵贤亮，严芳,

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 209-214.

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一般认为，非特异性免疫分子由于胚系基因种类有限而不具备多态性.但近年来人们发现,脊椎动物γ/δ T 细胞受体、B1细胞受体、某些固有免疫成分，以及无脊椎动物的某些免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）分子、抗菌肽和模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）等同样具有较高程度的多态性.与特异性免疫分子相似，其多态性形成机制主要为基因组水平的基因重排、单核苷酸多态性、DNA 突变和 mRNA 水平的外显子可变剪接.该多态性的出现可能是无脊椎动物的一种适应性进化，其应为低等生物特异性识别和防御不同病原微生物感染的分子基础. 本文就无脊椎动物免疫分子多态性的最新研究进展及其可能的形成机制与意义进行概述.

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VicRK(YycFG)双组分调节系统

郑继平,，郭桂英,，林丛

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 215-223.

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细菌双组分调节系统，或称之为双组分信号转导系统，是细菌感应外界多变环境，维持自身存活和生长繁衍的重要感应系统.在这些调节系统中，最早发现于枯草芽孢杆菌的VicRK(YycFG)系统因与细胞存活密切相关而倍受关注.该系统存在于少数低G+C含量的革兰氏阳性菌中，包括金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌等致病菌，高度保守. 许多证据显示, VicRK(YycFG)具有调控细胞壁合成与代谢、胞膜完整、细胞分裂、脂类代谢、多糖合成与被膜形成以及细菌毒力等多种功能，参与细胞的生长、分裂与感染.该系统异常可导致细菌生活力严重下降，甚至死亡，因而成为防治该类病原菌的重要靶标.

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PICK1蛋白C端酸性区域对其功能的调节

贾原，黄玉民，刘俊林，石亚伟

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 224-230.

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蛋白激酶C相互作用蛋白1(protein interacting with C kinase 1, PICK1)是调节AMPA (alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) 受体在细胞膜上的数量与分布，引起LTP与LTD 现象的重要蛋白．本文利用基因克隆、荧光光谱以及免疫分析等方法，分析了PICK1蛋白C末端酸性区对BAR结构域与膜脂结合能力以及PICK1分子内BAR (Bin/amphiphysin/RVS)结构域与PDZ结构域相互作用的影响，研究了钙离子结合C末端酸性区后对上述相互作用的调节．结果显示,C末端酸性区的存在使BAR结构域与膜脂的结合能力减弱大约10倍，但PICK1分子内的BAR与PDZ结构域的相互作用与不含C末端的酸性区相比增强了大约4倍．另一方面，C末端酸性区的存在，伴随钙离子浓度的提高，有助于增强BAR与膜脂的结合，却削弱了PDZ 和BAR结构域的作用.当钙离子浓度增加到500 μmol/L时，BARC的脂质结合能力以及和PDZ的亲和力与不含酸性区相当．

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流式细胞分析测定猪外周血单个核细胞Gal α 1,3 Gal水平

陈苹,周春燕，马康涛

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 231-235.

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在考虑以猪器官作为供体对人进行异种器官移植时，α 1,3 半乳糖被认为是引起超急性免疫排斥的主要异种抗原.人们建立了各种方法以降低猪α 1,3 半乳糖水平，但是也有可能筛选得到在自然情况下α 1,3 半乳糖表达水平比较低的猪.为了研究在正常猪单个核细胞中α 1,3 半乳糖浓度分布的差异，利用鸡免疫球蛋白Y（ck-IgY）抗体通过流式细胞分析对正常猪的α 1,3 半乳糖水平的差异进行检测.取3～8周龄猪的全血，用肝素抗凝处理后经密度梯度离心获取外周血单个核细胞(PBMCs)，与FITC标记的ck-IgY(10 μg/ml）孵育，经流式细胞仪检测α 1,3 半乳糖水平.结果显示,相同周龄猪的α 1,3 半乳糖水平可有0.4～2.6倍差异，同一猪的水平在不同周龄有1.3～5.6倍差异.ck-IgY的特异性由棉籽糖和α 1,3半乳二糖测定，棉籽糖(100 μmol/L)可抑制70% ck-IgY结合，而α 1,3半乳二糖(6.25 μmol/L)可完全取消ck-IgY的结合，说明ck-IgY与猪单个核细胞是特异性结合.上述发现说明,ck-IgY是检测猪单个核细胞表面α 1,3 半乳糖的特异试剂，不同猪或是同一猪在不同时间的α 1,3 半乳糖水平有着明显的差异.

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过表达Runx2促进C2C12细胞成骨分化

李萍,余守和,陈迪,高忠平,申健,时宿妹,孙奋勇

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 236-242.

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利用Tet-on(Tetracycline-on)基因表达系统,通过强力霉素(doxycycline,DOX)诱导Runx2基因在C2C12细胞中的表达,探究Runx2促成骨分化功能,为其分子机制的研究提供一个理想的实验平台.先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-Flag-Runx2转染入C2C12细胞,并用G418和潮霉素分别进行2轮筛选,运用实时荧光定量PCR选择对强力霉素诱导敏感的细胞克隆.用不同浓度DOX诱导C2C12/Tet/pTRE-Flag-Runx2细胞,蛋白免疫印迹检测Runx2的表达,确定DOX的最佳诱导浓度与时间,并检测C2C12细胞的成骨分化能力.结果表明,诱导细胞最佳DOX浓度为10 μg/ml;最佳诱导时间为12 h;诱导后Runx2基因高表达,C2C12细胞向成骨方向分化(P<0.05).成功建立Tet调控Runx2基因表达C2C12细胞系,为进一步研究Runx2基因功能分子机制提供理想的细胞模型.

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N末端亲和标签可增进人硫氧还蛋白-1对氧化剂的敏感性

翟光磊,钟良玮

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 243-253.

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人细胞质硫氧还蛋白(hTrx1)在抗氧化和氧化还原调控中起重要作用.如果静脉注射重组hTrx1, 动物抗氧化能力将增高. 近年来, 随着人们对氧化还原调控的关注, hTrx1需求不断增加. 为了快速获得高纯度重组hTrx1, N末端亲和标签, 如组氨酸标签(His-tag)和谷胱甘肽S转移酶标签(GST-tag), 被用于hTrx1亲和纯化.带N末端标签的hTrx1融合蛋白在实验中用的越来越多.但N末端延长是否会影响hTrx1特性尚不清楚. 我们构建与优化了hTrx1原核表达质粒, 在大肠杆菌中高效表达了含天然N末端、带His-tag或带 GST-tag的3种重组hTrx1纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现1条带, 对应的分子量分别为12 kD、17 kD及38 kD. 在无氧化剂存在时, 它们催化胰岛素还原的能力不分仲伯. 当有H2O2存在时, 天然N末端hTrx1通过形成可逆二聚体, 对H2O2表现出较强的耐受性; 而N末端亲和标签有干扰二聚体形成, 使hTrx1对H2O2耐受性降低的作用, 其中GST-tag干扰作用明显大于His-tag. 此外,体内重要的氧化还原对GSH/GSSG, 有增进hTrx1及其还原酶催化NADPH氧化的作用, N末端亲和标签可明显扩大GSH/GSSG的这种作用. 我们分析了N末端亲和标签对hTrx1活性影响的可能机理.

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五指山小型猪单个核细胞表面α Gal抗原表达差异的分析

陈苹，刘羿男，王卫平，周春燕，马康涛

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 254-259.

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利用猪的器官为挽救脏器终末衰竭病人而进行的异种移植是有效救治病人的途径之一.由于猪细胞表面存在的α 1,3 半乳糖会引起超急性免疫排斥反应，导致移植器官最终被移植受体排斥. 除人类和旧大陆猴外,所有哺乳动物细胞表面都有α Gal半乳糖表达，但个体间表达量存在显著差异.为研究近交系五指山小型猪细胞表面 α 1,3 半乳糖表达的个体差异，本实验利用FITC\|isolectin 进行荧光标记，通过流式细胞术以及激光共聚焦分析，对14例5月龄猪样本外周血单个核细胞表面的α 1,3 半乳糖水平进行检测.利用猪肾上皮PK15细胞确定FITC\|isolectin标记的最适浓度为25 ng/μl（细胞标记效率大于85%）. 结果显示，14头猪外周血单个核细胞表面α 1,3 半乳糖的表达差异范围在1.25~2.09倍之间，远低于普通非近交系猪的个体差异.本研究为利用近交系五指山小型猪作为异种器官移植的研究材料提供了基础数据.

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过氧化物酶6在大鼠附睾中的表达及分布

王小强，齐晓伟，程露阳，孙铁成，舒如明，王慧萍,于和鸣

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 260-267.

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通过双向电泳结合质谱技术分离鉴定正常成年大鼠附睾头段与尾段管腔液中的蛋白组成，从附睾头段及尾段管腔液的22个差异蛋白点中鉴定出12个蛋白质. 其中11个蛋白质在不同种属哺乳动物的附睾组织中已有鉴定报道，而过氧化物酶6（peroxiredoxin6, Prdx6）为新发现的存在于附睾头段及尾段管腔液中的体液蛋白. 采用RT-PCR、Western印迹及免疫组化技术，对该蛋白在大鼠附睾中的表达及分布进行了分析. 实验表明，Prdx6与精子的成熟、贮存及保护有一定关系，其具体机制值得进一步深入研究.

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胡椒碱分子键合人血清白蛋白位点的表征

何文英,姚小军,陈光英

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 268-274.

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利用荧光光谱法、紫外光谱法并结合计算机模拟技术在分子水平上研究了胡椒碱与人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）的键合作用. 同步荧光及紫外光谱图表明,胡椒碱对HSA微环境有影响. 位点竞争试验证明,胡椒碱分子键合在HSA的位点Ⅱ区. 通过荧光光谱滴定数据求得不同温度下(300 K，310 K和318 K)药物与蛋白相互作用的结合常数及结合位点数. 分子模拟的结果显示了胡椒碱与HSA的键合区域和键合模式，表明药物与蛋白有较强的键合作用；维持药物与蛋白质的相互作用力主要是疏水作用，兼有氢键（位于氨基酸残基Arg 257， Arg 222及Arg 218位）. 通过实验数据计算得到的热力学参数（ΔH0 与ΔS0 的值分别为－33.11 kJ•5mol-1和－18.90 J•5mol-1•K-1）确定了胡椒碱与HSA分子的相互作用力类型主要为氢键兼范德华力.

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厚壳贻贝粘附蛋白十肽重复序列的表达及应用

蒋臻，刘加鹏，杨丙晔，金利华，张其清,

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 275-282.

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利用PCR扩增 Mcfp-1（M. coruscus foot protein-1）基因的12个十肽重复序列粘附功能片段（Mcfp~1 1~12）并连接到pGEX-4T1表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化的多肽产物经凝血酶处理切除GST标签，获得Mcfp-1 1~12功能肽段，最后用酪氨酸酶对该产物进行修饰.通过材料表面包被、石英晶体微天平（QCM, quartz crystal microbalance）分析、细胞粘附和细胞毒性等实验,研究了该表达产物作为生物粘合剂的粘附特性.结果显示，重组表达产物Mcfp-1 1~12在多种材料表面的包被能力与Cell-TakTM（天然提取的贻贝粘附蛋白混合物）相当，甚至更佳；对细胞的粘附能力与Cell-TakTM相当；用HeLa细胞和293T细胞进行的MTT实验未发现细胞毒性.上述结果表明,Mcfp-1 1~12作为生物医用粘合剂具有潜在应用价值；同时，基因重组技术可以为制备新型海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂提供有效的手段.本研究为临床使用更优质的生物医用粘合剂提供了理论依据.

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FoxO1抑制猪骨骼肌MyHCⅠ的表达

张辉，史新娥，袁媛，杨公社，孙世铎

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 283-289.

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为研究FoxO1与骨骼肌纤维类型之间的关系，本试验以大白猪为实验材料，利用RT\|PCR和Western 印迹技术，检测了FoxO1与肌纤维类型标志基因MyHC Ⅰ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx在特定骨骼肌中的表达规律，以及调控肌纤维类型关键基因Mef2c和NFAT的表达，并用Wortmannin处理原代培养的猪骨骼肌成肌细胞，检测了FoxO1与肌纤维类型相关基因的表达. 结果显示,FoxO1在不同骨骼肌类型中mRNA表达差异不显著(P >0.05)，其蛋白表达与MyHC各亚型显著相关.Wortmannin处理结果显示，在处理的第3和5 d，FoxO1蛋白与MyHCⅡb，MyHCⅡx和NFAT表达显著正相关，而与MyHCⅠ，MyHCⅡa和Mef2c表达显著负相关. 结果表明，FoxO1通过抑制MyHC Ⅰ的表达调控肌纤维类型.

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RNA干扰敲减FucT VII表达抑制人结肠癌细胞HT-29和HUVECs的粘附能力

岳丽玲,，樊丽，牛英才，刘吉成

中国生物化学与分子生物学报. 2010, 26(03): 290-294.

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探讨利用RNA干扰（RNAi）技术抑制岩藻糖基转移酶Ⅶ（FucT Ⅶ）表达对人结肠癌细胞HT-29与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）粘附能力的影响及其机制.本课题构建3对针对FucT Ⅶ基因的RNAi表达载体，并将其转染入人结肠癌细胞HT-29，Western 印迹检测FucT Ⅶ及其下游产物sLeX蛋白的变化；实时PCR 检测FucT Ⅶ mRNA表达的变化；玫瑰红染色法检测RNAi 对HT-29与HUVECs细胞粘附能力的影响.结果显示，3对FucT Ⅶ siRNA表达载体均可有效抑制HT-29细胞FucT Ⅶ mRNA和蛋白表达，以pSilencer 2.0FucT Ⅶ 2最为有效；与空白细胞组比较，转染pSilencer 2.0-FucT Ⅶ的HT-29细胞表面sLeX表达水平明显下降，以pSilencer 2.0-FucT Ⅶ 2最为显著；RNA干扰FucT Ⅶ表达后HT29细胞和HUVEC之间的粘附能力明显受到抑制.研究表明，RNAi靶向沉默HT-29细胞中FucT Ⅶ基因表达可显著降低其下游产物sLeX的合成，进而抑制HT-29细胞与HUVECs的粘附能力.

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