RNAi是由双链RNA(dsRNA)所诱发的转录后水平上的基因沉默.由于对靶基因沉默作用的高度特异性和高效性,因此近年来用于肿瘤性疾病、感染性疾病、遗传性疾病等疾病的基因治疗研究,特别是在抗病毒领域的研究更是成为其应用热点之一.虽然目前RNAi已经较为广泛地应用于动物病毒及各种疾病病毒的基因治疗研究中,但其在应用过程中还有许多亟待解决的问题.本文就RNAi及其在抗病毒领域的应用研究和其存在的问题展开综述.
生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-
蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测，因此能够进行相互作
用动力学的研究.本文系统阐述了BRET的原理和方法,综述了 BRET技术的最新进展，以及该
技术在G蛋白偶联受体（GPCRs）信号转导及药物发现中的应用.
Notch信号分子是多细胞生物发育过程中高度保守的一类十分重要的跨膜信
号受体糖蛋白家族.这一信号途径通过局部细胞间的相互作用而产生对多种不成熟细胞分化
的抑制信号, 精确调控细胞的分化潜能，在细胞发育、增殖、分化中起关键作用,参与造血
、T细胞发育、血管生成等重要生理过程.Notch受体分子上具有多种寡糖链，包括N-聚糖、O-岩藻糖聚糖、O-葡萄糖聚糖等，这些寡糖以及相关糖基转移酶对Notch受体-配体结合以及Notch信号传递功能有重要影响.本文就近年来有关Notch受体糖基化及其对Notch信号传递过程的研究进行综述.
干扰素调节因子-3(interferon regulatory factor-3，IRF-3)是IRF家族中重要
转录因子之一，在调控干扰素(interferon, IFN)基因表达和抗病毒天然免疫反应中具有重要作
用. 最新发现的MITA (mediator of IRF-3 activation, 又称STING/ERIS)蛋白是宿主抗病
毒天然免疫反应中的一种重要调节分子. 病毒侵染时，MITA与IRF-3相互作用，特异性激活
IRF-3，并募集TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1, TBK1）与IFN通路中的线粒体抗
病毒信号蛋白MAVS(mitochondrial anti-viral signaling protein)形成复合物，且MITA可
被TBK1磷酸化，诱导Ⅰ型IFN及IFN刺激基因(interferon stimulate genes, ISG)的表达
，诱发抗病毒天然免疫反应. 同时还发现，泛素连接酶RNF5（ring finger protein 5）可对MITA
发生泛素化修饰从而抑制其对IRF-3活化，实现对宿主抗病毒天然免疫反应负调节作用. 本
室研究发现,严重性急性呼吸系统综合症冠状病毒(severe acute respiratory syndrome co
ronavirus, SARS-CoV）和人类新型冠状病毒（human coronavirus NL63, HCoV-NL63）的
木瓜样蛋白酶（papain-like protease, PLP）利用其特有的去泛素化酶（deubiquitinase,
DUB）活性，通过宿主细胞泛素-蛋白酶体信号系统对IRF-3的泛素化等翻译后修饰进行调节
，从而成为该种病毒逃逸机体抗病毒防御系统主要手段之一.
糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）是调控糖
原代谢的主要激酶.它可以使多种底物蛋白磷酸化，参与调节细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡.最
近研究表明，GSK-3β与帕金森病发生密切相关. 在帕金森病研究模型中，GSK-3β活性增高，诱导多巴胺能神经元凋亡；而GSK-3β活性被抑制时，tau蛋白磷酸化减少，α共核蛋白表达降低，神经元得到保护.因此，GSK-3 β可能成为帕金森病治疗的新靶点.
胰岛素（insulin）与胰岛素样生长因子-1（IGF-1）分别是由胰岛β细胞和肝细胞分泌的
多肽类激素.它们通过结合并激活位于细胞膜上的受体酪氨酸激酶(RTKs)，发挥重要的生理作用.
作为起始信号传导的第一步，胰岛素与IGF-1是如何与各自受体的膜外区域（ectodomain）
结合并进一步激活受体的细胞膜内酪氨酸激酶活性一直属于科学研究的关键基础问题.本文
概述了胰岛素受体家族（IR和IGF-1R）及其配体的结构与功能的特点和关系，并重点介绍
了近年来国内外在胰岛素受体家族复合体结构和功能上的研究手段和取得的突破性进展.
植物金属硫蛋白(metallothioneins, MT)被认为在植物应答重金属胁迫方面发挥了重要作用，但该基因的转录调控机制目前仍不清楚.我们以前的研究初步鉴定出位于-331/-194的水稻MT基因(
ricMT)启动子区对于金属激活ricMT的表达是必需的.为了明确
-331/-194启动子序列在控制ricMT表达中的作用，本课题开展了该序列
与核因子的结合特性研究.从2周龄水稻嫩叶中提取了几乎不含叶绿体污染的细胞核，并制备
了核蛋白用于凝胶阻滞实验，发现核因子能够与-331/-194启动子序列特异
结合.本研究还进一步考察了重金属对核因子结合活性的影响，发现在结合体系中去除重金
属离子，核因子与-331/-194序列的结合能力会丧失，而在结合体系中加入重金属离子，
结合能力则会随着外加的离子浓度提高而增强，证明这种结合确实依赖于重金属.这些证据
结合以前的结果表明,某些金属响应的核因子可能通过结合-331/-194启动子区域来调控
ricMT基因表达.
采用RT-PCR及RACE法，克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)肝胰脏胰蛋白酶(trypsin, Try)、淀粉酶(amylase, Amy)基因 cDNA全序列.结果表明，鳜鱼Try基因cDNA全长为896 bp，其中开放阅读框 (open reading frame,ORF)为744 bp，编码247个氨基酸. 序列同源性分析发现，鳜鱼Try与 斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、
小鼠Try和人TRY氨基酸序列同源性分别为81.4%、75.3%、74.5%和71.4%.鳜鱼Amy
基因cDNA全长为1 647 bp，其中ORF为1 539 bp，编码512个氨基酸.鳜鱼Amy与斑马鱼
、非洲爪蟾、小鼠Amy和人AMY氨基酸序列同源性分别为79.7%、75.4%、71.9%和70.9%. 同时对鳜鱼基因组进行PCR,获得鳜鱼Try、Amy与胃蛋白酶原(pepsinogen, Pep)全基因组DNA序列.序列分析表明，鳜鱼Try基因由4个内含子和5个外显子组成，全长1 362 bp；鳜鱼Amy基因由8个内含子和9个外显子组成，全长4 267 bp；鳜鱼Pep基因由8个内含子和9个外显子组成，全长 4 032 bp，与其它脊椎动物基因结构相似.应用Genome walker方法在鳜鱼克隆得到长度分别为1 189 bp、413 bp和527 bp的Try、Amy和Pep基因的5′侧翼区序列以及1段长为704 bp的Pep 基因3′侧翼区序列，并利用相关软件预测其中具有多个可调节其表达的调控元件.鳜鱼Try、Am
y和Pep基因组全序列的克隆及其序列、结构分析和分子系统进化等的研究，为鱼类消化代谢相关基因的生理功能及表达调控机理进一步研究提供依据.
普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素
类抗生素.目前国外对普那霉素的基因工程研究甚少,国内尚属空白,这阻碍了利用基因工程
的方法来提高普那霉素产量的发展.本文通过对普那霉素产生菌——始旋链霉菌柯斯基因组
文库的构建和菌落原位杂交,筛选出了与普那霉素高产密切相关的新基因所在的柯斯质粒,并通过
酶切分析和Southern杂交确定了该基因所在的酶切片段,对酶切片段进行亚克隆测序,获得了
与天蓝色链霉菌中抗生素调控基因afsk同源新基因的全长克隆,该新基因包含有1个2 127 bp的开放阅读框(ORF),编码708个氨基酸的蛋白,命名为Spy1.对该新基因的生物信息学初步分析表明，该基因编码的是丝/苏氨酸蛋白激酶.
存活蛋白(survivin)是重要的肿瘤相关抗原基因，在肿瘤的发生发展中
起着重要的作用. 除了标准的剪接形式外，它至少还编码2种变异剪接产物—存活蛋白-2B
和存活蛋白-ΔEx3，这2个变异剪接体所编码的蛋白具有不同的生物学功能.为研究这2个变
异剪接体在肿瘤细胞中的相互作用情况，本实验利用增强型青色荧光蛋白（enhanced cyan
fluorescent protein, ECFP）和增强型黄色荧光蛋白（enhanced yellow fluorescent protein, EYFP）分别标记存活蛋白-2B 和存活蛋白-ΔEx3.首先通过激光共聚焦扫描显微镜观
察它们的细胞定位；同时利用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transf
er, FRET）技术研究两者在细胞内的相互作用情况.研究结果表明, 存活蛋白-2B主要分布
在细胞质中，而存活蛋白-ΔEx3则主要分布在细胞核内，少量分布在细胞质中；FRET分析结
果显示,两者仅在细胞质中存在着很弱的相互作用，表明两者很可能是通过某种间接的方式发
挥功能上的相互调节作用.本研究为进一步探讨存活蛋白变异剪接体的生物学功能及相互作用
机制奠定了基础.
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种最常见的神经退行性运动障碍，常染色体显性遗传PD可由LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2)基因突变引起.原核表达和纯化得到LRRK2多肽与GST的融合蛋白，免疫新西兰雄兔，得到了anti-LRRK2兔多克隆抗体. 抗体用途分析实验表明，自制的anti-LRRK2兔多克隆抗体可用于Western 印迹, 免疫组织化学，免疫细胞染色等实验.利用自制的抗体，Western 印迹证明，LRRK2在大鼠脑主要神经解剖学部位均有表达.免疫荧光双染色的结果表明，LRRK2定位于线粒体.本研究对了解LRRK2在PD中的分子生物学功能具有重要的意义.
pUL23是人巨细胞病毒（HCMV）UL23基因编码的皮层蛋白. HCMV皮层蛋白与病毒颗粒的形成、病毒转移、免疫调控等病毒生活过程相关.利用GAL4 酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库，获得与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白分子DNAJB6 ［DnaJ (Hsp40) homolog， subfamily B, member 6］.回复酵母双杂交、体外GST-Pull down和免疫共沉淀试验再次确认两者之间的相互作用.该结果为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.
定量实时PCR是miRNA表达检测的主要方法之一，而利用合适内参对定量实时PCR数据进行校正处理是确保该方法分析准确性的关键.为了确定猪正常组织中miR-103定量实时PCR检测分析的合适内参，首先采用geNorm算法和扩增效率试验对miR-196、U6 snRNA和总RNA 3个候选内参进行了评价；然后以miR-103的绝对定量结果为对照，比较分析了3个候选内参的校正准确性．结果表明,miR-196的表达稳定性和扩增效率均优于U6 snRNA和总RNA；以miR-196为内参的miR-103相对定量结果同绝对定量结果具有较高的一致性，两者均显示miR-103在猪大脑中高丰度表达，在胃、小脑、小肠、心脏、肝脏和胰脏中适度表达，在肺、脾脏和腿肌中轻度表达.这些结果说明，miR-196可作为猪正常组织中miR-103定量实时PCR相对定量分析的一个合适内参.
