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• 2007年, 23卷, 第01期
  刊出日期：2007-01-20

    

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  综述
  研究论文
  
  

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综述
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  应用于乳酸菌的非抗生素抗性选择标记系统

  相丽；刘伟；范丽平；李庆章；姜毓君,

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 1-7.

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  乳酸菌是一类重要的安全型微生物，在免疫载体疫苗开发及食品菌株改良等医疗、食品领域均有广泛的应用.非抗生素抗性选择标记是乳酸菌基因工程菌株构建中必不可少的关键组成部分，也是目前乳酸菌研究的前沿和热点.根据筛选时质粒和受体菌之间的表型关系及特征，主要分为显性选择标记、互补型选择标记、显性/互补型选择标记、双质粒选择标记4大类.其中显性选择标记中的细菌素抗性/免疫性选择标记及互补型选择标记中的糖类选择标记均有较大的发展潜力及应用空间；双质粒选择标记系统构建的筛选过程新颖独特，为整个选择标记系统的发展开辟了新的途径及思路.
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  黑素皮质素受体-2与Ⅰ型家族性糖皮质激素缺乏症

  张志敏,;肖代敏；王慧娟；刘中来

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 8-13.

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  黑素皮质素受体-2（MC2R）具有7个跨膜区（Ⅰ～Ⅶ）、3个胞外环和3个胞内环，人MC2R基因定位于18p11.2；编码区长894 bp，无内含子，在种间和种内具有较高保守性；人MC2R有297个氨基酸残基，推测分子量为33 kD.MC2R主要分布于肾上腺皮质区网状带和束状带，在功能上与腺苷酸环化酶偶联，通过激活依赖环腺苷酸的信号途径来催化类固醇合成；MC2R合成受到各种因子调节，包括其自身配体ACTH、顺式作用元件和反式作用因子等.MC2R基因突变可导致Ⅰ型家族性糖皮质激素缺乏症；迄今为止，在FGD患者中共发现37个MC2R基因编码区突变，突变单独或复合存在降低MC2R活性
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  启动脂肪细胞脂动员过程的新成员ATGL

  张立杰;陈粉粉;杨公社

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 14-19.

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  过去近20年里，激素敏感脂酶（HSL）一直被认为是脂肪细胞脂动员过程中唯一的脂肪水解限速酶，但随着HSL基因敲除鼠的出现，其限速作用受到了质疑.脂肪甘油三酯脂酶（adipose triglyceride lipase，ATGL)是随后发现的启动脂动员的又一个脂肪分解酶.本文就ATGL基因的结构和功能特征、表达及其调控途径和影响因素等方面的研究进展进行了综述，并对今后的研究方向和应用做了展望.
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  窖蛋白-1与乳腺癌

  张洪;邹伟

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 20-26.

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  窖蛋白(caveolin)是分子量为21～24 kD的整合膜蛋白，是胞膜窖(caveolae)的标志性结构分子.目前已克隆并鉴定出窖蛋白基因家族的3个成员：窖蛋白-1，窖蛋白-2和窖蛋白-3.其中窖蛋白-1参与细胞内的许多生命活动，如胆固醇的运输，细胞膜的组装，细胞信号传导，细胞周期调控，细胞转化和肿瘤形成.窖蛋白-1还可以与转录因子相互作用，调节相关基因的表达，抑制肿瘤发生.另外，在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均发现窖蛋白-1的异常;近年来发现，窖蛋白-1与乳腺上皮细胞转化和乳腺癌发生密切相关.本文概括介绍了窖蛋白-1的结构特点、窖蛋白-1介导的信号通路及与乳腺癌发生的关系方面的研究进展.
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  酿酒酵母促分裂原蛋白激酶Hog1p 介导的渗透胁迫反应调控机制

  张小华;刘向勇;于典科;鲍晓明

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 27-32.

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  高渗透性甘油促分裂原激酶信号转导途径（high osmolarity glycerol mitogen activated protein kinase signaling transduction pathway，HOG-MAPK）是调控酿酒酵母对外界高渗透压胁迫环境应答的主要途径，促分裂原蛋白激酶Hog1p（MAPK Hog1p）是其中的关键性作用因子.在高渗透压刺激时，MAPK Hog1p接受信号被特异性激活并进入核内，调控相关胁迫应答基因的表达，并介导该时期细胞周期的阻滞，从而增强细胞对外界不利环境的适应能力.对胁迫条件下酿酒酵母中MAPK Hog1p作用机制的进一步研究，有利于更深入地了解哺乳动物体内逆境激发促分裂原蛋白激酶途径的功能和调控机制.
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  脑缺氧缺血后激活的信号转导通路

  柳华东;刘爽;李卉丽;陈晓钎;于常海

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 33-37.

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  脑缺氧缺血后，神经元和星形胶质细胞中调节细胞存活与死亡的信号转导通路被激活，主要包括：MAPK信号转导通路，PI3-K/Akt信号转导通路，JAK-STAT信号转导通路和转录因子NF-κB参与的信号转导通路等.在缺氧缺血的神经元和星形胶质细胞中，同一信号转导通路的激活表现出不同的时程变化，作用也不尽相同，这可能是这两种细胞对抗缺氧缺血损伤能力差异的基础.深入分析比较信号转导通路的细节差异，将为我们理解损伤/保护机理，寻求保护神经细胞的策略提供实验依据
研究论文
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  ERK信号通道调控大鼠气道平滑肌细胞的增殖与凋亡

  白晶;刘先胜;徐永健;谢敏

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 38-44.

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  为了了解ERK信号通道对正常大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)增殖与凋亡的调控. 通过对正常大鼠ASMCs原代培养，4～7代用于实验，以ERK激动剂表皮生长因子（EGF）和抑制剂PD98059干预ASMCs生长，采用RT-PCR和免疫荧光染色观察ASMCs上ERK mRNA和蛋白的表达，MTT法、^３Ｈ-TdR掺入法检测ASMC增殖，Hoechst染色和Annexin-Ⅴ FITC PI双染色法检测细胞凋亡，Western免疫印迹检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2和procaspase-3蛋白的表达.结果发现ASMCs上存在ERK mRNA和蛋白的表达，与空白对照组比较，PD98059干预后ASMCs的Ａ_４９０值和细胞DNA合成量均减少(Ｐ<0.05)，细胞凋亡指数、早期凋亡细胞百分率均增高(Ｐ<0.05)，ERK1/2、磷酸化ERK1/2表达和ERK活化率均降低, procaspase-3蛋白的表达增高.EGF干预后ASMCs的Ａ_４９０值和细胞DNA合成量均增高(Ｐ<0.05)，细胞凋亡指数、早期凋亡细胞百分率均下降(Ｐ<0.05)，ERK1/2、磷酸化ERK1/2表达和ERK活化率均增高, procaspase-3蛋白的表达降低.P+E组无明显差异(P>0.05).ERK信号通道参与大鼠ASMCs增殖和凋亡的调控，ERK对大鼠ASMCs凋亡的调控与procaspase-3蛋白有关，这一发现将有助于对哮喘ASMCs异常增殖调控机制的深入研究.
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  人肝细胞癌相关基因LAPTM4β启动子结构

  薛世林;张青云;周柔丽

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 45-50.

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  研究在溶酶体相关4次跨膜蛋白(lysosome associated protein transmembrane 4 beta, LAPTM4β) 基因启动子区起重要调控作用的转录因子，为进一步揭示LAPTM4β在肝癌高表达的机制提供理论基础.采用报告基因重组体转染肝癌相关细胞系HepG2细胞和荧光素酶活性测定的方法,确定LAPTM4β的核心启动子区，然后应用凝胶阻滞电泳的方法验证在LAPTM4β核心启动子区起调控作用的转录因子及其特异性.LAPTM4β基因6种不同长度的启动子报告基因重组体，转染肝癌细胞系HepG2.荧光素酶活性比较发现,位于转录起始点上游558 bp的一段DNA（PF3）的启动活性最强，表明在这段序列中存在着重要的转录因子结合位点.通过检索Objectoriented Transcription Factors Database数据库发现,此段启动子序列中含有多种潜在的转录因子结合位点，其中包括1个SP1结合位点.应用凝胶阻滞电泳(electrophoretic mobility shift assay)的方法,证明人肝细胞癌细胞系HepG2及SMMC7721细胞核提取物均能与包含SP1结合位点的寡核苷酸探针结合，并且这种结合可以被相应50倍或者100倍非标记探针竞争抑制.以上结果表明,位于转录起始点上游558 bp的一段DNA（PF3）是LAPTM4β基因的核心启动子；而核心启动子序列中的转录因子SP1结合位点具有与肝癌相关细胞系的细胞核蛋白结合的活性.
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  瘦素(Leptin )对猪前体脂肪细胞分化及PGC-1α和UCPs mRNA表达的影响

  罗桂芬;文旭辉;杨公社

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 51-55.

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  以体外培养的猪前体脂肪细胞为研究对象，分析瘦素(leptin )对前体脂肪细胞分化及能量代谢相关基因PGC-1α和UCPs mRNA表达的影响.油红O染色提取结果显示，10～90nmol/L的leptin对猪前体脂肪细胞甘油三酯合成均无显著影响(P>0.05).RT-PCR检测结果表明，30　nmol/L和100nmol/L leptin可显著促进LPL mRNA表达，处理24 h较12 h 作用效果明显(P<0.05)；两个浓度的leptin对脂肪细胞分化转录因子C/EBPα和PPARγ2在mRNA水平上均没有明显的影响(P>0.05).对能量代谢相关基因的RT-PCR检测结果表明，30 nmol/L 和100nmol/L leptin 可显著促进PGC-1α和UCP3转录 (P<0.05)，30nmol/L leptin可明显提高前脂肪细胞中UCP2 mRNA水平(P<0.05)，且作用24h促进效果明显优于12h处理(P<0.05).研究结果提示，leptin不影响猪前体脂肪细胞分化，但可能通过上调PGC-1α和UCPs转录，促进能量消耗.
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  小麦光温敏雄性不育相关基因的DDRT－PCR分析及功能预测

  赵昌平;张立平;李云伏;马荣才;单福华;张风廷;叶志杰;秦娜

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 56-62.

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  以小麦光温敏雄性不育系BS210为试材，分别在北京顺义（可育环境）和安徽阜阳（不育环境）两种诱导育性表现的生态环境下种植，并于雌雄蕊分化期、药隔形成期、花粉母细胞形成期、四分体期和单核期5个时期提取小穗组织的RNA，利用DDRT-PCR方法分离不育系在光、温因子诱导下的差异表达mRNA，并通过反向Northern 进行验证.对获得的20条差异表达的EST进行了测序和BLAST分析，得到了4个候选基因的片段，对其进行5′Race 扩增、序列分析及功能预测.结果表明：它们分别与水稻的DNA修复重组蛋白基因rad50、小麦穗部表达的LRR重复序列型类受体激酶基因、玉米叶片坏死斑点L1s1基因的序列相似性分别为89%、89%和88%，另外还筛选到1个未知功能的新基因片段，它和rad50分别在可育和不育环境下表达的mRNA具有相同的5′端编码区，但3′端非编码区
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  猪SOCS-3 cDNA序列克隆及在各组织中表达

  张浩卫;吴江维;杨公社

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 63-67.

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  根据大鼠细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS)-3设计并合成一对引物，从八眉猪皮下脂肪组织提取总mRNA，RT-PCR扩增获得猪SOCS-3 cDNA；利用半定量（semi-quantitative, SQ）RT-PCR技术检测大白猪各组织中SOCS-3 mRNA的表达量.扩增获得SOCS-3 基因GenBank 登陆号DQ644577，用CDD软件进行SOCS-3 基因结构分析，该序列具有SOCS-3 特有的保守结构域SH2和SOCS-box. 用Clustal W软件进行同源性分析发现，猪SOCS-3 基因与人、大鼠和小鼠的同源性分别为92%、88%和88%.SQ RT-PCR组织表达检测表明：SOCS-3 基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、皮下脂肪和内脏脂肪中均有表达，其中肺脏和脾脏的表达丰度最高，肝脏和内脏脂肪中的表达量最低.
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  小干扰RNA靶向VEGF基因体内外抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖

  张淑华;葛银林;罗达亚;田润华

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 68-73.

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  血管生成与肿瘤生长、侵袭、转移密切相关.血管内皮生长因子能特异地促进内皮细胞分裂、增殖及迁移,在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用.通过RNAi抑制VEGF表达的抗血管生成疗法可有效应用于肿瘤治疗.本研究采用化学修饰的siRNA在体内外抑制VEGF基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性.选用阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000作为转染试剂，将针对人VEGF基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人类乳腺细胞株MCF-7和裸鼠移植瘤，在体内外诱导RNAi.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，蛋白印迹实验等检测siRNA治疗组和对照组VEGF基因表达及细胞增殖变化.体外实验结果显示：靶向VEGF基因siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后，细胞生长抑制率达52.5%；VEGF的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.01）；裸鼠体内实验结果显示：siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制；RT-PCR结果同时表明治疗组VEGF表达下调.体内外对照组各指标无显著变化.化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功下调靶基因VEGF的表达，抑制MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法.
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  采用SM 22启动子调节荧光蛋白的策略分选和鉴定人前列腺平滑肌细胞与成纤维细胞

  王春雨;周颖;张智松;阎春和;吴荃;石建党;张琚

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 74-79.

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  平滑肌细胞的数量、表型以及在间质细胞中所占的比例在前列腺间质增生的发生和发展中占有重要的地位.获得纯的平滑肌细胞和成纤维细胞，研究它们基因表达的差异，有助于进一步揭示前列腺增生的分子病因学.构建不同长度的 SM 22启动子，测定荧光素酶活性.采用了基于启动子特异性激活红绿色荧光蛋白表达结合流式细胞分选的策略，体外分离纯的平滑肌细胞和成纤维细胞.启动子活性实验结果表明，1 396 bp的人SM22启动子具有平滑肌细胞特异性和较高的相对活性.构建了红绿荧光蛋白的表达载体pDual-color，在此载体中，RFP的表达受1 396bp的SM22启动子调控，GFP的组成型表达受CMV启动子控制.用流式细胞仪分选GFP+/RFP+和GFP+/RFP-细胞，提取总RNA，进行实时定量RT-PCR.结果显示，在分选获得的GFP+/RFP+细胞比GFP+/RFP-细胞的SM22和SMMHC表达水平高10倍以上.提示，基于启动子特异性可以在体外分离纯的平滑肌细胞和成纤维细胞.
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  水稻BAC在玉米有丝分裂染色体上FISH杂交体系的构建

  陶勇生;张祖新;程友林;李立家;郑用琏

  中国生物化学与分子生物学报. 2007, 23(01): 80-84.

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  以水稻细菌人工染色体(BAC)为探针在玉米有丝分裂的细胞学制片上进行荧光原位杂交(FISH)，探讨玉米基因组C_ot DNA对BAC探针重复序列的封阻、杂交后洗脱的严谨度、杂交液中FAD的浓度变化、水稻BAC探针的特异性重复序列的封阻对FISH杂交信号特异性的影响.初步形成了一套以水稻BAC探针在玉米有丝分裂染色体上进行BAC-FISH杂交的优化技术体系.研究结果表明：使用玉米基因组C_ot DNA来封阻水稻BAC探针的重复序列玉米基因组C _ot DNA的C_ot值应小于50，同时还需根据不同探针调整C_ot DNA的C_ot值及与探针的比例；而降低杂交液中FAD浓度和适度控制杂交后洗脱的严谨度，尤其是使用水稻BAC探针本身特异的重复序列的封阻对BAC-FISH杂交信号特异性的改善具有较好的效果.