中国生物化学与分子生物学报

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肖莉莉,黄原

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 435-441.

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从线粒体DNA复制的模型与机制、复制的调控、复制忠实性及其损伤修复3个方面对近年来的研究文献进行了总结.在复制的模型与机制方面，对传统的D环复制的细节有了更深入的了解，新的实验方法的结果显示，在哺乳动物中还存在着链结合单向复制和链结合双向复制2种模型.在线粒体DNA复制的调控方面，近年来研究较多的调控因子主要包括mtDNA聚合酶γ、线粒体单链结合蛋白(mtSSB)、引物酶、解旋酶、连接酶、拓扑异构酶、转录因子mtTFA等，介绍了这些因子的最新研究进展及调控机制；对mtDNA复制时期和拷贝数量调控机制的研究也有突破，确定了Abf2p是mtDNA复制时期与拷贝数目的调控因子.在mtDNA复制的忠实性及其损伤修复研究方面，主要涉及到DNA Polγ的校正功能、错配修复、重组修复、DNA切除修复等，在mtDNA损伤修复中仅存在碱基切除修复机制，缺少核苷酸切除修复机制.

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蛋白质组学研究中的无标记定量方法

薛晓芳,吴松锋,朱云平,贺福初

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 442-449.

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蛋白质定量是探索疾病发生发展状况和寻找新药靶标的重要手段.该领域最常用的技术是比较染色后的二维凝胶上蛋白点的光密度值或综合同位素标记后的质谱峰强度方法.但此二者的样品处理方法都比较麻烦，不利于进行大规模蛋白质组的定量研究.最近几年出现了利用质谱数据进行无标记定量的方法，根据数据类型这些方法可以分为2类：基于鉴定蛋白的肽段数的方法和基于质谱峰强度的方法，在高通量大规模蛋白组定量研究中有很大优势.本综述主要介绍了这2类无标记定量方法的模型及优缺点，并比较了2类方法的灵敏度和准确度.肽段计数方法在检测蛋白丰度变化时更灵敏，而峰面积强度在评估蛋白比率时更准确.

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CYP7A1基因-204位点A/C变异对启动子活性的影响

陈玉娟;张思仲;肖翠英;陶大昌;何国平;王英成;刘运强;马用信

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 450-453.

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CYP7A1（cholesterol 7α-hydroxylase ）在胆固醇向胆汁酸代谢途径中起着至关重要的作用.为研究该基因启动子区-204位点A/C多态性是否影响基因表达, 利用荧光素酶作为报告基因，将含有A或C等位基因的启动子区片段分别正向和反向插入不含启动子的pGL3basic质粒载体中，再以重组体转染4种细胞株,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定酶活性并进行比较.实验结果表明，2种基因型的正向序列启动子活性均高于相应的反向序列，含有A等位基因的启动子片段活性比含有C等位基因的片段低约1/3.TRANSFAC数据库分析显示，当-204位点等位基因为C时,可能存在1个Zic3结合位点.研究结果提示，CYP7A1基因启动子区-204位点A/C变异可减少启动子活性从而影响基因表达，其原因可能为1个潜在的Zic3结合位点的丧失.

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酿酒酵母S期检查点通路上web2基因与rad53基因的位置关系

李新鸣;孙黎光;刘萍;白抚生;付玥;宣忠信

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 454-459.

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为探讨酿酒酵母(S.cerevisiae)S期检查点通路上，web2(wants E1A badly2,web2)基因与rad53基因的上下游位置及相互作用关系，利用羟基脲(hydroxyurea,HU)分别阻断web2突变株和野生株细胞的DNA合成.采用pHA-rad53质粒救助实验测定质粒源性Rad53蛋白是否能救助web2突变株对羟基脲的敏感性；Western印迹及免疫共沉淀反应检测Rad53蛋白表达及磷酸化.结果显示，pHA-rad53质粒可以救助web2突变株的存活；Western印迹检测到web2突变株内质粒源性Rad53蛋白表达增强而且至少Rad53部分蛋白为磷酸化蛋白.说明在HU作用下，过表达并磷酸化的质粒源性Rad53蛋白可以救助web2突变株的S期检查点功能缺陷，在酿酒酵母S期检查点通路上web2基因位于rad53基因上游，可能直接参与将检查点信号传递至Rad53蛋白.

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AP-1与STAT5相互作用协同调节血管紧张素原基因表达

韩梅,温进坤,聂磊

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 465-469.

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为研究AP-1和STAT5协同调节血管紧张素原基因表达的作用机制，用凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）和染色质免疫沉淀分析（ChIP assay）检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的AP-1和STAT5的DNA结合活性；用凝胶超迁移分析和免疫共沉淀方法观察AP-1和STAT5的相互作用. 结果显示，AngⅡ可分别促进AP-1和STAT5与血管紧张素原基因调控区顺式元件的结合以及二者之间的相互作用；核蛋白与含AP-1结合位点的寡核苷酸探针结合形成的复合物可与抗c-Jun抗体和抗STAT5抗体形成超迁移电泳区带；而用抗c-Jun抗体也可从STAT5染色质免疫沉淀复合物洗脱液中检测到AP-1的存在. 而且，AP-1和STAT5的相互作用程度及其二者与DNA的结合活性与血管紧张素原表达活性具有一致关系，该效应可被JAK2特异抑制剂AG490所抑制. 上述结果提示，与顺式元件结合的AP-1和STAT5通过相互作用而形成四元复合物协同调节血管紧张素原基因的表达，JAK2对该过程具有诱导活化作用.

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鲢鱼可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)基因cDNA全序列与5′调控区的克隆与分析

廖婉琴,梁旭方,王琳,雷腊梅,韩博平

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 470-476.

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淡水鱼类可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)在微囊藻毒素去毒代谢过程中具有独特的关键作用，因而也称为微囊藻毒素去毒酶. 从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)肝脏通过简并引物克隆微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心序列，应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列，最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列. 序列分析结果表明，鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全长920 bp，其中5′-UTR长74 bp，3′-UTR长174 bp，编码区长672 bp，编码223个氨基酸. 应用基因组步行法，在鲢鱼克隆得到淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因5′侧翼区878 bp序列. 与哺乳动物及海水鱼sGST基因不同，鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因的5′侧翼区，发现存在多个脂多糖反应元件(LPSRE)，表明来源于毒藻的脂多糖可能对鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因表达有潜在调控作用.

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FAK和ILK介导骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移

李菁菁,温进坤,韩梅

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 477-483.

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黏着斑激酶（FAK）和整合素偶联激酶（ILK）是整合素信号途径中的重要信号转导分子，为阐明两者在血管平滑肌细胞（VSMC）黏附和迁移中的作用，以骨桥蛋白（OPN）作为VSMC黏附和迁移的诱导剂，检测其对FAK和ILK磷酸化以及对两者之间结合的影响.在此基础上，用FAK磷酸化特异性抑制剂黏着斑相关非激酶（FRNK）或ILK反义RNA分别阻断FAK磷酸化或ILK表达，进一步探讨两者在VSMC黏附和迁移中所起的作用.结果显示，OPN诱导可促进FAK磷酸化，诱导10 min后FAK磷酸化水平升高到对照组的2.4倍；与此同时，ILK的磷酸化受到抑制，30 min降至对照细胞的44.6％.OPN诱导FAK磷酸化的同时使FAK与ILK的结合减少.外源性FRNK在VSMC中的过表达显著降低FAK的磷酸化水平，促进ILK磷酸化和FAK与ILK之间的结合，抑制VSMC的黏附和迁移.用ILK反义RNA抑制ILK表达使VSMC在OPN上的黏附增加1.8倍，迁移细胞数降低45.5％.结果提示，FAK和ILK介导OPN诱导的VSMC黏附和迁移过程，两者通过对同一刺激信号产生不同的磷酸化变化而对VSMC的黏附和迁移产生不同的影响.

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通过筛选随机多肽文库研究ZO-1中PDZ1结构域的配体结合特点

田瑞,李英娜,宋婀莉,高诗娟,黄海明,张玲,马素参,高友鹤

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 484-490.

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选择ZO-1的PDZ1结构域作为研究对象，以酵母双杂交为筛选系统，筛选随机多肽文库和与其它PDZ结构域的配体进行相互作用，阐明ZO-1 PDZ1的配体结合特性.ZO-1 PDZ1识别配体C末端保守的氨基酸序列通式可以表示为：［S/T］［F/Y/W］［V/I/L/C］-COOH、［S/T］［K/R］V-COOH、V［F/Y/W］［L/C］-COOH、EYV-COOH.研究发现ZO-1 PDZ1的配体同时具有3种传统PDZ结构域配体的特点，不同的是其结合配体-1位对芳香族氨基酸具有强烈的偏好性.并且某些PDZ结构域配体的-1位和-3位对结构域与配体相互作用的特异性和亲和力有重要的作用.随后通过生物信息学的方法在Swiss-Prot数据库找到与此识别规律相符合的天然人类蛋白质.根据蛋白质的功能和细胞定位等性质选择10个配体用酵母双杂交验证相互作用.证实的相互作用配体有4个.本研究希望用这样的研究策略建立一种有效的研究蛋白质相互作用的方法，通过在全蛋白质组规模上对含有结合配体保守氨基酸序列的蛋白质的查询，理论上可以找到现有数据库中所有可能与目的结构域结合的潜在配体蛋白，特别是那些筛选cDNA文库不容易获得的低丰度配体.

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一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选

刘瑜,刘亚伟,李海玉,刘靖华,邓鹏,姜勇

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 491-497.

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以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)为示踪物，在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法，从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽（cell-penetrating peptide, CPP）. 采用点突变技术，首先在pET-14b载体多克隆位点NdeⅠ和XhoⅠ之间加入4个限制性内切酶位点，随后在BamH Ⅰ位点后加入三联终止密码子，接着再利用亚克隆的方法在Kpn Ⅰ 和XhoⅠ之间插入EGFP，形成一个新的用于原核表达示踪蛋白的载体pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用点突变技术在上述构建的示踪载体的多克隆位点XhoⅠ和BamH Ⅰ之间插入36个随机碱基序列.以His-Tat-EGFP作为工具建立有效的筛选方法，利用这种方法对文库进行筛选. 酶切和测序表明，示踪载体的构建是正确的，且在大肠杆菌中可有效地表达出His标记的EGFP.在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库至少包含了10⁵个独立克隆，其中90%以上的克隆插入的随机片段都是36个碱基.建立的筛选方法是可行的，并用此方法进行了初步的筛选.

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一种用于基因芯片可靠的双轮RNA线性扩增技术

周荣荣;卫军霞;王亚辉;张亮;程京,;周玉祥,;

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 498-507.

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DNA微阵列能在一次实验中检测成千上万个基因的表达情况, 有助于阐明疾病发生的分子机制及发现新的诊治靶标.但常规方法需要大量RNA, 因而基于T7 RNA线性扩增技术逐渐成为微阵列表达谱实验中最常用的探针制备方法.本方法将实验步骤进一步改进，增加额外的一轮体外转录，并结合Klenow酶标记技术来制备cDNA靶标和寡核苷酸芯片杂交.从纳克量级的总RNA起始，本方法和常规的RNA单轮线性扩增法相比，仍然准确地保留了约70%的基因表达信息.同一RNA样本的自身比较实验及重复实验结果也显示，该方法具有较高的可靠性和重复性.RNA双轮体外扩增法需要的起始RNA相对于常规的单轮扩增法减少了很多（10 ng甚至更少），因而非常适合分析那些只能提供微量RNA的样本.

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与α疱疹病毒VP22蛋白融合增强“自杀性”DNA疫苗的免疫反应

肖少波,方六荣,姚琳,潘永飞,江云波,陈焕春

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 508-512.

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α疱疹病毒VP22具有独特的蛋白转导特性，能通过一种不依赖于高尔基体的非经典途径从原始表达细胞转导到邻近的非表达细胞中，而且VP22还能使与之融合的外源蛋白在细胞间转导.因此，VP22是一种极具开发潜力的免疫增强分子.本研究以牛疱疹病毒1型(BHV-1)的VP22为研究对象，以β-半乳糖苷酶（β-gal）为模式抗原，构建了BHV-1 VP22(BVP22)与β-gal融合的“自杀性"DNA疫苗表达质粒pSCAB-gal，转染BHK21细胞.X-gal染色结果表明，表达的融合蛋白BVP22-gal仍具有蛋白转导能力，而单独表达β-gal的“自杀性"DNA疫苗表达质粒pSCA-gal不具有这种能力.进一步将pSCAB-gal和pSCA-gal分别免疫BALB/c小鼠，结果pSCAB-gal免疫能显著增强β-gal特异性ELISA抗体和细胞毒T细胞（CTL）活性，表明与BVP22融合能显著增强“自杀性”DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫反应.

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SPLUNC1多肽抗体的设计、制备与鉴定

周后德,赵瑾,张晋,欧阳珏,周鸣,彭淑平,李小玲,李桂源

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(06): 513.

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通过设计SPLUNC1蛋白的一段多肽，快速制备抗SPLUNC1的多肽抗体，检测多肽抗体的性能，为SPLUNC1的功能研究提供可靠的平台. 用DS Gene1.1软件分析SPLUNC1蛋白的跨膜结构域、二级结构、疏水性、亲水性以及抗原性等，综合考虑抗体设计的其它因素，设计出两段15～20个氨基酸的多肽.将合成后的多肽与钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，同时初筛出宿主血清与SPLUNC1无交叉反应的新西兰家兔，用与KLH相连的SPLUNC1多肽免疫家兔，2个月后获取血清，亲和纯化出抗SPLUNC1多肽抗体，通过ELISA法检测其效价，免疫印迹与免疫组化检测其特异性与适用范围.通过该方法得到了高效价与高特异性的SPLUNC1多克隆特异性抗体，ELISA法测定其效价可达到1∶10⁵，通过对包含有PLUNC家族不同成员的蛋白混合物进行Western印迹检测证明，该多肽抗体具有较高的特异性，不与同一家族中的其它蛋白发生交叉反应，而且该抗体可用于免疫组化，说明所制备的分泌性蛋白SPLUNC1抗体具有高特异、高效价等特点，将为SPLUNC1基因的功能研究提供有用的研究材料.

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