中国生物化学与分子生物学报

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田宝磊;孙志贤

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 349-354.

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基因组稳定性同肿瘤的发生、发展密切相关，维护基因组稳定性对于细胞行使正常的生理功能是至关重要的.早幼粒细胞白血病蛋白PML(promyelocytic leukemia)主要借助分子中RBCC结构，同近50种有重要功能的蛋白相互作用而形成PML-NBs(PML nuclear bodies).PML-NBs是与核基质结合的、动态的、亚核多蛋白复合物，它作为区室化核结构(compartmentalized nuclear architecture)——染色质间区室(interchromatin compartment)的功能单位，满足了真核基因高层次表达调控模式的时空要求.最新的研究证明：PML是基因组稳定性“守门人”——p53分子的搭档分子，同样在基因组稳定性调控中发挥着重要的功能作用.它协同p53参与了DNA损伤反应所诱发的细胞凋亡，还可组织多种DNA修复分子参与DNA损伤修复，在DNA损伤反应中具有重要作用；此外，PML还通过调控aurora A的活性参与中心体复制检查点调控，借助调控survivin的表达参与有丝分裂纺锤体组装检查点调控，在染色体复制和细胞分裂中均显示了重要的调控作用.而当PML表达缺失或不足时则与多种肿瘤的发生、发展相关联，因此PML分子在维护基因组稳定性中具有重要功能作用，本文仅就相关的最新研究进展予以概述

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APE/Ref-1在中枢神经系统氧化应激反应中的保护作用

陈欣 ;刘艳霞

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 355-359.

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化学性质活泼的自由基（free radicals）在保持产生和清除平衡的稳衡性动态下能履行正常的生理功能，但超过生物体的清除能力则可导致多种疾病.无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1（apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox-factor 1, APE/Ref-1）是一种体内分布广泛的多功能蛋白质，通过修复DNA的无嘌呤/无嘧啶（apurinic/apyrimidinic, AP）部位参与DNA的碱基切除修复(base excision repair, BER).APE/Ref-1还可通过还原许多转录因子的半胱氨酸残基使之易于与DNA结合而调控真核细胞的基因表达.APE/Ref-1的抗细胞凋亡作用使其在自由基所致中枢神经系统病变如脑缺血-再灌注损伤、神经退行性病变、脑动脉粥样硬化中发挥了重要作用.

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Conantokins的结构与功能

戴秋云;肖彩

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 360-364.

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Conantokins(con-)是芋螺活性肽的一个重要家族，能特异作用于N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)及其亚型, 是目前为止发现的该种受体的第一种肽类抑制剂. 本文介绍了conantokins的生化特征、生物合成机制以及对NMDA受体不同亚基的选择性抑制特性，重点综述了conantokins在有无金属离子存在下的NMR结构、结构与功能的关系，对含有特定Gla排列的con-G及conantokin突变体在Ca²⁺作用下形成新颖的双螺旋结构的机制进行了探讨，对conantokins在镇痛、治疗癫痫、神经保护等药学用途进行了简要概括.

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东亚钳蝎毒素BmKT四个同源基因的克隆及基因组织分析

罗锋:刘辉;李文鑫

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 365-372.

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BmKT是从本室构建的cDNA文库中筛选到的1个α钠通道毒素，根据其全长cDNA序列设计引物，采用PCR法以蝎总基因组DNA为模板，获得4个BmKT的同源基因，分别命名为BmKT′和BmKTa、BmKTb、BmKTb′.序列分析表明：BmKT′和BmKTa基因含有大小分别为509 bp和506 bp的内含子，位于信号肽编码区内，插入信号肽-4位残基Gly密码子的第一个碱基G之后；而BmKTb和BmKTb′ 的内含子大小均为418 bp．这4个BmKT的同源基因内含子符合GT/AG拼接规律，其中BmKT′和BmKTa的内含子A+T含量分别为61.7%和61.9%，低于目前已报导的大多数蝎毒素基因A+T含量，大大低于它们第一外显子A+T含量（71.7%），略高于第二外显子A+T含量（55.5%）；而BmKTb，BmKTb′的内含子A+T含量分别为75.8%和76.1%，与目前已报导的大多数蝎毒素基因A+T含量相似．BmKT′基因的外显子与BmKT基因cDNA所对应氨基酸序列仅在信号肽中-7位有一个氨基残基的差异（BmKT: Leu→BmKTa: Val）；而BmKTa基因外显子所推断的氨基酸序列与BmKT前体比较，则在成熟肽的+54位发生了突变（BmKT: Lys→BmKTa: Asn），是与BmKT同源的一个新基因．BmKTb基因和BmKTb′基因所编码的前体肽与BmKT基因对应的前体肽同源性约为65%，显然BmKTb和BmKTb′是不同于BmKT的2个新基因（GenBank登录号: BmKT′, AY786186; BmKTa, AY676142; BmKTb, AY676140; BmKTb′, AY676141）

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BRD7的亚细胞定位及其假定核输出信号序列的分离与鉴

周鸣;徐晓杰; 彭聪;何佳瑾;彭淑平;李小玲;卢建红;李桂源

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 373-378.

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BRD7被鉴定为一个鼻咽癌密切相关新基因和潜在的核转录调节因子．通过绿色荧光蛋白(GFP)介导的亚细胞定位方法,系统研究BRD7在非洲绿猴肾COS7细胞、人宫颈癌HeLa细胞以及人鼻咽癌HNE1细胞中的亚细胞定位，发现BRD7主要定位在细胞核，呈细点状或条梭状分布，3株细胞中没有明显的细胞类型差异．通过对BRD7编码蛋白氨基酸序列进行比对分析，发现了1个具有亮氨酸富集特征的假定核输出信号序列pNES，该区域具有类似核输出信号特征序列“ L-x(2,3)-［LIVFM］-x(2,3)-L-x-［LI］ "（X代表任意氨基酸）的结构；通过功能分析，发现它不具有介导异源蛋白GFP胞浆定位的功能，且其亚细胞定位或胞浆/胞核分布比例不受细霉素B(leptomycin B)干预的影响，说明这个pNES不具核输出信号结构域的功能，不是BRD7的核输出信号．

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hhLIM的表达及其在F肌动蛋白交联中的作用

郑斌;温进坤;史建红;韩梅

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 379-383.

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为进一步研究hhLIM的功能及其与F肌动蛋白(F-actin)之间的相互关系，利用PCR扩增hhlim基因并将其克隆到pGEX-3X表达质粒上，重组表达质粒转化宿主菌得到稳定表达的可溶性产物，表达产物经Glutathione-Sepharose亲和纯化得到纯度达90%的融合蛋白GST-hhLIM.进而研究其在F肌动蛋白交联中的作用,以鬼比环肽和细胞松弛素处理C2C12细胞，诱导细胞骨架聚合和解聚.荧光显微镜下观察， hhLIM的分布变化与细胞骨架的形态学变化具有相关性.Western印迹证实，hhLIM主要作为细胞骨架相关蛋白而分布于F肌动蛋白组分中，肌动蛋白交联实验显示，hhLIM蛋白与F肌动蛋白具有较高的亲和力，具有促进F肌动蛋白纤维的交联并将其捆聚成束的作用.结果表明，hhLIM是一种F肌动蛋白交联蛋白，通过将F肌动蛋白纤维捆聚成束而参与骨架重构

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ERβ相互作用蛋白PSMC5的分离及其在ERβ信号途径中的作用

王晓辉;张浩;周蕾;丁丽华;韩聚强;宁康;孙琰;袁斌；刘辉；常庆；李杰之；叶棋浓

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 384-389.

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雌激素受体β（ERβ）在乳腺癌发生发展中起着重要的作用，寻找与ERβ相互作用的共调节因子对阐明ER信号通路具有重要价值.应用酵母双杂交技术，以ERβ的AF2结构域为诱饵蛋白从人乳腺文库中筛选出了与之相互作用的蛋白26S蛋白酶的亚单位ATPase 5（PSMC5）.GST沉淀实验表明，PSMC5在体外特异地与ERβ相结合.转录活性实验表明，PSMC5以激素依赖的方式降低ERβ转录活性.上述结果提示，PSMC5可能通过影响ERβ信号途径在乳腺癌发生发展中起着重要的作用.

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截短型细胞毒素Gelonin的分子构象和生物活性

蘧艳峰；李卓玉；郭晨云；郭素堂；史天良；袁静明

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 390-395.

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为了探索免疫络合物中具杀伤靶细胞的毒素,gelonin的结构与功能的关系,根据化学合成的gelonin基因序列和3维分子构象设计了N端区Gly,Leu,Asp和/或C端区Asp,Lys,Asp,Pro,Lys缺失的gelonin. 以重组质粒pEgel为模板,在相应引物存在下,用PCR法获得5′端区和/或3′端区碱基序列缺失的gelonin基因片段. 经克隆、表达和纯化得到3种截短型gelonin（G-N3、G-C5、G-N3C5）. CD谱和荧光谱表明,完整型gelonin（G-O）与截短型gelonin的分子构象有明显的差异.它们的构象变化与类DNase活性和抑制肿瘤细胞生长的能力均为G-O≥ G-N3＞GC5＞G-N3C5. 结果再一次证明了具有α+β型结构蛋白,gelonin的构象与生物活性的一致性.

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脂代谢相关三基因突变小鼠肝脏差异表达蛋白组研究

傅强；顾黛君；沈龙祥；杜文喜；王娜；宋兴辉；金晓蕾；潘杰

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 396-401.

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应用双向电泳及质谱技术对5周龄三基因(apoE^-1-/LDLR^-1-/Lepr^db/db)联合突变小鼠和野生型小鼠肝组织的差异蛋白质进行比较研究，借此分析脂代谢相关三基因联合突变小鼠肝脏蛋白质表达特点，研究差异表达蛋白与血脂代谢紊乱和动脉粥样硬化的关系.在实验中检测到三基因联合突变小鼠和野生型小鼠肝脏中分别平均有（841±57）个和（1 017±50）个蛋白点（n=3），两者的平均匹配率分别为71.9%，83.2%.三基因联合突变小鼠有140个蛋白点未能与野生型小鼠匹配，其中相差5倍以上的上调点和下调点分别为7个和39个.选取其中的6个点做质谱分析，鉴定为endoplasmin precursor(Grp-94)、酸性富亮氨酸核磷蛋白32家族成员A(acidic leucin-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A)、转铁蛋白前体、果糖二磷酸酶1、纤维连接蛋白前体、补体C3前体，纤维蛋白原B β多肽7种蛋白. 该结果提示，差异表达的蛋白对三基因联合突变小鼠的血脂代谢紊乱和动脉粥样硬化发生发展过程起一定作用.

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p38L12TAT融合肽对山梨糖醇引起的 ECV304细胞ATF2磷酸化的抑制作用

郭爱华；刘志锋；李海玉；唐靖；李志杰；刘亚伟；龚小卫；刘靖华；邓鹏；姜勇

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 402-408.

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构建p38 Loop-12(L12)的TAT融合表达载体，纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“T-X-Y”双磷酸化位点的AF突变体p38L12（AF）片段，克隆入His标记的TAT-EGFP融合蛋白原核表达载体pHTE（pET14b-His-TAT-EGFP），经酶切、测序鉴定正确后，将重组质粒转化原核表达菌，诱导表达纯化融合蛋白；将融合蛋白加入ECV304细胞后于荧光显微镜下观察并行Western印迹分析，检测融合蛋白的细胞内转导活性；通过检测内源性ATF2磷酸化水平，鉴定高渗刺激下p38L12对内源性p38活性的影响.成功构建了p38L12和p38L12(AF)片段与TAT的融合表达载体，并获得相应的融合蛋白.在ECV304细胞中可见导入的HTE-p38L12和THE-p38L12(AF)融合蛋白具有较高的细胞内转导活性和转导效率，并可竞争性抑制高渗刺激对内源性p38的活化.基于HIV-1 TAT细胞转导系统证实p38L12可竞争性抑制高渗刺激诱导的内源性p38对ATF2的活化，从而发挥对p38激活特异性抑制的功能.

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Tau融合蛋白及其缺失突变体与朊蛋白的体外作用分析

王小凡；韩俊；董辰方；韩露；万言珍；李锋；安润；董小平

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 409-414.

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在部分朊病毒病（prion diseases）中，高度磷酸化的微管相关蛋白tau与朊蛋白(prion protein,PrP)发生共定位，tau蛋白可能在朊病毒病的病理机制中有重要作用. 本室已经证明二者可以发生分子间相互作用，本文进一步分析了tau蛋白与prion的体外相互作用及作用位点. 利用RT-PCR方法从人源细胞系SHSY5Y cDNA中扩增出微管相关蛋白tau全长cDNA序列，克隆至质粒pGEX-2T载体，在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白GST-tau. 利用GST pull-down及免疫共沉淀方法检测全长tau蛋白与PrP23-231的分子间相互作用. 进一步表达tau 蛋白的各种缺失突变体，确定tau蛋白与PrP蛋白的相互作用位点. 结果表明，所表达的全长tau蛋白及各种缺失突变体均为可溶性蛋白，Western印迹结果显示，各种蛋白均能很好的被tau蛋白单抗识别. GST pull-down和免疫共沉淀实验均显示，原核表达的全长tau蛋白可与全长的PrP蛋白在体外发生相互作用，并确定相互作用位点位于tau蛋白的N端序列及中段的重复区. 上述结果为研究tau蛋白与PrP的相互作用在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的理论基础.

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类风湿关节炎中白三烯B4诱导TNF-α和IL-1β的表达

陈占昆；吕厚山；林剑浩；许少华；蒋东芳

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 415-421.

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为了探讨类风湿关节炎的发病过程中白三烯B4(leukotriene，LTB4)对TNF-α和IL-1β表达的影响.加入外源性LTB4或者在LIT存在的情况下,加入苯丁抑制素(bestatin,LTA4水解酶抑制剂)和MK-886(5-脂氧合酶激动蛋白抑制剂)后, 采用实时PCR和酶联免疫吸附分析法来检测原代培养的类风湿滑膜细胞及培养上清液中TNF-α和IL-1β在mRNA及蛋白水平的表达.外源性的LTB4 10^-8mol/L使TNF-α和IL-1β mRNA水平表达分别增加了14倍和1倍, 蛋白水平分别增加了3倍.加入LIT刺激内源性的LTB4增加了14倍后,使TNF-α和IL-1βmRNA水平表达分别增加了145倍和12倍, 蛋白水平分别增加了3倍.在LIT存在的情况下, MK-886 10 μmol/L使LTB4合成降低了62%(P<0.000 1), 使TNF-α和IL-1β mRNA水平表达分别降低了66%(P<0.05)和71%(P<0.001),它们的蛋白水平分别降低了75%和70%(P<0.01). 100 μg/ml苯丁抑制素使LTB4合成降低了78%(P<0.000 1), 使TNF-α和IL-1β mRNA水平表达分别降低了86%(P<0.001)和79%(P<0.01), 它们的蛋白水平分别降低了84%和76%(P<0.05). 在类风湿关节炎中，LTB4诱导TNF-α和IL-1β的表达. 这一结果为类风湿关节炎发病机制进一步探讨提供了一条新思路.

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氧化损伤与内质网应激在四氯化碳致大鼠肝脂肪变性中的作用机制

林胜利；卓德祥；王晓红；吴逸园；王珂；吴耀南；张卫光；李载权；唐朝枢

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 422-430.

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肝脂肪变性是长期饮酒、肥胖、药物中毒等致脂肪肝形成过程中重要的中间阶段,严重的脂肪堆积会导致肝细胞坏死或肝硬化,但是有关肝脂肪变性的分子机理目前仍不十分清楚.本实验利用四氯化碳建立大鼠肝脂肪变性模型,四氯化碳处理组较对照组肝脏丙二醛含量增加68%,内质网应激标志蛋白GRP78 mRNA水平和蛋白质水平表达均明显增加;人肝癌细胞株HepG2体外培养中，加入四氯化碳处理后内质网发生应激,并导致SREBP-1表达增加且活化.结果表明，四氯化碳导致的肝脂肪变性与肝细胞的氧化损伤和内质网应激有关,其分子机理可能为内质网应激发生后促进SREBP-1转录因子的表达与活化，SREBP-1在细胞核内参与生脂相关酶如HMG CoA 还原酶等基因的诱导表达,生脂相关酶含量的增加进一步使肝细胞甘油三酯、胆固醇合成增加，脂质的异常堆积导致了肝脂肪变性的发生.

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用鞘磷脂作为标志分子鉴定脂筏

王凯；黄静；李亚丽；田晓光；孙长凯；夏泉；崔肇春；马克里

中国生物化学与分子生物学报. 2006, 22(05): 431-434.

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脂筏是质膜双层中富含鞘脂、胆固醇及特殊蛋白质的质膜微区.对其功能的研究，首先要对其进行分离和鉴定.常利用密度梯度超速离心将其分离，然后以脂筏中富含的神经节苷脂GM₁作为标志分子，利用荧光或生物素标记的霍乱毒素-B亚基进行亲和标记来鉴定脂筏.但这一鉴定方法操作复杂、费时、易对环境造成污染，所用关键试剂霍乱毒素不易获得，再加上一些组织GM₁含量甚微或不含GM₁，使其应用受到局限.为建立一个特异性高又对各种组织广泛适应的脂筏鉴定方法.对两种细胞系脂筏的脂类组分进行了分析.结果发现，可用鞘磷脂作为脂筏的特异性标志分子，采用高效薄层层析技术对脂筏进行鉴定.

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