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  • 1998年, 14卷, 第01期
    刊出日期:1998-02-20
      

    论文

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    论文
  • 黄翠芬,叶棋浓
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 1-7.
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    蛋白质间相互作用技术的研究近况黄翠芬叶棋浓(军事医学科学院生物工程研究所,北京100850关键词:蛋白质,相互作用,技术RecentAdvancesintheTechniquesofProtein┐ProteinInteractionsHuangCu...
  • 陈光慧,朱燕青,张晨晖,高炜,唐朝枢,周爱儒,李竹,汤健
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 8-14.
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    同型半胱氨酸/半胱氨酸是体内的含硫氨基酸,近年来提出它们可以诱导血管平滑肌细胞的增殖,是心血管病的一个新的独立的危险因子.但其机制尚不了解,本研究目的在于克隆同型半胱氨酸/半胱氨酸诱导的新基因.应用差异显示即RNAmapping的方法,从半胱氨酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞中,寻找有差异的条带,克隆新的cDNA.结果分离出7种上调和4种下调cDNA,并且发现其中有4个是至今尚未发现的新的cDNA.应用Northernblot分析,这4个新的mRNA其长度分别为5.0、2.0、1.8和2.2kb.它们可能在血管平滑肌细胞增殖和心血管病的发病中具有重要意义.
  • 吴朝栋,高建恩,陶其敏
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 15-19.
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    利用DNA重组技术,将Ⅲ型中国株HCVE2/NS1基因片段插入真核表达载体,然后转染哺乳动物细胞NIH3T3以表达E2糖蛋白.检测显示来自3月以上培养的细胞克隆中表达产物分子量为70kD,经Westernblot证实该表达产物能与抗HCV阳性血清进行特异性反应.以上表明首次在哺乳动物细胞中成功表达Ⅲ型中国株HCV的E2糖蛋白,并建立相应的稳定表达细胞系.
  • 赵云峰,王海涛,王全立,杜芝燕,杨景庚,孙红琰,马立人,殷震
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 20-24.
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    构建人源噬菌体抗体文库如下:HIV感染者脾细胞中提取mRNA,经反转录再以人IgG重链Fd两端及轻链“通用”引物分别扩增Fab基因片段,依次插入到噬菌粒载体pComb3中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,经辅助噬菌体救助,重组噬菌体得以溶源裂解,Fab表达于噬菌体包膜蛋白Ⅲ的N端.此噬菌体抗体库的容量为5×105.筛选抗HIV-1同时又具有能被抗独特型抗体“IF7”所识别的独特型的阳性抗体:以重组包膜糖蛋白gp160及gp41多肽对噬菌体抗体文库进行三次淘选,使抗gp160的特异性抗体得到100倍的富集.然后通过直接ELISA和竞争性ELISA实验筛选出两株结合性较好的特异性抗gp160抗体-3B株与1D株.直接ELISA实验表明这两株克隆均能被“1F7”所识别,为抗独特型多肽的筛选奠定了基础.
  • 董自正,张兆山,李淑琴,黄翠芬
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 25-31.
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    CS3是某些肠毒素大肠杆菌菌体表面上的多聚物,它能使病原菌粘附于宿主的小肠上皮细胞上,是致病的重要因素.为了探索CS3菌毛抗原基因的表达调控机制,根据CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核启动子的-10区和-35区DNA序列.采用基因重组技术将CS3结构基因上游120bp的DNA片段亚克隆进缺乏启动子而只含报告基因lacZ的质粒pCB267中.凝胶滞留和启动报告基因表达的实验证明了CS3亚基结构基因具有自身的启动子(Ps).将该启动子上游区域不同长度的核苷酸片段克隆进pCB267中,报告基因表达结果表明CS3结构基因的表达受其上游区域的抑制.核苷酸序列分析发现,在Ps-35区上游550bp和840bp处各存在一个富A-T簇.结合原核启动子的一般作用规律推知,CS3的表达可能受DNA结合蛋白型的正向调节因子的作用.用CFA/1菌毛抗原基因的正向调节基因cfaD对CS3基因进行的互补表达试验表明cfaD基因不仅可消除上游区对Ps的抑制,而且可大幅度地提高Ps的启动能力.在分析表达调控的基础上获得CS3重组高效表达.同时提出了其表达调控模型.
  • 鹿峪峰,王朝晖,韩玉珉
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 32-37.
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    以基因突变结合动力学分析的方法研究了水蛭素空间结构及其与凝血酶的相互作用.采用基因定点突变和随机突变的方法得到两个重组水蛭素突变体,并从抗酰胺水解活性,抗凝血酶活力和稳定性三个方面,比较研究了重组水蛭素rHV2中47位和11位两个氨基酸残基对其稳定性和抑制能力的影响.将rHV2中Gln11和Asn47分别突变为His11和Lys47后,rHV2-H11生物活力降低30%,rHV2-K47生物活力提高61%.测定抑制常数Ki表明,rHV2-H11突变体Ki值升高14倍,rHV2-K47突变体Ki值降低14倍,两个突变体的热稳定性均有所增强,rHV2-H11在酸性和碱性条件的稳定性降低.分析实验结果,可以认为:①47位的Lys可能是通过氢键和静电两种作用力同时影响着水蛭素的三维结构和其与凝血酶的结合.②11位氨基酸可能是水蛭素分子中另一个重要位点.
  • 石统东,甘立霞,曹廷兵,朱锡华
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 38-41.
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    主要利用凝胶迁移率试验和抗体超迁移试验,以hIL-3基因5′侧翼含κB位点的序列为探针,探究NF-κB是否参与了hIL-3基因的表达调节.结果表明,在Jurkat细胞和人外周血T淋巴细胞中,都存在与此序列特异结合的可诱导蛋白;NF-κBp65亚基的单抗对DNA-蛋白复合物的形成没有影响.这些结果揭示:正常细胞和肿瘤细胞中,确存在可特异识别hIL-3基因5′侧翼的κB顺序的蛋白因子,而且该蛋白因子的表达是可诱导的;但NF-κB并未参与IL-3基因的表达调节.
  • 叶棋浓,王恒梁,姚潇,张毅,苏国富,黄翠芬,周廷冲
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 42-46.
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    蛋白酶尤其是ICE家族的蛋白酶是细胞死亡机制的核心成分.ICE蛋白酶家族中,CPP32(又称Yama,apopain)在不同形式的凋亡途径中起核心作用.为深入研究CPP32的结构与功能,克隆了CPP32基因,并在大肠杆菌中进行了表达.采用RT-PCR技术从人肺癌细胞株中获得了CPP32蛋白酶基因.DNA序列分析表明,该基因由已报道的编码CPP32αp20亚单位和CPP32βp10亚单位的核苷酸组成,提示ICE家族蛋白酶寡聚化可能受DNA水平调控.将获得的CPP32基因分别重组到pBV321和pEX31B载体上,并分别转化到大肠杆菌中,均获得了CPP32基因的较高表达,表达产物主要以包涵体形式存在.
  • 刘宝英,赵明,王会信,王芳,丁红梅
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 47-51.
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    胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)是一种多功能细胞增殖调控因子,它对许多疾病有较好的治疗作用.为了获得大量的IGF-Ⅰ产品,在测定了IGF-Ⅰ全长序列的基础上,构建了IGF-Ⅰ表达载体pBVIGF,经热诱导表达后,SDS-PAGE分析表明:含有重组表达质粒的菌株可表达出7.6kD的蛋白.研究了不同菌株对IGF-Ⅰ表达的影响.IGF-Ⅰ的表达水平可达15mg/L.重组蛋白主要以包涵体形式存在,进行了初步纯化和复性研究,Western印迹表明重组蛋白具有IGF-Ⅰ的抗原性.并初步建立了IGF-Ⅰ生物活性测定方法.
  • 王少文,马康涛,宋宇蓓,张风云,张乃蘅
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 52-56.
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    研究发现与IL-1诱导反应相关的APP启动子-488/-303片段,可与SH-SY5Y细胞核抽提物中的核蛋白发生结合作用,并且在IL-Ⅰ刺激前后有量的变化,IL-Ⅰ刺激后其结合作用明显加强.冷竞争实验表明,此结合作用具有特异性.同时发现APP启动子-488/-303片段中的AP-Ⅰ作用位点及SH-SY5Y细胞核抽提物中的AP-Ⅰ作用因子可能与此结合反应无关,而一个90kD蛋白质与此结合反应有关.
  • 宋述梅,寿成超
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 57-61.
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    血管内皮细胞生长因子(VEGF)是特异的血管内皮细胞促分裂素,它主要通过相应受体(KDR)刺激血管内皮细胞增殖.VEGF及其受体在肿瘤血管形成中起重要作用.通过逆转录及多聚酶链式反应(RT-PCR)成功地从人脐静脉内皮细胞扩增出编码KDR胞外VEGF结合区的DNA片段,将该片段克隆在谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX2T中,获得在大肠杆菌Jm109的稳定表达.表达的不溶性融合蛋白可经碱变性法大量提取,为后续的研究工作奠定了基础.
  • 董凡,金由辛
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 62-64.
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    合成了4段具有不同高级结构或不同修饰的寡聚脱氧核苷酸,检查它们在20%血清中的稳定性.发现:(1)寡核苷酸主要被血清中的3′外切核酸酶降解,未经修饰的线性寡核苷酸降解严重;(2)末端部分硫代修饰的寡核苷酸稳定性明显提高;(3)自身互补形成的配对结构可有效保护3′末端.具有4个以上(含4个)GC对的3′端发夹结构寡核苷酸,其抗核酸酶的能力几乎与硫代修饰的寡核苷酸相当.
  • 江洪
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 65-70.
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    以GCG软件和数学模型为工具,用观察到的某DNA序列的频数(O)与理论计算出的此序列频数(T)的比值(O/T)为参数(即相对频数),将基因资料库(包括GenBank和EMBLDataBase)的DNA序列进行了分析.结果显示DNA重复序列的分布存在着如下趋势:(1)越简单的DNA重复序列,其相对频数越高,离平衡分布越远;(2)顺向重复序列的分布的相对频数高于反向重复序列的分布;(3)较长的保守序列的相对频数较高;(4)含AT碱基对的重复序列的相对频数高于含GC碱基对的重复序列,在较长的DNA重复序列中尤其明显:(5)上述DNA重复序列分布的趋势存在种属特异性.
  • 马晴,何忠效,顾郁
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 71-76.
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    以高效表达的基因工程菌为材料,对以包涵体形式存在的目的产物——心钠素(ANF)融合蛋白进行了酶切及分离纯化.先用TritonX-100和低浓度尿素、盐酸胍洗涤,提高包涵体的纯度.再用高浓度的尿素处理,使蛋白变性溶解,脱氧胆酸钠对蛋白有明显的促溶作用.解决变性蛋白质去除变性剂时的聚合问题.在非变性条件下进行SephadexG-75凝胶过滤,FPLC系统纯化,得到目的融合蛋白.用凝血酶对融合蛋白作特异性切割,释放出ANF小肽,经FPLC分离鉴定,与标准ANF有相同的TR值,说明其纯度已达均一.生物活性检测表明:有明显的放免活性和舒张血管、利尿的生理活性
  • 张云,李文辉,高荣,熊郁良,王婉瑜
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 77-81.
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    蛇毒凝血酶样酶可作为蛋白酶结构与功能研究的良好模型,并已广泛用于各种血栓疾病的诊断和治疗,因而测定其一级结构具有重要意义.利用逆转录与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法,扩增出竹叶青蛇毒凝血酶样酶(TSV-TEL1)的cDNA;将扩增的cDNA片段克隆入pGEM-T载体中,经末端终止法测定核苷酸序列,推导出竹叶青蛇毒凝血酶样酶的全序列.竹叶青蛇毒凝血酶样酶由234个氨基酸组成并含有1个位于Asn20的N-型糖基结合位点.竹叶青蛇毒凝血酶样酶序列与其它蛇种来源凝血酶样酶具有较大相似性,其与黄绿烙铁头蛇毒凝血酶样酶序列相似度为84%,与美洲矛头蝮蛇毒凝血酶样酶序列相似度为68%,而与牛凝血酶B链序列相似度仅为25%.
  • 孙迎庆,曹淑桂,韩四平
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 82-86.
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    β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要组分之一,它不仅可水解纤维二糖和寡糖,更可解除纤维二糖对β-1,4-内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制,提高水解速率和程度.利用SephadexG-150和DEAE-SephadexA-50层析法从黑曲霉变异株L-22中分离提纯了β-葡萄糖苷酶,该酶是由两个分子量相同的亚基组成的二聚体,每个亚基分子量为203kD.该酶最适pH为4.8,pH稳定范围在3.6~6.4;最适温度是60℃,温度稳定范围为4~60℃;酶分子含糖量为8.35%.它是一个酸性β-葡萄糖苷水解酶,专一性地水解β-糖苷键.而不水解α-糖苷键,对短链底物表现了相对高的活力.用动力学分析和共价化学修饰方法探讨了与该酶活力有关的必需基团.由pH对lgVm和lgVm/Km的影响,推测出酶活性部位至少有两个可解离基团为酶活性所必需,它们在酶-底物复合物中的pKes1和pKes2的值分别为4.0和5.6,在游离酶中的pK值分别为4.2和5.9.由此可初步判断这两个可解离基团可能为组氨酸和含羧基的氨基酸,它们与酶的催化和底物结合可能有关.
  • 罗超权,陈汉奎,杨英浩,伍新尧
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 87-91.
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    探索具有高分辨率、高特异性和简捷快速的方法对HLA-DR基因分型,为临床器官移植配型和疾病相关性分析提供实用的方法和基础资料.利用DR1~DRw18序列特异性的19组引物及1对内参照引物进行PCR扩增即PCR-SSP对HLA-DR进行基因分型,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,在紫外光下观察分型结果.每个被检个体的DR型别可由特异引物扩增出现的电泳谱带直接判断.双盲检测22例的结果100%正确.在102例中国广东地区汉族人中,DR9和DR2的基因频率最高,分别为0.2205和0.1912,DR10为最低(0.0098).与用PCR-SSO方法分型获得的结果比较,基因型别分布基本一致,但一些等位基因的频率有差异,表明HLA-DR基因频率的分布在不同地区、不同种族的人群间存在着差异.PCR-SSP法分辨率和特异性虽不及PCR-SSO法但比血清学方法精细,分型的全过程只需2~4h能满足临床器官移植配型的要求.基因频率调查结果为器官移植配型和疾病相关性分析提供了基础资料.
  • 沈海铭,帖建科,张风文,李令媛,茹炳根
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 92-96.
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    通过皮下注射的方法诱导豚鼠产生金属硫蛋白(MT),研究了重金属元素(Cd)、微量元素(Cu,Zn)及有机试剂(CCl4,在体内可产生自由基)等因素的诱导与豚鼠肝脏中MT不同亚型的含量及金属结合状态的变化关系.实验结果表明,微量元素及有机试剂的诱导可使豚鼠肝脏中MT1的产量明显高于MT2,说明在体内MT1在参与微量元素的储存及清除自由基功能方面比MT2强.在重金属元素诱导下体内MT1对重金属元素的结合量远远大于MT2.表明MT1的重金属解毒能力比MT2强.上述实验结果与对不同亚型MT生物学功能差异的体外研究结果相吻合.此外,无论采用上述何种因素诱导,所得MT中均结合有Cu.对Cu在MT形成过程中的作用也进行了初步探讨.
  • 江松敏,吴国强,顾建新
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 97-102.
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    用荧光标记的受体底物(Gnβ1-2Mα1-6(Gnβ1-2Mα1-3)Mβ1-4Gnβ1-4(Fucα1-6)Gn-PA),结合高效液相层析(HPLC)建立了细胞β-1,4-半乳糖基转移酶的活性检测方法.研究了HL60细胞在体外低血清培养后不同的时间其酶活性的变化,发现12至24h酶活性达到一个高峰,为50.14pmol/min(106cel),此时细胞处在分裂间期,其它各测定时间变化不大.用PMA,RA等细胞诱导分化剂处理HL60细胞株时,发现其活性发生了较明显的变化,PMA诱导的细胞其酶活性在24h变化最大,升高到对照的1.32倍;而RA处理的细胞其酶活性在72h变化最大,升高到对照的2.15倍.
  • 阎力君,魏群
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 103-107.
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    为了研究在突触功能中起重要作用的磷蛋白状况,利用高分辩率的放射自显影、梯度电泳和双向电泳,以及抗CaN多克隆抗体封闭CaN磷酸酶活力等技术,并运用计算机图象处理系统,对大鼠大脑皮层突触体中磷蛋白生后发育变化进行定量分析.结果表明,大鼠出生后(PND)3d、7d、21d、和成年磷蛋白表达有很大不同,在出生后早期对应突触主要形成时期,磷蛋白呈高表达;从PND21d开始至成年,底物蛋白磷酸化状态逐渐降低,同时研究了突触主要形成时期有显著变化的钙调神经磷酸酶,它的内源底物及其在其生后发育所发生的变化.
  • 田学军,周爱儒,汤健,牛大地,俞文华
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 108-112.
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    血中同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)浓度的升高已成为动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子.为进一步阐明HCY促进血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecels,VSMCs)增殖,从而引起动脉粥样硬化发生的机理.本实验采用细胞计数、3H-TdR参入、细胞周期分析、Northern杂交方法证明,一定剂量的HCY可促进离体培养的WKY大鼠血管平滑肌细胞增殖,使其DNA合成增加,细胞周期中S期细胞所占比例增加43%,并促进c-myc与c-fos原癌基因mRNA表达增加.提示HCY可能通过促进VSMCs增殖而诱发动脉粥样硬化
  • 石法武,任洪波,张兆山,王会信,周廷冲
    中国生物化学与分子生物学报. 1998, 14(01): 113-116.
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    蛋白激酶C抑制剂staurosporine对HeLa细胞周期的影响石法武*任洪波张兆山**王会信周廷冲(军事医学科学院基础医学研究所,**生物工程研究所,北京100850TheefectofstaurosporineonthecelcycleofHe...