中国生物化学与分子生物学报

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王玉环,杨云,吴国利

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 1-6.

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小鼠肝在再生过程中,胞浆酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)活力比正常肝有明显升高,并且伴有时相变化,,手术后24—48h活力达到最高,而H22a细胞各组分的活力都比正常肝低。PTPP在正常肝细胞的溶酶体中分布最高;再生肝中则在细胞核、胞浆和微粒体中更集中;在H22a细胞中,PTPP的活力分布趋于平均化。再生肝和H22a细胞胞浆中都缺少正常肝的a、b两个PTPP活力峰,其它五个主要PTPP峰与正常肝无根本的差别。

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猪胰脏中胰岛素拮抗肽的分离纯化及其性质的初步研究

马建农,朱宝玲,戚正武

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 7-14.

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从猪胰脏的酸醇提取液中纯化了一个新的活性多肽——胰岛素拮抗肽,它在整体和细胞水平上对胰岛素都有明显的拮抗作用。猪胰脏的酸醇提取液经CM-52、BioGel P-6、DEAE-52及RP-HPLC纯化后,可得到纯的胰岛素拮抗肽。它能剂量相关地抑制胰岛素在离体大鼠脂肪细胞中的促脂合成活性,抑制50％胰岛素活性时所需的胰岛素拮抗肽为2.0×10~(-10)mol/L与被拮抗的胰岛素剂量在同一水平上。该肽含有较多的碱性氨基酸,分子量的3 000,其N-末端是封闭的。胰岛素拮抗肽的上述理化特征及其对胰岛素的拮抗活性均不同于目前已知的胰脏活性多肽。它对脂肪细胞中胰岛素的拮抗作用可能具有重要的生理意义。

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转化淋巴细胞胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶活性及细胞内源性底物的研究

杨诚,许秀珍,陈日新,潘忠诚,王殿鸿

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 15-20.

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本文对增殖期的淋巴细胞胰岛素依赖性酪氨酸蛋白激酶活性及内源性废物进行了分析研究。在纯化的健康人淋巴细胞中加入适量的植物血凝素(PHA),经过72h培养即成为转化淋巴细胞(增殖期淋巴细胞)。应用~(32)P参入实验,证实转化淋巴细胞胰岛素受体具有胰岛素依赖性的酪氨酸蛋白激酶活性,与未转化的对照组相比其活性增加约9倍。Scatchard分析表明转化后淋巴细胞膜表面胰岛素受体数增加3.5倍。应用抗酪氨酸磷酸酯抗体,对胰岛素作用前后的转化与未转化淋巴细胞内,酪氨酸残基磷酸化的蛋白进行了鉴定,结果表明:除了95kD受体β亚基自身磷酸化外,45kD蛋白质也明显磷酸化,我们命名它为PP45。我们认为PP45可能是淋巴细胞中胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶的主要内源性废物,它的磷酸化是胰岛素信息传递过程级联反应的初始步骤。

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四种中草药对大鼠半乳糖性白内障氧化还原物质及糖类含量的影响

杨涛,梁康,侯纬敏,张昌颖

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 21-25.

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对正常和半乳糖性白内障及给中草药的大鼠晶状体中某些吡啶核苷酸成分、糖类、非蛋白质巯基的含量进行了比较。结果表明,在白内障晶状体中,NADPH及非蛋白质巯基的含量明显低于正常晶状体的,而NADP、半乳糖及半乳糖醇的含量明显高于正常晶状体的;当注射半乳糖的同时分别用黄岑、石斛、菟丝子及玉蝴蝶四种中草药水煎剂灌胃,上述变化为基本恢复至正常晶状体的水平。表明四种中草药对晶状体中的异常生化变化具有阻止及纠正作用。

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双拷贝人α型心钠素基因的组建及大肠杆菌分泌型克隆与表达

周春燕,崔瑛琦,张丽霞,马康涛,王建平,曾桂超,张迺蘅,汤健,石松,王启松

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 26-32.

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将单拷贝人α心钠素基因3′端用Ban Ⅱ酶解除去包括终止密码在内的36个碱基对,代之以人工合成的含Glu-Lys-Phe-Glu连接片段与另一单拷贝人α心钠素基因的5′端串连成编码60肽的双拷贝心钠素基因,克隆于大肠杆菌分泌型表达载体pIN-Ⅲ-OmpA_2质粒中,表达生成60肽的双拷贝人α型心钠素衍生物,在信号肽的作用下分泌至胞膜间质并自动切割为60肽的外源基因产物。分子量约8K的表达产物用分子筛或超滤膜分离后再经HPLC纯化,表达产物具有明显的心钠素放免活性和舒张血管活性。

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大肠杆菌中高表达重组Era可溶性蛋白的纯化及其生化特性

陈苏民,DonaldL.Court

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 33-41.

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质粒pCE31含有在P_L起动子控制下的重组era基因,在大肠杆菌中、42℃诱导高表达出Era蛋白,经溶菌酶处理裂菌、沉淀离心洗涤后所得的纯Era是不溶的,生物活性也不高。改在40℃诱导2h,在Era底物GDP的存在下裂菌,60％以上的Era处于可溶状态。用蛋白酶抑制剂防止Era蛋白降解,经盐析、Q-SepharoseFF柱层析分离,获得可溶性纯Era蛋白。该蛋白能特异地与鸟苷酸结合、并具有GTP酶活性,表明Era是一种G蛋白。动力学定量分析结果:在4℃时,每分子Era肽链能结合一分子GTP或GDP,表明所纯化的Era蛋白几乎都具有活性;4℃下,Era蛋白与GTP或GDP结合的解离常数,分别为5.49和1.01μmol/L;37℃时,Era蛋白GTP酶的Km值为9.0μmol/L,催化GTP水解的最大速度为9.8mmolCTP/mol Era/min。

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大肠杆菌表达的重组白细胞介素-2的初步纯化

虞冠华,丁树标,许祥裕,施风霞,罗丽华,朱有华

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 42-46.

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本文对大肠杆菌表达产生的重组白细胞介素-2进行了纯化研究。通过比较两种方法制备的rIL-2包含体的纯度,发现用4mol/L脲溶解可溶性细菌蛋白后可使rIL-2包含体纯度达70％;在高浓度变性剂条件下进行凝胶过滤,解决了rIL-2易聚合的问题;结合透析,利用空气氧化形成高活性氧化型rIL-2;经SephadexG-100凝胶过滤,DEAE离子交换等步骤纯化,得到了均一性rIL-2,纯度达98％,比活达4.3×10~6u/mg蛋白,得率为30.8％。

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用蛋白质印迹转移技术分析正常及硒性白内障大鼠晶状体及房水中蛋白质的性质

夏凉,侯纬敏,张昌颖

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 47-53.

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本文用蛋白质印迹转移技术分析了正常及硒性白内障大鼠晶状体及房水中蛋白质的性质。结果表明,晶状体中的脲溶性蛋白质可被抗α及抗γ晶体蛋白血清识别,提示α及γ晶体蛋白均为脲溶性蛋白质的主要成份。患白内障时房水中的蛋白质含量明显增加,且主要被抗γ血清识别,而被抗α血清识别的成份很少,表明在大鼠硒性白内障形成过程中,有较多低分子量蛋白质漏出到房水中,且其主要成份为γ晶体蛋白。此外,我们还发现正常及硒性白内障大鼠晶状体膜蛋白质与抗α及抗γ血清起反应的程度及分布有所不同,提示晶状体细胞膜与晶体蛋白之间存在着相互作用。

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胎盘膜胰岛素受体结合活性与巯基和二硫键的关系

余宣传,李淑涟

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 54-60.

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部分纯化的人胎盘膜经DTT还原,NEM,DTNB修饰蛋白巯基后,改变了胰岛素受体的结合活性。Scatchard分析表明,当DTT浓度较低时,亲和常数基本不变;高亲和位点数略微升高,较高浓度的DTT处理时,结合位点数和亲和常数均有所下降。DTT还原膜蛋白二硫键后再用NEM,DTNB修饰巯基,胰岛素结合活性进一步下降。NEM或DTNB单独处理结合活性下降较少。胰岛素与受体结合后,用DTT洗后剩余的结合胰岛素比缓冲液洗低,表明有一部分胰岛素以二硫键与受体共价结合。在0—5mmol/L浓度范围内,随着DTT处理浓度的升高,这种以二硫键共价结合胰岛素增加。

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小鼠颌下腺表皮生长因子的分离、纯化与鉴定

赵明,王会信,邸宝成,麻海燕,周廷冲

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 61-66.

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雄性成年小鼠颌下腺醋酸提取物经Bio-Gel p-10凝胶层析可得七个色谱峰,经放射受体结合及放射免疫分析后,证实第七峰的EGF比活性最高。收集该组分,再经Sephadex G-10层析及DEAE-52离子交换层析,可得纯化的EGF样品。SDS-PAGE证明样品的分子量为6 000。RRA,RIA结果表明,样品与标准mEGF具有相同的受体结合活性及抗原性。生物学研究证明样品可以促进新生鼠睁眼和萌牙,刺激成纤维细胞DNA的生物合成。

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自旋标记钙调蛋白与酸枣仁皂甙A相互作用研究

李原,周玉祥,区耀华,周昕

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 67-72.

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中草药有效成份酸枣仁皂甙A是钙调蛋白CaM的一种天然非竞争性拮抗剂。利用氮氧自由基马来酰亚胺衍生物标记CaM研究了二者的相互作用。结果表明,每分子CaM至少可以结合二个分子的酸枣仁皂钙A,二者的作用影响CaM上Lys残基主要是75,94)的环境,推测酸枣仁皂钙A是通过疏水作用结合到CaM分子两端的疏水沟区。通过比较三氟拉嗪TFP与酸枣仁皂甙A的结构特点,抑制性质与结合位点,提出了CaM调节环核苷酸磷酸二酯酶PDE的模式。

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氨甲喋呤-人血清白蛋白-单抗79结合物在动物体内的组织分布及其稳定性的研究

刘晓坤,殷惠君,沈倍奋

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 73-80.

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本研究比较了~(125)标记的氨甲喋呤-人血清白蛋白-单抗79(MTX-HSA-McAb79)和氨甲喋呤-人血清白蛋白(MTX-HSA)两种结合物的血浓度及在肝、脾、肾等重要脏器的组织分布。发现前者的生物利用度大、血的清除率低、且肝脏等重要代谢器官对它的摄取也低。在MTX-HSA-McAb79结合物的稳定性研究中,首先采用纸层析法及荧光分光光度法分别证明结合物中酰胺键在体内外均具有良好的稳定性;其次采用SDS-PAGE结合放射自显影术,再通过薄层扫描定量,研究了结合物中二硫键的稳定程度。结果表明:二硫键相当不稳定,腹腔注射后1h即有60.5％的二硫键断裂,24h则高达92.9％。r-扫描显示MTX-HSA-McAb79在肿瘤部位的浓集不理想,这与二硫键稳定性试验的结果是一致的。探索新的交联剂和交联方法,增加结合物在体内的稳定性将是今后的目标之一。

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尿嘧啶对单胺氧化酶的抑制作用

陈晓光,王本祥,张洁,张宏

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 81-85.

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给青年小鼠(1月龄)po尿嘧啶25—800mg/kg对脑和肝MAO-B活性抑制作用与剂量成明显量-效关系,而对MAO-A抑制较弱。多次po尿嘧啶300mg/kg对老年小鼠(18月龄)脑MAO活性抑制作用明显强于对青年小鼠,并能增加老年小鼠脑组织5-HT和DA含量。另外,随年龄增加,小鼠血、脑和肝组织MAO活性显著升高,而上述组织中尿嘧啶含量则明显降低。体外实经证明,尿嘧啶对MAO-B活性抑制程度明显强子对MAO-A,并且对MAO-B为竞争性抑制,对MAO-A为混合型抑制。

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马兜铃酸与钙调素相互作用的荧光光谱分析——一种非钙离子依赖性钙调素拮抗剂的研究

徐立,黄树模

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 86-92.

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本文报道我室近来发现的一种天然钙调素(Calmodulin,CaM)拮抗剂马兜铃酸(Aristolochic acid,ATA)的研究。利用丹磺酰标记的CaM(D-CaM)对马兜铃酸的研究表明,马兜铃酸是一种非钙离子依赖性钙调素拮抗剂,实验测得马兜铃酸与D-CaM结合的解离常数,有Ca~(2+)和无Ca~(2+)情况下分别为70μmol/L、77μmol/L。两种状况下马兜铃酸对D-CaM荧光强度的抑制分别为40％、41％。暗示马兜铃酸主要作用于CaM上Ca~(2+)诱导的疏水区之外。三氟啦嗪(TFP)引起的D-CaM荧光增强可被马兜铃酸明显降低,而TFP在达到马兜铃酸浓度的15倍以上仍未能逆转马兜铃酸对D-CaM荧光强度的降低作用,这为马兜铃酸主要作用于CaM上Ca~(2+)诱导的疏水区以外提供了又一佐证。

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岩豆(Millettia dielsiana Harms ex Diels)凝集素的分离纯化和性质研究

曾仲奎,郑建,刘荣华

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 93-98.

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用猪甲状腺球蛋白-Sepharose 4B作亲和吸附剂,再经Sephadex G-100凝胶过滤,可以从岩豆种子中纯化出岩豆凝集素(MDL)。该凝集素可以凝集人类A、B、O型血细胞和兔红细胞,纯化的MDL凝集兔红细胞的能力可被D-松三糖、邻硝基-苯酚-D-半乳糖和N-乙酰半乳糖胺抑制,甘露糖也有弱的抑制作用。纯化的MDL在PAGE和SDS-PAGE上均显现单一蛋白质染色带,经Schiff’s试剂染色证明为糖蛋白;以酚-硫酸法测得其中性糖含量为6.0％;SDS-PAGE测得亚基分子量为32 000;Sephadex G-100分子筛柱测得其分子量为63 800;等电聚焦电泳显示其等电点为5.1;氨基酸组成分析表明其中Asp、Glu、Phe含量较高,但不含有Pro、Tyr。MDL也是一个强促有丝分裂原,对人外周血淋巴细胞转化率可达81.2％,细胞分裂比率达14.8％。

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中国海南岛人恶性疟原虫基因文库的构建及环子孢子蛋白基因的筛选

钟伟民,强伯勤,陈菊凤,樊汝恭,刘尔翔

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 99-104.

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本文介绍了以噬菌体λEMBL3为载体的中国海南岛人恶性疟原虫FCC1/HN分离株基因文库的构建。所得重组体的数目为3.3×10~4pfu,其相当于构建完整基因库理论计算值的6倍。作者以人工合成的巴西株恶性疟环子孢子蛋白基因重复序列区的24-mer寡核苷酸(AATGCAAACCCAAATGCAAACCCA)作探针,进行噬斑原位杂交,筛得三株阳性克隆。对其一重组体进行酶谱分析和Southern印迹实验,环子孢子蛋白基因被定位于HindⅢ和BamHI联合降解后所得的的4kb大小的片段上。

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兔肝细胞色素b5在大肠杆菌中的表达

王黎明,AlanW.Steggles

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 105-109.

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利用体外特定点突变技术,将原核生物核糖体结合位点及十碱基间隔子(spacer)引科兔肝经胞色素b_5 cDNA的5′端,并构建了一个兔红血球b_5cDNA克隆,重组入表达载体pKK223-3质粒中,在大肠杆菌中成功地表达了兔肝和红血球两种形式的b_5蛋白。产量分别为每毫升培养液1.5μg和4.5μg。

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固相RNasin亲和层析RNase

刘承勋,娄艳春,刘望夷

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 110-114.

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大鼠肝RNasin与溴化氰活化的Sepharose 4B反应制备了固相大鼠肝RNasin。用固相大鼠肝RNasin亲和层析大鼠肝中性RNase,可以将其分为两部分。固相大鼠肝RNasin可以亲和层析牛胰RNase的结果说明,牛胰和大鼠肝RNase在二级和三级结构上都非常相似。这为大鼠肝RNase来源于胰脏的观点提供了一个新证据。固相RNasin可以亲和吸附大肠杆菌RNase说明原核细胞RNase与真核细胞RNase在分子起源方面有一定的亲缘关系。固相RNasin柱层析为纯化RNase提供了一个简便的新方法。

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人参多肽基因的酶法体外随机——定位诱变

张今,李正强,张红缨

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 115-120.

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本文报道了酶法体外随机——定位诱变人参多肽基因的原理和方法。该法把传统的随机诱变和现代的定位诱变融合起来,可灵活控制基因突变的随机性和定位性。我们用双脱氧末端终止法测定了三个突变株的结果证实了该法的合理性和可行性,

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哺乳类(兔)红细胞分化因子的纯化及特性分析

费仁仁,孙诠,戴巾,朱斌,马跃,王鑫,周雪峰,王瑞瑜,薛社普

中国生物化学与分子生物学报. 1992, 8(01): 121-128.

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本文报道从哺乳动物(兔)红细胞分离、提纯红细胞分化因子(ErythroidDifferentiation Factor,简称EDF及对其性质的分析。按Bishop方法给新西兰兔注射盐酸苯肼(2.5％)0.3mL/kg体重/日连续6days致贫血,收集血液用生理盐水洗去白细胞后,得到的网织红细胞用冻融法使细胞裂解,用乙醇、氯仿选择性变性除去血红蛋白,凝胶过滤,连续经DEAE-纤维素及CM-纤维素柱层析,取得较原裂解液纯化了31 000倍的活性物质EDF,产率为9.1％,分子量15kD,在SDS-PAGE电泳图中为单一蛋白带。EDF对热相对稳定,100℃处理10min仍保持一定活性,对蛋白酶敏咸而对DNA酶I及RNA酶不敏感。EDF对体外培养细胞的生长抑制作用已在体外实验体系得到验证。

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