中国生物化学与分子生物学报-栏目: 研究论文

磺胺间二甲氧嘧啶纳米抗体免疫磁珠的制备及其鉴定

程小容, 赵琳, 王迪, 王雅婷, 杨雅匀, 古少鹏, 何金鑫 — 2024-02-27 00:00:00.0

基于纳米抗体(nanobody,Nb)和磁小体(bacterial magnetic particles,BMPs)的免疫磁珠在污染物分离分析中具有良好的应用前景,然而,不同长度柔性连接肽(linker)对免疫磁珠性能的影响尚未见相关报道。为了探究柔性连接肽长度对免疫磁珠的性能影响,本研究使用pET-28a作为载体,在磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine,SDM)Nb基因上融合了不同长度的柔性连接肽,分别为pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys和pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys,并使用大肠杆菌BL21(DE3)作为重组工程菌进行表达,最终获得Nb-(G4S)1-Cys和Nb-(G4S)4-Cys重组蛋白质。利用异源双功能试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP),分别将重组蛋白质与BMPs进行偶联,构建了免疫磁珠。利用免疫印迹对偶联结果进行了初步鉴定,并对偶联条件进行了优化。同时,使用透射电镜和Zeta电位分析仪对免疫磁珠的水合粒径、Zeta电位和分散性进行了分析。研究结果表明,SPDP能有效地将Nb-(G4S)1-Cys和Nb-(G4S)4-Cys定向固定在BMPs表面。通过差值法计算发现,Nb-(G4S)1-Cys与BMPs的偶联效率高于Nb-(G4S)4-Cys与BMPs的偶联效率。进一步表征结果显示,BMP-(G4S)1-Nb的Zeta电位绝对值更高,水合粒径更小,并且具有较低的多分散性指数,说明其在水相体系中具有更强的胶体稳定性。综上所述,利用BMPs和Nb-(G4S)1-Cys构建的免疫磁珠性能优于BMPs和Nb-(G4S)4-Cys构建的免疫磁珠。这为今后选择合适长度的连接肽构建高效的免疫磁珠分离分析SDM提供了理论依据。

富马酸二甲酯通过Nrf2/HO-1信号通路缓解细颗粒物对雌性大鼠胎盘的氧化损伤

李江珂, 董恩恒, 张丰泉, 张俊强, 伍源 — 2024-02-27 00:00:00.0

近年来,已有大量的流行病学调查证实,孕产妇暴露于PM_2.5可能导致妊娠并发症和不良妊娠结局的风险增加。本研究旨在探讨孕前PM_2.5暴露对大鼠胎盘的损伤及富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)对其调控机制。40只6周龄SPF级雌性SD大鼠,随机分为对照组(生理盐水)、低剂量PM_2.5组(1.5 mg/kg PM_2.5)、高剂量PM_2.5组(7.5 mg/kg PM_2.5)、DMF对照组(生理盐水+50 mg/kg DMF)和DMF干预组(7.5 mg/kg PM_2.5＋50 mg/kg DMF)。大鼠每 2 d染毒1次,共持续40 d。经PM_2.5暴露后,高剂量PM_2.5组胎鼠数量、胎鼠平均体长、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)、白细胞介素-10(IL-10)含量明显低于对照组(P＜0.05);丙二醛(MDA)含量高于对照组(P＜0.05);经DMF处理后,DMF干预组的T-AOC含量显著高于高剂量PM_2.5组(P＜0.01),能够明显缓解PM_2.5诱导的氧化损伤作用。H&E染色结果显示,暴露组胎盘组织迷路区血细胞有不同程度的减少,高剂量PM_2.5组血管脉络不清晰,DMF干预组胎盘迷路区的血细胞明显增多,血管脉络清晰整齐。Western印迹结果显示,低剂量PM_2.5组和高剂量PM_2.5组核因子E2相关因子(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)蛋白质水平低于对照组(P＜0.01),与高剂量PM_2.5组相比,DMF干预组的Nrf2、HO-1蛋白质含量明显增高(P＜0.05)。综上所述,DMF可能通过Nrf2/HO-1信号通路缓解孕前PM_2.5对胎盘造成的氧化损伤,提高机体的抗氧化能力。

TNF-α和VEGF协同作用小鼠胚胎干细胞衍生的血管内皮祖细胞促伤口愈合

杨影, 陈东升, 赵艾艾, 何才蓉, 陈凤娇, 何运雪, 郑梅, 陆莹, 丁洁 — 2024-02-27 00:00:00.0

皮肤伤口愈合是世界范围内的重大临床难题之一,血管生成和炎症反应是影响伤口愈合和组织再生的关键环节。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)在血管内皮修复和招募炎症细胞促伤口愈合过程中发挥重要作用。然而,体内直接输送EPC低效且会损害细胞存活力和功能进而影响治愈效率。因此,改善EPC的生物学功能以促进伤口愈合很有必要。本研究将小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESC)在10 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF的作用下诱导获得CD133⁺CD34⁺EPC。以mESC衍生的EPC为研究对象,将外源性肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor- α, TNF-α)和血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)作用于mESC-EPC,结果表明,10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF协同处理组相比于单因子处理显著促进EPC的黏附、细胞迁移和管腔形成能力(P < 0.01)。进一步通过建立小鼠局部皮肤全层创伤模型,在创周处注射10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF协同EPC治疗明显加速伤口愈合(P < 0.05),再生皮肤真皮层增厚(P < 0.001),促进血管生成素ANG1和ANG2介导CD31⁺内皮细胞构成的毛细血管网络成熟。随着伤口愈合程度的加深,促炎因子TNF-α在蛋白质水平的表达下调(术后13 d,PBS组、EPC组、VE组、TE组和VTE组的TNF-α相对表达量分别为0.73± 0.01、0.60 ± 0.02、0.42 ± 0.02 、0.36 ± 0.01和0.34 ± 0.03),创造有利于伤口愈合的炎症微环境。综上所述,10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF的协同作用强化EPC的生物学功能,并通过促进新血管生成和早期炎症反应加速小鼠皮肤伤口闭合和组织重塑,为细胞干预伤口愈合治疗提出新的思路。

沙蚕蛋白酶高效降解变异新冠病毒S蛋白作用与S蛋白的生化特性分析

阚慕洁, 白若伦, 刘智奇, 白宇, 王少华, 刘剑凯, 洪敏 — 2024-02-27 00:00:00.0

从今年3月起,WHO不再将新冠病毒感染,列为全球关注的灾害性卫生事件,但是新感染病例依然存在,其原因与病毒基因组经常突变,引起特异抗体失效和免疫逃逸有关,同时特异性治疗药物依然有限。病毒S蛋白是病毒感染宿主细胞的关键结构,S蛋白质突变,导致其结构生化特征和功能等随之变化。我们曾分析了世卫组织(WHO)认定的野生型和5种关切变异毒株的生化特征,并研究证实了日本刺沙蚕碱性丝氨酸蛋白酶(ASP_NJ)可以高效与相对特异地降解野生型病毒S蛋白。本文分析了Omicron 变异毒株(BA.2、BF.7、XBB.1)S蛋白质与ASP_NJ相关的生物化学特征,并经SDS-PAGE分析,直观证实了ASP_NJ可以高效降解这些S蛋白质,但变异株S蛋白抵抗ASP_NJ消化能力更强一些。本文还报告了ASP_NJ对野生型假病毒的影响,初步结果显示,ASP_NJ可能具有减少野生型假病毒感染293T-CAE2受体细胞的作用。这些结果表明,ASP_NJ有可能成为一种新工具酶,用于研究新冠病毒的结构与功能。

miR-485-5p靶向氧连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭

胡东来, 赵梓岐, 李元, 杨丽, 雷艳丽, 楚元奎 — 2024-02-27 00:00:00.0

前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤。尽管采用雄激素剥夺疗法等策略在一定程度上对治疗前列腺癌有效,但大多数患者最终会进展为临床尚无有效治疗手段的去势抵抗性前列腺癌。因此,寻找新的更加有效的前列腺癌治疗靶点就显得尤为关键。多项研究表明,微RNA(microRNAs,miRNAs)的异常表达与肿瘤的发生相关。已有报道显示,miRNA-485-5p(miR-485-5p)在多种肿瘤中发挥抑癌作用,但其在前列腺癌中的作用在较大程度上仍未可知。本研究旨在探究miR-485-5p在前列腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的作用与机制。生物信息学预测和qRT-PCR检测发现,miR-485-5p在前列腺癌中表达下调。平板克隆形成实验、Transwell实验和划痕愈合实验证明,转染miR-485-5p模拟物显著抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭。生物信息学预测、双荧光素酶报告法、Western 印迹和qRT-PCR检测证实,氧连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase, OGT)是miR-485-5p的一个下游直接靶标。进一步的分析和检测显示,OGT在前列腺癌中呈高表达,转染OGT的siRNA能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭,同时有效逆转转染miR-485-5p抑制物所发挥的促癌作用。综上所述,miR-485-5p可以通过负向调控OGT进而抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭。本研究结果有助于进一步阐释miR-485-5p在前列腺癌中发生发展的作用和机制,可为寻找前列腺癌的治疗靶点提供实验依据。